İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Son yıllarda, merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları ve oto-bağışıklık biçimleri tanımlanmıştır. Bu hastalıklar ve ilişkili otoantikorlann mevcudiyeti ile tanımlanır olduğu gösterilmiştir. Bu antikorlar ya da reseptörleri nöronal sinir iletimini ^1,2 dahil sinaptik proteinlere bağlanır. Farklı antijenler, örneğin N-metil-D-aspartat reseptör (NMDAR) ^3-5, γ-aminobütirik asit reseptör B (GABA _B) ⁶ reseptörü, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-olarak tespit edilmiştir izoksazolepropiyonik asit (AMPA) reseptörü ^7, voltaj kapılı potasyum kanal (VGKC) bağlı proteinler: lösin açısından zengin glioma-aktive protein 1 (LGL-1) ve kontaktin-ilişkili protein 2 (capsr2) ^8,9, glutamat reseptörü ^5,10 ve dopamin-2 reseptörü (D2R) ^11. Geçmişte, (çoğunlukla ensefalit olarak da bilinir), bu otoimmün CNS bozuklukları sıklıkla teşhis ve tedavi edilmemiştir. Bu yeni biyolojik antikor, örnNMDAR antikor veya D2R antikor, esasen tanı ve farkındalık düzeldi, ve hastalar için tedavi seçenekleri açtı. Gerçekten de, bağışıklık ile erken tedavi geliştirilmiş sonuç ^11,12 ile ilişkilidir.

, Örneğin enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) ve western blot gibi antikorları tespit etmek için geleneksel yöntemler serumunda antikorların saptanması için kullanılmıştır. Ancak, hali hazırda hücre-dışı ya da yüzey epitoplarının tanınması olanak değildir ve, bunun yerine, bir hücre içi epitopuna karşı immunoreaktivitesini ortaya çıkarabilir. Ayrıca, sinir katılan önemli proteinlerin hücre dışı alanına bağlanan antikorlar, patojenik ^2,3,7,13,14 olması muhtemeldir. Bu nedenle, ilgili hücre yüzey ya da hücre-dışı hastalarda antikor hedefleri keşfetmek için doğru ve hassas analizlerin geliştirilmesi önemlidir. Alanındaki altın standart yöntem olarak adlandırılan, "hücre-ba olarak, canlı hücrelerin kullanımına dayanmaktadırsed deneyleri ". Bu yöntem, memeli hücrelerinin ilgilenilen antijenin tam cDNA dizisini ihtiva eden vektörler transfeksiyonu ile kendi doğal biçiminde (en çok insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücre) yüzeyinde bir antijenin ekspresyonunu içerir. Geçirgen hale getirilmemiş canlı hücreler daha sonra, seyreltilmiş hasta serumu ile inkübe edildi ve florokrom-eşlenik anti-insan immünoglobülin (Ig) sekonder antikoru ile takip edilmektedir. Floresans yoğunluğu veya seviyesi, daha sonra tespit edilir ve bağlayıcı otoantikor seviyesine ilişkilidir. Tek bir antijen hücrelerinde aşırı eksprese olduğu gibi bu teknik, özgüdür. En çok "Okuması" kullanılmış immünsitokimya ^4,5,8-10 sonra konfokal mikroskopi analizi olmuştur. Bununla birlikte, hücre bazlı deneylerde akış sitometrisi başarılı demiyelinizan hastalıklar ^15-17 olan hastalarda antikorları tespit etmek için kullanılmıştır. Özellikle, Waters vd. ^15, bir tava ile bir antikorun saptanmasını karşılaştırıldığındaHücre bazlı mikroskobu ile takip deneylerinde ya da dahil olmak üzere, akış antikor algılama teknikleri el sitometri analizleri ve en hassas, doğru ve güvenilir bir yöntem olarak hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi göstermiştir. Bu araştırmacı bağımlı, kantitatif değildir ve radyoaktif malzemenin herhangi bir şekilde kullanılması anlamına gelmez Bu nedenle, hücre bazlı bir deneyde sitometri akışı avantajlıdır. Bu büyük hasta tabur kısa bir miktarda tahlil edilecek verir gibi de uygundur.

Daha yakın zamanlarda, otoimmun CNS hastalıkları olan hastalarda ¹¹ NMDAR antikor ve D2R antikoru belirlemek için hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akış optimize ettik. Bizim grubu son hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi kullanılarak hasta serumunda NMDAR antikor tespit edildi. Bu NMDAR antikoru pozitif serumlar daha önce konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edildi ve ¹¹ pozitif olduğu bulunmuştur. Bu protokol, c tespiti için hücre bazlı bir deneyde bir akış sitometri özetlenmektedirotomatik yüksek verimli örneği kullanan hasta serumunda onformation duyarlı CNS antikor.

1.. Strateji pIRES2-EGFP Vektör Kodlama D2R veya NMDAR Construct altklonlamıştır

1. İnsan D2R veya NMDAR alt biriminin 1 (NR1) tam uzunluktaki cDNA klonunu elde edilir.
2. Böyle bir durumda birlikte tanımlanması antijenleri ve GFP hem de mümkün kılan bir gelişmiş yeşil floresan protein, bir iç ribozom giriş sahası (IRES) kontrolü altında (GFP) raportör ile transmembran proteinlerin ekspresyonu için uygun olan pIRES2-EGFP gibi bir ifade vektörü, seç ayrı ayrı hücreler.
3. PIRES2-EGFP vektörü içinde insan cDNA alt-klonlanmıştır.
   1. , CDNA alt klonlamak, uygun kısıtlama enzimleri kullanmak için (insan D2R cDNA örneğin Nhel ve Xhol için).
   2. Ligatı kesilmiş cDNA kısıtlı pIRES2-EGFP vektörü içinde yerleştirin.
   3. Dizisi vektör doğru sırasını içerip içermediğini kontrol etmek pIRES2-EGFP D2R veya NMDAR vektörü bağlandı.
   4. Arındırmak ve transfeksiyon daha sonra kullanmak için pIRES2-EGFP D2R veya NMDAR vektörün yükseltilmesi.

1. Taze Dulbecco Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) 4.5 g / L D-glikoz, L-glutamin ve 110 mg,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş / L sodyum piruvat ile birlikte ile doku kültürü şişelerinde Kültür HEK293 hücreleri, 2 mM GlutaMAX ve 50 ug / ml Gentamisin.
2. Tripsin ve transferi bir konik tüp kullanılarak HEK293 hücreleri ayırın.
   1. 6 dakika boyunca 250 xg'de hücreler santrifüj ile yıkayın ve taze bitmiş DMEM içinde bir hücre pelletini.
3. Yaklaşık 8 x 10 ⁵ hücre / göz ve kültür, gece boyunca 2 ml DMEM içinde 37 ° C de ve% 5, bir kuluçka makinesi içinde _CO2 de hücreleri ve tohum 6 kuyucuğu sayılır.
4. Bu yaklaşık% 70 ortak akışkanlığa eriştiklerinde sonra, pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 ^{NMDAR +} hücreleri), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 ^{D2R +} hücreleri) ile HEK293 hücreleri transfekte etmek, ve pIRES2-EGFP (HEK293 ^CTL hücreleri vektör kontrolü) aşağıdaki gibi.Sonra tazminat için bazı untransfected HEK293 hücreleri tutun.
   1. 2.5 ug DNA, 200 ul% 0.9 sodyum klorür ve 4 ug / ml polietilenimin / oyuk (her biri 2 ml taze tam DMEM içeren) içeren bir transfeksiyon karışımı gerekli hacmi hazırlayın.
   2. Hemen 10 saniye boyunca girdap karışımı ve uygun oyuklara transfeksiyon karışımı hacmi ilave edilmeden önce, 10 dakika süre ile oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir.
   3. , Kapak plakası Parafilm ile yanlarını doğal olarak kaplayan ve hücre transfeksiyonu yardımcı olmak için 5 dakika boyunca 280 x g 'de santrifüj.
   4. Parafilm çıkarın ve sonra 37 ° C de kültüre inkübatöre koyun
   5. Taze tam DMEM ile 18 saat sonra kültür ortamı değiştirin ve başka bir 72 saat boyunca kültür korumak.
   6. İsteğe bağlı: 72 saat post-transfeksiyon, transfekte edilmiş hücreler, poliklonal stabil transfektan elde etmek amacıyla, 250 ug / ml Genetisin ile desteklenmiş tam DMEM içinde kültür tarafından seçilebilir.

Canlı HEK293 D2R + ve HEK293 hücreleri, CTL yüksek verimli bir örneği kullanarak akış sitometresi ile elde edildi. Analiz sırasında, hücreler ileri dağılım (boyut) ve yan dağılım (granülaritesi) parametreleri (Şekil 1A ve 1B) dayalı kapılı edilmiştir. Transfekte edilmiş HEK293 hücreleri sitoplazmasında raportör molekülü, GFP ifade ve transfekte edilmemiş hücrelerin analizi (Şekil 1 B ve 1 E) alınmadı. GFP + kapısı içinde, AF647 konjuge edilmiş anti-insan IgG ikincil antikoru bağlama ile ilişkili MFI (Şekil 1C ve 1F) ölçülmüştür. Insan serasını analiz ederken, arka plan floresan ortadan kaldırmak için, ΔMFI HEK293 D2R + hücrelerinin MFI (Şekil 1G) için HEK293 CTL hücrelerinin MFI çıkarılarak hesaplandı. Gösterilen veriler D2R antikor analizi için temsili veAynı yolluk stratejisi ve veri analizi NMDAR antikor tespiti (veriler gösterilmemiştir) için kullanılabilir.

Hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi ile antikor tespiti, ilgi alanındaki antijene hücre yüzeyi ekspresyonu dayanmaktadır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, HEK293 hücreleri, CTL bu antijenlerin de (Şekil 2A ve 2B) olarak ifade edilmiştir, oysa, HEK293 NMDAR + hücreleri, yüksek yüzey NMDAR (Şekil 2A) olarak ifade edilmiştir ve HEK293 D2R + hücreleri, yüksek yüzey D2R (Şekil 2B) olarak ifade edilmiştir.

Bu çalışmada kullanılan hasta grupları NMDAR ensefalit olan bir hasta grubu oluşuyordu (NMDAR Enc, n = 4, yüzey NMDAR-1 alt biriminin saptanması NR1-3 antikor ile tanımlanan bir ensefalit), D2R antikor ile ilişkili ensefalit (D2R Enc, n = 6, yüzey D2R 11 antikorunun tespiti ile tanımlanan bir ensefalit) ve bir kontrol kohort wiepilepsi, inme ve gelişimsel ya da nörodejeneratif bozukluklar gibi th diğer enflamatuar olmayan nörolojik hastalıklar (OND, n = 26). Hasta numuneleri önceden NMDAR 5 ve D2R 11 IgG pozitifliği için valide edilmiştir. NMDAR antikorları için pozitif hasta 3, tarif edilen ve serum örnekleri tarif edilen ve ticari olarak temin edilebilen 3,4-NMDAR antikorlar için hücreye dayalı tahliller kullanılarak pozitif kanıtlanmış olduğu gibi NMDAR ensefalit tipik bir klinik sendrom vardı. D2R antikorları için pozitif hasta 11 anlatıldığı gibi bazal ganglion ensefalit tipik bir klinik sendrom vardı, ve serum numuneleri D2R knock-out beyin bölümleri, transfekte hücreleri ve nöronlar 11 kullanılarak D2R antikorların pozitif kanıtlandı.

Hastalarda antikor pozitif belirlemek amacıyla, antikor pozitif eşik ya da kesme, yukarıdaki üç standart sapma eklenerek her deneyde hesaplandıOND kontrollerin ΔMFI demek. D2R Enc ile: 6/6 hasta insan yüzey D2R IgG antikoru (Şekil 3B) için pozitif oysa NMDAR Enç ile 4/4 hasta, insan yüzey NMDAR IgG antikoru (Şekil 3A) için pozitif teyit edilmiştir. Pozitif hastaların hiçbirinde NMDAR ve D2R hedefleyen antikorlar için çift pozitif idi. NMDAR ve D2R antikorların analiz OND kontrol hiçbirinde tespit edilmedi (Şekil 3A ve 3B). Üç tekrarlanan deneyler üzerinden en az iki eşik değerin üzerinde olsaydı hasta numune pozitif kabul edildi.

Şekil 1. Hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akışı ile antikor tespiti:. Strateji ve veri analizi yolluk Liv E HEK293 CTL hücreleri ve HEK 293 D2R + kararlı transfektanları ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) (, A, D, sırasıyla% 74.7 ve% 68.5) dayalı kapılı edilmiştir. HEK293 KVK ve HEK293 D2R + hücreler (sırasıyla% 32.8 ve% 95.4; B, E) içinde GFP pozitif hücreler - hücreler (, B, E sırasıyla% 67.2 ve% 4.6) daha untransfected GFP dışlamak için Geçitli edildi. GFP + hücreleri içinde AF647 konjuge edilmiş anti-insan IgG ikincil antikoru ile ilişkili ortalama floresan yoğunluğu (MFI) (= 3.657 HEK293 CTL; HEK293 D2R + = 9128) (C, F) ölçülmüştür. İnsan numuneler için, ΔMFI HEK293 D2R + hücreleri (G) 'den HEK293 CTL hücrelerinin MFI çıkarılarak hesaplandı. D2R antikor tespiti temsili veriler gösterilir. ank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. Hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akış ile belirlenen yüzey NMDAR ve D2R sentezlenmesi. HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B) ve HEK293 CTL hücreleri uygun bir ikincil antikor, ardından birincil antikor seri seyreltileri ile boyandı. NMDAR ve D2R yüksek yüzey ifadesi gözlendi. Bu birincil antikor artan konsantrasyonları ile artmıştır olarak MFI değerleri antikor titresi ile korelasyon göstermiştir. Beklendiği gibi, HEK293 CTL hücrelerinde yüzey NMDAR veya D2R hiçbir tespiti vardı. Örnek verileri gösterilir.boş "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,. Hastaların. NMDAR ensefalit Sera (NMDAR Enç, n = 4), diğer nörolojik hastalıklar, D2R antikor ilişkili ensefalit (D2R Enç, n = 6) hasta, ya da kontroller (OND bir kohort yüzey NMDAR ve D2R antikorların tespiti Onaylandı , n = 26 ya da 24), canlı HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + ve CTL HEK293 hücreleri ile kuluçkalanmıştır AF647-konjüge edilmiş anti-insan IgG ikincil antikoru ile takip edildi. OND kontrol (0/26 ve 0/24) ya da yok oldu ise yüzey NMDAR ve D2R antikorlar, 4/4 NMDAR Enc hastaya (A) ve sırasıyla 6/6 D2R Enc hastada (B), serumunda tespit edilmiştir antikoru (A, B). Dottegrafikler d çizgi OND kontrollerin ortalama ΔMFI üç standart sapma eklenerek hesaplanan pozitiflik eşiği temsil eder. Üç deneyler üzerinden temsili nokta araziler gösterilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Çıkar çatışması: Bir patent otoantikorlar için hedef olarak D2R iddia FB ve RCD (Sydney Üniversitesi) tarafından dava açılmıştır.