Kısa Peptidlerinin Self-meclisi tarafından Sıralı Biyomoleküler Yapıların Oluşumu

Summary

Bu çalışma, kendi kendine düzeneğinin kendiliğinden işlemi ile yüksek sıralı peptit bazlı yapıların oluşumunu tarif eder. Yöntem, ticari olarak temin edilebilen ve bilinen peptidler laboratuar ekipmanları kullanır. Bu teknik, peptidlerin büyük bir çeşitlilik uygulanabilir ve yeni peptid-bazlı düzeneklerinin keşfine yol açabilir.

Abstract

Doğada, kompleks fonksiyonel yapıları, ılımlı koşullar altında biyomoleküllerin kendini düzeneği ile meydana getirilir. Kendini aksamını kontrol güçleri anlama ve in vitro bu süreci taklit malzeme bilimi ve nanoteknoloji alanlarında önemli gelişmeler getirecek. Bu önemli bir çeşitlilik mevcut olarak mevcut biyolojik yapı taşları arasında, peptidler, büyük ölçekli sentez basittir, çeşitli avantajları vardır ve bunlar kolayca biyolojik ve kimyasal maddeler ^1,2 ile modifiye edilebilir. Bu siklik peptitler, amfifil peptitler ve peptit-konjugatları çözelti içinde düzenli yapılar halinde kendi kendine birleşebilen peptidler olarak tasarlanan çeşitli sınıfları. Homoaromatik dipeptidlerin, örneğin nanotüpler, küreler ve fibriller ^3-8 olarak sipariş yapıların oluşturulması için gerekli olan tüm molekül bilgileri içeren kısa kendi kendini monte peptidlerin sınıfıdır. Bu peptidlerin bir çok çeşitli ticari olarak temin edilebilir. 9. Burada sunulan protokolleri potansiyel peptidler ya da biyolojik yapı taşları diğer sınıfların adapte edilebilir Yeni peptit bazlı yapıların keşfine ve montajı daha iyi kontrol yol açar.

Introduction

Doğa formları Biyomoleküler kendini montaj süreci yapılarını emretti ve fonksiyonel. Bu kendiliğinden süreci yöneten kuvvetler anlama in vitro olarak kendini montaj taklit ve buna bağlı olarak malzeme bilimleri ^10,11 alanında önemli gelişmeler yeteneği yol açabilir. Peptides, özel olarak ise, bu, büyük yapısal çeşitlilik, kimyasal sentez kolaylığı sergilediklerinden, biyomoleküler bir yapı bloğu olarak çok ümit vericidir ve kolayca biyolojik ve kimyasal maddeler ile fonksiyonalize edilebilir. Peptit kendini montaj alanında GhadiRi ve D-ve L-amino asitler ¹² dönüşümlü halkalı peptidler tarafından peptid nanotüpler kendinden montaj gösterdi meslektaşları tarafından öncülük edilmiştir. Peptid düzeneklerinin tasarımına diğer başarılı yaklaşımlar doğrusal bolaamphiphile peptidler ^{5 amfifillerin} (AP) ^6, konjuge olmayan kendi kendini tamamlayan iyonik peptidler ^13, yüzey aktif madde benzeri peptitler yer alır ^{4,14 ve ikili blok 15, copolypeptides.}

Daha yeni bir yaklaşım kısa aromatik peptitlerin kendi kendine düzeneğini içerir homoaromatik dipeptidler adlandırılır. Bu peptitler, aromatik doğası (örneğin Phe-Phe, tert-bütil dikarbonat (Boc)-Phe-Phe) ^7,8,16-21 sadece iki amino asit içerir. Bu homoaromatik peptidler tarafından oluşturulan yapılar boru şekilli yapılar, küreler, yaprak tabaka-benzeri montajlar ve lifler ^6,8,15,21-32 içerir. Bazı durumlarda fiberler bir hidrojel ^33-37 veren bir fibril örgü oluşturmak. Bu derlemeleri biosensörleme, ilaç dağıtım, moleküler elektronik, vb uygulamalar için istismar edilmiştir. ^38-45

Bu çalışma homoaromatik peptidlerin; kendi kendini montaj başlatmak için gerekli olan deneysel adımları açıklar. Buna ek olarak, bu coassembly peptidin süreci sunar. Bu işlem, peptidin birden fazla tipinin kendine düzeneğini içerirmonomer.

Difenilalanindir peptid _{(NH2-Phe-Phe-COOH)} ve Boc analog korumalı (Boc-Phe-Phe-OH): Bizim gösteri iki ticari olarak temin edilebilir peptidlerin coassembly içerir. Bir Süpermoleküler yapıya peptitler öz-montaj her biri: ya da küre ya da lifler halinde difenilalanindir peptit formları boru şekilli düzenekleri ve Boc-Phe-Phe-OH peptit öz-montaj çözücü ^7,17,46 bağlı olarak değişir. Bu belirli oranlarda iki peptidler karıştırıldı ve elektron mikroskobu, kuvvet mikroskopisi ve FT-IR spektroskopi ile sonuçlanmıştır derlemeleri karakterize edilir. Yöntemler, bir kaç yüz nanometre bir çapı olan ince uzun düzenekleri tarafından bağlanan birkaç mikron çapında (1-4 um) olan küresel elemanlar (~ 300-800 nm), aşağıdakilerden oluşan bir peptid bazlı yapı oluşumunu gösterdi . Küresel yapılar üzerinde dişli gibi görünüyor gibi meclisleri, kendi morfolojisi boncuklu dizelere benzeruzun meclisleri. Bu nedenle bu derlemeleri "biyomoleküler kolye" olarak adlandırılır. "Biyomoleküler kolye" bir ilaç teslim maddesi olarak veya elektronik uygulamalar için bir iskele olarak, yeni bir biyomalzeme olarak hizmet olabilir. Ayrıca, peptitlerin kendi kendine düzeneğine yol açan prosedür, peptidler ve diğer biyomoleküllerin sınıfları ile kullanılabilir. Bu, kendi kendine montaj ve yeni sipariş yapıların oluşumunda rol oynayan kuvvetler daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.

Protocol

1.. Homoaromatik dipeptidlerin Self-montaj

1. Onun liyofilize formda (örneğin _{NH2-Phe-Phe-OH,} Boc-Phe-Phe-COOH) 'de arzu edilen peptidi tartılır ve 1,1,1,3,3,3-hekzafloro in peptidi eritilerek bir stok çözelti hazırlamak -2-propanol ^7,17,46 _{(NH2-Phe-Phe-OH} ve Boc-Phe-Phe-COOH, örneğin 100 mg / ml) içinde uygun konsantrasyona seyreltildi (HFP).
2. Peptid tamamen çözülmüş ve çözelti (bir kaç dakika) net görünüyor kadar bankta vorteks ve yer kullanarak çözüm karıştırın.
3. Uygun konsantrasyonda (nanotüpler oluşumu için üç damıtılmış suda _{NH2-Phe-Phe-OH} (TDW) örneğin 2 mg / ml 'ye uygun bir çözücü ile birlikte, peptit stok çözeltisi ile seyreltilir, peptidin 2 ul ekleyerek 98 ul TDW, küresel yapıların oluşması için etanol içinde Boc-Phe-Phe-COOH 5 mg / ml) stok çözeltisi.
4. 24 saat boyunca oda sıcaklığında çözelti tutunhr.
5. Herhangi bir preaggregation önlemek amacıyla, her bir deney için taze stok çözelti hazırlayın.

2. İki Homoaromatik dipeptidlerin Coassembly

1. TDW ve mutlak etanol içinde eşit hacimlerde karıştırılması ile% 50 etanol içinde bir çözeltisi hazırlandı. İki çözüm karıştırmak için girdap kullanın.
2. _{NH2-Phe-Phe-OH} peptit ve Boc-Phe-Phe-OH peptidin 1 mg, 2 mg tartılır. 100 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar HFP her bir peptid çözülür.
3. Vorteks ile peptitler stok çözümler karıştırın ve peptidler tamamen çözülmüş ve çözümleri net görünüyor kadar tezgah üzerine koyun.
4. Peptidler, arzu edilen orana stok çözelti karıştırın. Bu özel deneyde (sırası ile 05:03 'lik nihai oranı) Boc-Phe-Phe-OH peptidin 6 ul _{NH2-Phe-Phe-OH} peptidin 10 ul karışımı. Nedeniyle HFP çözücünün yüksek volatilite için, (bu stok çözeltinin büyük miktarda hazırlanması önerilir least 10 ul).
5. Harmanlanmış peptidler stok solüsyonu karıştırmak için girdap kullanın.
6. Arzu edilen nihai bir konsantrasyona kadar% 50 etanol ile harmanlanmış peptidler stok solüsyonu ile seyreltilir. Bu özel deneyde sırasıyla Boc-Phe-Phe-OH için _{NH2-Phe-Phe-OH} ve 3 mg / ml için 5 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek amacıyla, karışım peptidler stok çözeltisi 8 ul ekle % 50 etanol çözeltisi içinde 92 ul. Yavaşça solüsyonu karıştırmak için bir pipet kullanın.
7. 24 saat boyunca oda sıcaklığında çözelti tutun.
8. Bu nedeniyle çözücünün yüksek seviyede uçucu tabiatı için, deneyler peptidlerin konsantrasyonunda küçük değişikliklere duyarlı olduğu not edilmelidir. Bu nedenle, taze stok çözeltileri, her bir deney için hazırlıklı olmalıdır.

3. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) kullanarak Öz Montajlı Yapıların Karakterizasyonu

1. Kuluçkadan 24 saat sonra, cam bir koy peptitler çözeltisinin 10 ul damla uygulamakoda sıcaklığında r slip ve kuru.
2. Coat 90 sn için bir püskürtme kaplayıcı kullanılarak altının ince bir tabaka (birkaç nanometre) ile camın üzerine koyun.
3. Görüntü SEM 10-20 kV faaliyet kullanarak derlemeleri.

4. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) kullanarak Öz Montajlı Yapıların Karakterizasyonu

1. Karbon ile kaplı ve bir polimer film destek tarafından stabilize edilmiş bir 200-kafes bakır ızgara üzerinde peptitler çözeltisinin 10 ul damla yerleştirin.
2. 1 dakika sonra filtre kağıdı kullanarak fazla sıvıyı uzaklaştırmak.
3. TDW içinde% 2 uranil asetat içinde bir çözeltisi hazırlandı. 0.22 mikron filtre birimini kullanarak çözüm Filtre.
4. Örnek (negatif boyama) leke için, ızgara üzerinde 10 ul uranil asetat çözeltisi bir damla yerleştirin.
5. 30 saniye sonra filtre kağıdı kullanılarak aşırı sıvı kaldırmak. Bu negatif boyama resimlerin kontrastını geliştirir, ancak bu her durumda gerekli olmadığını belirtmek gerekir.
6. Görüntü th örnek120 kV çalışan, TEM ile E ızgara.

5. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) tarafından Meclisleri üç boyutlu karakterizasyonu

1. Paragraf 3.1 'de tarif edilen prosedür kullanılarak AFM analiz için bir örnek hazırlayın.
2. AC modunda çalışan bir AFM enstrüman kullanarak camına örnek analiz. 3 N / m arasında bir yay sabiti ve 75 kHz'lik bir rezonans frekansına sahip silikon konsol olarak kullanın.
3. Arzu edilen yapıyı bulmak amacıyla, ızgara büyük bir alanı tarayarak başlayın. Sonra, belirli bir küçük alana odaklanmak ve (tarama boyutu görüntü için x 2.5 mikron 2.5 mikron idi bu yazının dahil) tarayın.

6. FT-IR ile ikincil yapı karakterizasyonu

1. Bir _CaF2 pencerede peptitler çözeltisi, 30 ul damla uygulanır.
2. Çözelti, oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
3. IR spektrumunda suyun adsorpsiyon 1650 cm ^-1.Bu pik, peptid bağı amid I bandın merkezinde yer almaktadır. Ayrıca, peptitler ve proteinler ⁴⁷ α-sarmal yapılar için tipik bir zirvedir. Bu sorunun üstesinden gelmek ve suyun sinyali engellemek amacıyla, bir hidrojen-to-döteryum değişimi gerçekleştirilmelidir. Kurutulmuş peptid numunesi üzerinde döteryum oksit içinde bir damla (D ₂ O) yerleştirin. Damla tamamen penceresindeki peptid para karşılamak için yeterince büyük olmalıdır.
4. Örnek vakum altında kurumaya bırakın.
5. Tekrar maksimal hidrojen-to-döteryum alışverişini sağlamak için 6.3 ve 6.4 2x adımları. Bu analiz edilinceye kadar, vakum altında örnek kaydedin.
6. Bir dötere triglisin sülfat (DTGS) detektörü ile FT-IR spektrumları kaydedin. FT-IR sistemi, numunenin bir ortamda nem önlemek amacıyla, bir temizleme gaz jeneratörü içerir. Kısa peptidlerin örnekleri için, 4 ^cm-1 çözünürlükte bir numune 2000 x taramak için en iyisidir. Geçirgenliği en az değerleri bu şekilde belirlenebilirftware aleti ile birlikte.

Results

Bu çalışma, peptitlerin kendi kendine düzeneği ile nano-ölçekli ve mikrometre sipariş yapıların oluşturulması için bir yöntem tarif eder. Biz mevcut bu basit işlem gösterilmektedir ve iki basit aromatik peptitlerin coassembly (Şekil 1) karakterize etmek için. Peptidlerin bir nanometrik boyutlardaki ^7, içi boş boru şeklinde yapılar olarak bir sulu çözelti içinde kendi kendine monte edebilir _{NH2-Phe-Phe-OH} (difenilalanindir) peptiddir. Diğer peptid onun Boc korumalı analog, Boc-Phe-P...

Discussion

Özet olarak, bu kağıt peptit bazlı düzenekleri in vitro olarak oluşturulabilir hangi kolaylığı göstermektedir. Işlem ticari olarak temin edilebilen peptidler ve çözücü içerir ve bu test tüpüne bir polar çözücünün ilavesi üzerine, ortam koşulları altında kendiliğinden oluşur. Bu nedeniyle diğer organik çözücüler içinde peptidlerin düşük çözünürlüğü için, peptidlerin, bir çözücü olarak HFP kullanımı için çok önemlidir. Bunlara ilave olarak, HFP yüksek volatilite it Her deney için taze bir stok çözelti hazırlamak ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NH < > 2 < / sub>-Phe-Phe-OH	Bachem	G-2925.0001
Boc-Phe-Phe-OH	Bachem	A-3205.0005
1,1,1,3,3,3-heksafloro-2-propanol	Sigma-Aldrich	52512-100ML
Etanol mutlak (Susuz) AR steril	Bio-Lab Ltd.	52555	% 50 çözelti
Uranil asetat	Sigma-Aldrich	73943	harmanlama Negatif boyama için. Onsuz çalışmak mümkündür.
cam kapak kayma	Marienfeld Laboratuvarı Züccaciye	110590
TEM ızgaraları	Elektron Mikroskobu Bilimleri	FCF200-Cu-50	Formvar / Karbon 200 Mesh, Cu
Kantitatif filtre kağıdı	Whatman	1001055
2 < / alt > O)	Sigma-Aldrich	151882-100G	99.9 atom % D
CaF < alt > 2< / alt> pencere	PIKE Technologies	160-1212	25 mm x 2 mm pencere. FT-IR ölçümleri için
AFM ipuçları	NanoScience Instruments	CFMR	Aspire probları, CFMR-25 serisi
Filtre üniteleri	Millipore	SLGV033RS	Millex-GV, 0.22 & mu; m, PVDF, 33 mm, gama sterilize
SEM	FEI		Quanta 200 ESEM
TEM	FEI		Tecnai T12 G2 Ruh
AFM	JPK Instruments		A JPK NanoWizard3
FT-IR	Thermo Fisher Scientific		Nicolet 6700 gelişmiş altın spektrometresi
FT-IR Tahliye	Parker		BALSTON FT-IR Tahliye Gazı Jeneratörü model 75-52
OMNIC (Nicolet) yazılımı	FT-IR spektrum analizi için	Thermo Nicolet Corporation
Vorteks karıştırıcı	Wisd Laboratuvar Ekipmanları		ViseMix VM
Ağırlık	Mettler Toledo		NewClassic MS
Püskürtme kaplayıcı	Polaron		SC7640 Püskürtme Kaplayıcı