Cilt Tip I Kolajen hazırlanması için geliştirilmiş bir yöntem

Özet

Çözünebilen bir tip 1 kollajen (col1) izolasyonu için geleneksel işlemleri de, uzun inkubasyon tampon ve fibrillerin zahmetli resuspensions of baştan sona yaklaşık 10 gün gerektirmektedir. Burada, biz az 3 saat küçük dermal biyopsilerden Süt1 arındırmak için bir araç açıklar.

Özet

Çözülebilir kolajen tip 1 (col1) hücre kültürleri için bir yapışkan tabaka olarak ve rejeneratif uygulamalar için hücresel bir yapı iskelesi olarak yaygın bir biçimde kullanılmaktadır. Klinik olarak, bu proteinin yaygın kozmetik cerrahi, dermal enjeksiyonlar, kemik grefti ve rekonstrüktif cerrahi için kullanılır. Bu işlemler için COL1 ve kaynakları inflamasyon ve ret potansiyeli yanı sıra ksenobiyotiksiz hastalık bulaşmasını arttırır, genellikle insan kaynaklı değildir. Bu görüş, verimli ve hızlı bir otolog-türevi dokuların sınırlı miktarlarda ikinci Süt1 saflaştırılması için bir yöntem olup, bu sorunların çoğu aşmak olur, ancak, standart ayırma protokoller uzun ve genellikle kollajen dokularının büyük miktarlarda gerektirir. Burada, en az 3 saat ila yaklaşık 10 gün arasında bu proteinin izole edilmesi ve saflaştırılması için gerekli olan zamanı azaltır etkili bir col1 çıkarma yöntemi göstermektedir. Biz birçok cerrahi işlemler sırasında, çünkü onun durumu bizim doku kaynağı olarak dermis seçti. Tonun yöntemi altderinin, az miktarda yüksek ölçüde saf, çözünebilir Süt1 elde etmek için güçlü çalkalama ve santrifüj filtre ile birlikte geleneksel ekstre etme tamponları kullanır. Kısaca, dermal biyopsiler yağ, bağ dokusu ve saç çıkardıktan sonra buz gibi soğuk dH ₂ O iyice yıkanır. Deri örnekleri, 0.5 M sodyum asetat ve yüksek hızlı bir tezgah üstü homojenizörü kullanılarak nonkollagenöz protein ve polisakaritlerin kaldırılır. Artık katı maddelerden kollajen, daha sonra homojenleştirici kullanılarak bir 0.075 M sodyum sitrat tampon maddesi ile ekstre edilir. Bu ekstreler karşılaştırılabilir ya da üstün ticari ürünler için kalite ya da geleneksel prosedürler kullanılarak elde edilmiş olan col1 preparatları elde 100,000 MW kesme santrifüj filtresi kullanılarak saflaştırılır. Bu yöntem, araştırma ve klinik uygulamalarda çok sayıda için otolog kaynaklı COL1 kullanımını kolaylaştıracak tahmin.

Giriş

On yıllardır, araştırmacılar ve ticari satıcılar kullanılabilir düzenlenmiş col1 fibrillerin bir matrisin yeniden süspansiyon haline getirilmesi ile sonuçlanan nötralizasyonu ardından basit bir asit ekstraksiyon protokolü, bir varyasyonunu kullanılarak deri ve tendon dokusu da dahil olmak üzere bir çeşit kaynaklardan gelen çözündürülmüş Süt1 izole var biyomedikal uygulamalarda ^1-4 çok sayıda için. COL1 için klinik uygulamalar birçok örnek olsa da, bu proteinin hazırlık ^5-7 gerçekleştirmek için gün veya hafta alarak uzun ekstraksiyonlanm gerektirdiğinden, bu birkaç otolog kaynaklı col1 kullanır. Sonuç olarak, araştırmacılar, araştırma ve hekimler, genellikle, örneğin, sıçan, sığır, domuz veya insan olmayan altderinin gibi dokuları kullanılarak veya kadavra derisi kullanılarak kaldırılır veya sünnet izleyerek hazırlanır COL1 pahalı, ticari preparatları kullanın. Rejeneratif uygulamalar için, yetenekleri ile ilgili olarak bu ürünler, sergi değişkenlik çok katı oluşturulması içinmatrisler veya hücre eki ve büyümeyi destekleme yeteneğine doku yapıları. Sonuç olarak, hızlı erişilebilir ve bol otolog doku kaynaklarından Süt1 ayıklamak için tasarlanmış yeni bir standart yöntem için ayrı bir ihtiyaç vardır.

Bu tür bir yöntem col1 ilgi hayvan modeli çıkarılır ve kollajen bazlı iskeleler üzerine monte tasarlanmış dokuların klinik öncesi test edilmesi için kullanılabilecek bir araştırma ortamında zaman ve paradan tasarruf sağlayacaktır. Aynı zamanda, klinikte bir hızla izole, otolog kaynaklı Süt1 kullanma seçeneğine sahip aksi allojenik veya ksenogeneik hazırlıkları alacak hastalar için genel güvenliği artıracak. Bir autogeneic hazırlık alan hastalar için, bu akıcı yöntem büyük ölçüde biyopsi toplama ve kolajen uygulama arasındaki süreyi azaltacaktır. Bu nedenlerden dolayı, yüksek hızlı ag kullanarak köklü bir col1 izolasyon ve saflaştırma yöntemi geliştirmek için arananrehabilitasyonu amaçlayan ve boyut dışlama santrifüj. Bu yöntem birçok laboratuvarlarda bulunan standart tamponlar ve ekipman kullanarak gerçekleştirmek için basit. Yüksek hızda çalkalama kullanılarak, protokolümüz az 3 saat ⁸ için yaklaşık 10 gün arasında çözülebilir, dermal Süt1 izole etmek için gerekli olan zamanı azaltır. Önemli olarak, bu metod prosedürleri tek bir kümesi esnasında hastalar için otolog türetilmiş Süt1 hazırlamak için klinik ortamda gerçekleştirilebilir.

Protokol

Burada kuzu derisinden COL1 ve izolasyonu gösterecektir. Yazılmış olduğu gibi, bu protokol de başarıyla tavşan ve insan cilt Süt1 izole etmek için kullanılabilir.

1.. Dermal örnek hazırlayın

1. Kullanımdan önce 4 ° C'ye bütün reaktifler dengelenmesi.
2. Buz dH ₂ O dermal örneği (25-50 g) durulayın ve tüy dökücü krem ile herhangi yün, kürk, ya da tüylerden.
3. Bağ dokusu ve yağ numune tozunu kazımak için bir tek kenar jilet kullanın.
4. Buz dH ₂ O'da örnek durulayın
5. Tek bir kenar jilet ile 1 cm x 1 cm parçalar halinde deri örneği dilimleyin.

2. Nonkollagenöz Çözündürülmüş Malzeme kaldır

1. Numune, 50 ml konik tüp başına 5 g tartılır ve buz soğukluğundaki 0,5 M sodyum asetat, 30 ml.
2. Tezgah üstü homojenizatör içinde bir 50 ml tüp adaptörü ile 6 m / saniye ayarında 1 dakika boyunca tüpleri karıştırın.
3. Sup atın7 sodyum asetat yıkama döngüleri toplam ernatant ve tekrarlayın.
4. Buz soğukluğunda dH ₂ O örnek yıkayın ve kalıntı sodyum asetat giderilmiş, bir kez karıştırın.
5. Fazla sıvının çıkması ve daha sonra yeni bir 50 mL konik tüp aktarmak için tüpün kenarına karşı örnek sıkıştırmak için bir spatula kullanın.

3. Kollajen Ekstraksiyon yazın

1. Örnek sıkıştırma ve her bir yıkamadan sonra süpernatant atarak tezgah üstü homojenleştirici içinde 6 m / sn 'de 1 dakika boyunca ml / g 2 iki kez örnek yıkayın 0.075 M sodyum sitrat tampon maddesi.
2. Numuneye 0.075 M sodyum sitrat tamponu taze bir 2 ml / g bir kısım ekleyin.
3. Her çevrim arasındaki tampon çıkarmadan 6 sıralı 1 dk, ajitasyon 6 m / sn tezgah üstü homojenleştirici mix çevrimi gerçekleştirin.
4. Bir toplama tüpüne kalın, berrak süpernatant aktarın.
5. Numuneye bir ml / g 1 ek 0.075 M sodyum sitrat tamponu ilave edin ve bir final tezgah üstü homojenleştirici agita yerinetion çevrimi.
6. Bir toplama tüpüne bu son süpernatant ekleyin.
7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3,200 x g de santrifüj toplama tüpü
8. 100.000 molekül ağırlığına sahip üst bölmesine süpernatant aktarın santrifügal filtre cihazı kesti.
9. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 3200 x g'de santrifüje
10. 4 ° C 'de bir temiz konik tüp ve saklamak için, üst bölmeden saflaştırılmış Süt1 aktarın

Sonuçlar

Bu col1 izolasyon protokol tamamlanması için yaklaşık 2 saat 15 dakika gerektirir. Şekil 1, bu prosedürdeki önemli adımlar şematik bir diyagramını göstermektedir. Örnek hazırlama ve yüksek hızlı ajitasyon 7 döngülerini gerçekleştirmek ve sodyum asetat ile durulama ürünleri, yaklaşık 35 dakika (Şekil 1A-C) alır. Bir ajitasyon Sahne ve dH ₂ O ile durulama yaklaşık 5 dk (Şekil 1D ve 1E) alır. Sodyum sitrat eklemek ve bir çalkalama için örnek tabi tutulması ve aj...

Tartışma

Bu yöntemin önemli bir öğesi, fazla sıvının çıkması için dermal numunenin tekrar etkili sıkıştırma. Bu örnek sıkıştırılmasıyla aşamasında 2,5 mümkün olduğu kadar, sodyum asetatın ayrılması için çok önemlidir. Bu tüpün yanına karşı cildi sıkıştırmak için bir ıspatula ile birlikte, bir tülbent de kullanılabilir, bu tüpten numune çıkarılmasını gerektirir ve bu adımları gerçekleştirmek için gereken süreyi uzatır olsa da. Benzer şekilde, sodyum sitrat hacmi daha sonraki ekstre etme adımda doğru olduğunu, aşama 3.1 'de ör...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
FastPrep-24 Sistemi	MP Biyomedikal	116004500
Santrifüj	Beckman	J6-MI	3.200 x g'da 50 ml konik tüpleri yerleştirmek için salıncak kova rotoru.