Son yıllarda, canlı hücre bazlı deneyler, yüzey ve şekilsel antijenlere karşı antikorlar tespit etmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada, hastaların büyük kuşaklarının analiz sağlayarak sitometri yüksek verimli akışını kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Yeni antikorların tespiti immün aracılı bozuklukların tanı ve tedavi artıracaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde
Bu makalede
Özet
Özet
Son yıllarda, yüzey ve sinir iletimi ile ilgili yapısal proteinlerine karşı olan antikorlar, çocuklar ve yetişkinler için CNS otoimmün hastalıklarda tespit edilmiştir. Bu antikorlar tanı ve tedaviye yol kullanılmıştır. Hücre bazlı deneyler hasta serum içinde antikorların saptanmasını iyileştirilmiştir. Daha sonra florokrom-konjuge sekonder antikor ile, ardından seyreltilmiş hasta serası ile inkübe edilir, ökaryotik hücreler üzerinde beyin antijenlerin, yüzey ekspresyonu dayanmaktadır. Yıkama işleminden sonra, bağlayıcı ikinci antikor daha sonra akış sitometrisi ile analiz edilir. Bizim grup güvenilir bir şekilde belirli bir nörotransmiter reseptörlerine karşı antikorlar tespit etmek için, canlı hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akış geliştirmiştir. Bu akış sitometri yöntemi yalındır, kantitatif, verimli ve geniş hasta kohortlarının kolayca zaman kısa bir alanda test edilmesi için yüksek verimli bir örnekleyici sistemi kullanma imkanı sağlar. Ayrıca, bu gibi hücre bazlıki kolayca merkezi sinir sistemi ve çevre hem de birçok farklı antijenik hedeflere antikorları tespit etmek için adapte edilebilir. Ilave yeni antikor biomarkerlerin Keşfi hızlı ve doğru tanı sağlamak ve bağışıklık aracılı bozuklukların tedavisini artıracaktır.
Giriş
Son yıllarda, merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları ve oto-bağışıklık biçimleri tanımlanmıştır. Bu hastalıklar ve ilişkili otoantikorlann mevcudiyeti ile tanımlanır olduğu gösterilmiştir. Bu antikorlar ya da reseptörleri nöronal sinir iletimini 1,2 dahil sinaptik proteinlere bağlanır. Farklı antijenler, örneğin N-metil-D-aspartat reseptör (NMDAR) 3-5, γ-aminobütirik asit reseptör B (GABA B) 6 reseptörü, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-olarak tespit edilmiştir izoksazolepropiyonik asit (AMPA) reseptörü 7, voltaj kapılı potasyum kanal (VGKC) bağlı proteinler: lösin açısından zengin glioma-aktive protein 1 (LGL-1) v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Strateji pIRES2-EGFP Vektör Kodlama D2R veya NMDAR Construct altklonlamıştır
- İnsan D2R veya NMDAR alt biriminin 1 (NR1) tam uzunluktaki cDNA klonunu elde edilir.
- Böyle bir durumda birlikte tanımlanması antijenleri ve GFP hem de mümkün kılan bir gelişmiş yeşil floresan protein, bir iç ribozom giriş sahası (IRES) kontrolü altında (GFP) raportör ile transmembran proteinlerin ekspresyonu için uygun olan pIRES2-EGFP gibi bir ifade vektörü, seç ayrı ayrı hücreler.
- PIRES2-EGFP vektörü içinde insan cDNA alt-klonlanmıştır.
- , CDNA alt klonlamak, uygun kısıtlama enzimleri kullanmak için (insan D2R cDNA örneğin Nhel ve <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Canlı HEK293 D2R + ve HEK293 hücreleri, CTL yüksek verimli bir örneği kullanarak akış sitometresi ile elde edildi. Analiz sırasında, hücreler ileri dağılım (boyut) ve yan dağılım (granülaritesi) parametreleri (Şekil 1A ve 1B) dayalı kapılı edilmiştir. Transfekte edilmiş HEK293 hücreleri sitoplazmasında raportör molekülü, GFP ifade ve transfekte edilmemiş hücrelerin analizi (Şekil 1 B ve 1 E) alınmadı. GFP + kapısı içinde.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, bir yüksek verimli bir örneği kullanarak, belirli hücre yüzeyi proteinlerini nöronal hedef antikorları tespit etmek için bir canlı hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi yeni bir uygulamasını tarif etmektedir. Bu tekniği kullanarak, otoimmün sinir sistemi hastalığı olan etkilenen hastaların bir alt grubu NMDAR yüzey veya D2R yüzey serum antikorları sahip olduğunu bildirmektedir.
Canlı hücre bazlı bir deneyde sitometri bu yüksek verimli bir akış kullanılarak uygun antikor tespit.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması: Bir patent otoantikorlar için hedef olarak D2R iddia FB ve RCD (Sydney Üniversitesi) tarafından dava açılmıştır.
Teşekkürler
Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Star Bilimsel Vakfı (Avustralya), Tourette sendromu Derneği (ABD) tarafından desteklenen, Trish Multipl skleroz Araştırma Vakfı ve Multipl Skleroz Araştırma Avustralya, Petre Vakfı (Avustralya), Rebecca L. Cooper Tıbbi Araştırma Vakfı (Avustralya). Hepimiz hasta ve bizim çalışma için örnekleri verilen aile üyelerine teşekkür ederim.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| pIRES2-EGFP vektörü | Clontech | 6029-1 | |
| İnsan HA-Dopamin-2 reseptörü (D2R) cDNA | Missouri S & T cDNA Kaynak Merkezi | DRD020TN00 NMDAR'ın | |
| (NR1) insan alt birimi 1 cDNA | Hediyesi (Oxford, İngiltere) | ||
| Monoklonal saflaştırılmış fare anti-insan NR1 antikoru (klon: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Fare saflaştırılmış monoklonal anti-DRD2 IgG (klon: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 eşek anti-fare IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 keçi anti-insan IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glikoz, L-Glutamin ve 110 mg/L sodyum piruvat | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal sığır serumu | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamisin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penisilin-streptomisin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Fenol Kırmızısı ile TrypLE Express (1x) | Invitrogen | 12605-028 | |
| %0.9 Sodyum klorür | Baxter | AHF7975 | |
| Polietilenimin | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Arıtma Kiti | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Jel Ekstraksiyon Spin Kiti | Genomlu | 420050 | |
| T4 DNA Ligaz | Roche | ||
| Plazmid Artı Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Ekipman Adı/Yazılım Şirket Katalog | Numarası | Model/Sürüm | |
| Yüksek verimli örnekleyici sistemli akış sitometresi | BD Biosciences | BDLSRII HTS | |
| Ters mikroskoplu | Olympus | CKX41 (cıva lambalı ve U-RFLT50 güç kaynağı ile) | |
| Elektronik çok kanallı pipet (15-300 μ l) | Eppendorf | 613-2240P | 12 kanallı Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo Treestar | v7.5 | ||
| 50 ml polipropilen konik borular | BD Biosciences | 352070 | |
| 6 oyuklu plaka | BD Biosciences | 353046 | |
| Doku kültürü şişesi (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastik Ambalaj | PM-992 | |
| V-tabanlı 96 kuyulu plaka | Corning | 651180 | |
Kaynaklar
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS:....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
