Yöntem makalesi

Vitamin E-TPGS ile Tek veya Çift Emülsiyon ile Oluşturulan PLGA Nanopartikülleri

68K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51015

⸱

27 Aralık 2013

 , 
1Barrow Brain Tumor Research Center, Barrow Neurological Institute

Bu makalede

Özet

Emülgatör olarak E-TPGS vitamini kullanılarak poli(laktik-ko-glikolik asit) oluşan nanopartiküllerin ve mikropartiküllerin üretimini ve karakterizasyonunu açıklıyoruz. Emülgatör konsantrasyonu gibi formülasyon parametrelerini değiştirerek, ortalama çapları 220 nm ila 1.98 μm arasında değişen nanopartiküller üretmek mümkündür.

Özet

Poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA), biyolojik olarak parçalanabilen polimerlerin alifatik polyester ailesinin biyouyumlu bir üyesidir. PLGA, özellikle insanlarda emilebilir sütürler şeklinde kullanım için FDA onaylı olduğundan, ilaç dağıtım uygulamaları için uzun süredir popüler bir seçim olmuştur. Hidrofobik ve hidrofilik ilaçlar, tek veya çift emülsiyon yoluyla PLGA partikülleri içinde kapsüllenir. Kısaca ilaç, polimer ile çözülür veya daha sonra sulu faz ile emülsifiye edilen organik bir fazda polimer ile emülsifiye edilir. Çözücü buharlaştıktan sonra, partiküller yıkanır ve liyofilizasyon ve uzun süreli depolama için santrifüjleme yoluyla toplanır. PLGA, sulu ortamlarda hidroliz yoluyla yavaş yavaş bozunur ve kapsüllenmiş ajanlar haftalar ila aylar arasında bir süre içinde salınır. PLGA, ilaç dağıtımı için birçok avantaja sahip bir malzeme olmasına rağmen, nanopartiküllerin tekrarlanabilir oluşumu zor olabilir; Farklı ekipman, reaktif partisi ve hassas emülsifikasyon yönteminin kullanılmasıyla önemli ölçüde değişkenlik ortaya çıkar. Burada, emülsifiye edici ajan E-TPGS vitamini kullanılarak tek veya çift emülsiyon ile oluşturulan mikropartiküllerin ve nanopartiküllerin oluşumunu ve karakterizasyonunu ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Parçacık morfolojisi ve boyutu taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile belirlenir. Değişen emülgatör konsantrasyonu ile üretilen nanopartiküller için temsili SEM görüntülerinin yanı sıra görüntüleme artefaktları ve başarısız emülsifikasyon örnekleri sunuyoruz. Bu protokol, alternatif emülgatörler (örn. poli (vinil alkol), PVA) veya çözücüler (örn. diklorometan, DCM) kullanmak için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

Polimerler, hedeflenen tümör tedavisi1'den bağışıklık sisteminin modülasyonu2'ye kadar değişen uygulamalar için son birkaç on yılda giderek daha popüler ilaç dağıtım araçları haline geldi. Polimer kapsüllenmiş veya konjuge ilaçlar, polimerle ilişkili ilaç bozunmaya karşı korunduğundan, genellikle serbestçe verilen muadillerinden daha etkilidir. Bu koruma, daha uzun bir biyolojik yarı ömür ve azaltılmış sistemik yan etkiler3-5 ile potansiyel olarak geliştirilmiş etkinlik anlamına gelir.

Poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA), nano ölçekli bir dağıtım sisteminin ideal özelliklerinin çoğunu sergileyerek, kapsüllenmiş ajanın uzun süreli salınımını sağlar ve laktik ve glikolik asidin biyouyumlu ürünlerine indirgenir. PLGA'da kapsüllenen küçük moleküller, proteinler ve nükleik asitler, çeşitli hastalık uygulamalarında gelişmiş aktivite göstermiştir8. Daha da önemlisi, malzeme platformu, parçacıkları belirli dokulara hedeflemek veya görüntüleme amaçları için ligandların boyut, yük ve yüzey gösterimi gibi özelliklerin kolayca özelleştirilmesini kolaylaştırır. PLGA zaten insanlarda biyolojik olarak parçalanabilen sütürler (örneğin Purasorb, Purac Biomaterials ve Vicryl, Ethicon Inc.) şeklinde kullanıldığından, klinik translasyon potansiyeli yüksektir.

Yağ-su (tek) veya su-yağ-su (çift) emülsiyonu, PLGA'nın hidrofobik ve hidrofilik ilaçları mikro veya nano ölçekli formda kapsüllemek için kullanılabileceği bir yöntemdir. Kısaca PLGA, bir yüzey aktif madde veya stabilizatör (su) ile emülsifiye edilen bir organik faz (yağ) içinde çözülür. Hidrofobik ilaçlar doğrudan yağ fazına eklenirken, hidrofilik ilaçlar (su) partiküllerin oluşumundan önce ilk olarak polimer çözeltisi ile emülsifiye edilebilir. Yüksek yoğunluklu sonikasyon patlamaları, küçük polimer damlacıklarının oluşumunu kolaylaştırır. Elde edilen emülsiyon, daha büyük bir sulu faza eklenir ve birkaç saat boyunca karıştırılır, bu da çözücünün buharlaşmasına izin verir. Sertleştirilmiş nanopartiküller toplanır ve santrifüjleme ile yıkanır (Şekil 1).

Burada, çözücü olarak etil asetat (EtAc) ve emülsifiye edici ajan olarak E-D-α-Tokoferol polietilen glikol süksinat (TPGS) ile tek ve çift emülsiyon kullanarak PLGA nanopartikülleri yapmak için bir tekniği açıklıyoruz. E-TPGS vitamininin kullanımı, gelişmiş emülsifikasyon ve kapsülleme verimliliği dahil olmak üzere diğer stabilize edici ajan türlerine (örneğin poli (vinil alkol), PVA) göre çeşitli olası avantajlar sunar. Diğer gruplar, kanser hücreleri üzerinde yaygın olarak aşırı eksprese edilen ve ilaçları hedef hücrelerden uzaklaştırarak ilaç direncine katkıda bulunduğu bilinen bir transmembran akış proteini olan P-gp'nin inhibisyonu da dahil olmak üzere Vitamin E-TPGS'nin avantajlarını bildirmiştir. Ek olarak, taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak parçacıkların nasıl karakterize edileceğini ve boyutlandırılacağını gösteriyoruz ve protokolün değiştirilmesi yoluyla boyut modifikasyonu hakkında daha fazla rehberlik sağlıyoruz.

Protokol

1. Nanopartikül Hazırlama

Solvent veya çözünmüş/emülsifiye edilmiş polimer içeren tüm adımlar kimyasal çeker ocakta gerçekleştirilmelidir.

  1. 100 mg (+/- 5 mg) poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) tartın ve 13 mm x 100 mm'lik bir test tüpüne yerleştirin.
  2. 1 ml çözücüyü (etil asetat (EtAc) veya diklorometan (DCM)) bir cam serolojik pipet ile numuneye aktarın.
  3. Tüpün üst kısmını küçük bir parça alüminyum folyo ile örtün ve folyoyu güvenli bir şekilde Parafilme alın, Parafilmi şişenin üst kenarına ve folyonun alt kenarına sıkıca sardığınızdan emin olun.
  4. Test tüpünün dışındaki çözücü seviyesini işaretleyin. Polimerin gece boyunca çözünmesine izin verin, buharlaşma meydana gelirse ertesi gün ek çözücü ekleyin.
    Not: Polimer, gerekirse nanopartikül hazırlama gününde de çözülebilir. 1.1-1.3 adımlarını izleyin, ardından tüm polimer tamamen çözülene kadar (~ 10 dakika) yüksekte girdaplayın.
  5. Ultrasonicator'ın yanında aşağıdaki ekipman / malzemelerle davlumbazda bir çalışma alanı hazırlayın: bir girdap, lastik ampullü iki küçük cam Pasteur pipeti ve bir manyetik karıştırma plakası. Ultrasonicator'ın altındaki bir standa buzlu su dolu büyük bir beher yerleştirin.
  6. Manyetik karıştırma çubuklu 200 ml'lik bir cam behere 45 ml %0.3 w/v Vitamin E-TPGS ekleyin ve karıştırma hızını 360 rpm'ye ayarlayın.
  7. 13 mm x 100 mm'lik bir cam test tüpüne 2 ml w/v %0.3 Vitamin E-TPGS ekleyin.
  8. İlaç ekle:
    Hidrofobik ajanlar için: kapsülleyiciyi doğrudan polimer çözeltisine ekleyin (test tüpünün duvarlarından kaçınmaya dikkat edin) ve kapsülleyici homojen bir şekilde dağılana kadar tüpü girdaplayın.
    Hidrofilik ajanlar için: devam etmeden önce kapsülleyiciyi polimer çözeltisi ile emülsifiye edin. Polimer çözeltisinin yüzeyine suya veya tampona 50 μl'ye kadar ilaç ekleyin. İlacı polimer ile emülsifiye etmek için kısaca ultrasonikat (tipik olarak 10 saniye veya homojen, opak bir çözelti elde etmek için gerektiği gibi). Bu sonikasyon adımı buz üzerinde yapılmalıdır.
  9. Açık tüp polimeri/kapsülleyiciyi girdabın yanına yerleştirin. E-TPGS Vitamini içeren test tüpünü dikey olarak ve yüksek girdapta tutarken, polimer/kapsülleyici çözeltiyi damla damla eklemek için bir cam Pasteur pipeti kullanın. Tüpün kenarlarından kaçınmaya ve polimer çözeltisini doğrudan girdaplama emülgatörünün yüzeyine bırakmaya dikkat edin. 1 ml polimer çözeltisinin tamamı Vitamin E-TPGS'ye eklendikten sonra, çözeltiyi (şimdi bir emülsiyon) 15 saniye daha girdaplamaya devam edin.
  10. Emülsifiye edilmiş polimeri hemen ultrasonikatöre aktarın. Test tüpünü buzlu suya batırın ve emülsiyonu üç adet 10 saniyelik patlamada sonikasyon yapın (700 W sonikatör için% 40 genlik, prob ucu boyutunda 1/8). Eşit sonikasyonu sağlamak için emülsiyonu probda yukarı ve aşağı hareket ettirin, probun test tüpünün yanlarına veya altına dokunmaktan kaçınmaya dikkat edin. Devam etmeden önce çözeltinin soğumasını sağlamak için her on saniyelik sonikasyon arasında duraklayın.
  11. Karıştırma çözeltisinden 1-2 ml% 0.3 Vitamin E-TPGS ekleyin, emülsifiye edilmiş polimeri daha kolay dökecek şekilde incelten bir cam Pasteur pipeti ile emülsiyona ekleyin. Emülsiyonu karıştırma çözeltisine boşaltın. Test tüpünden kalan çözeltiyi karıştırma çözeltisine yıkamak için bu adımı tekrarlayın.
  12. Üç saat boyunca karıştırırken nanopartiküllerin sertleşmesine izin verin. Kapsülleyici ışığa duyarlıysa, beher alüminyum folyoya sarılabilir ve çözücünün buharlaşmasını kolaylaştırmak için üst kısmı açık bırakılabilir.

2. Nanoparçacık Koleksiyonu

  1. Sertleştirilmiş nanopartikülleri iki Oak Ridge santrifüj tüpüne (30 ml nominal hacim) bölün ve 0,1 g içinde dengeleyin.
  2. Nanopartikülleri sabit açılı bir rotorda 17.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Daha uzun santrifüjleme süreleri, daha küçük nanopartiküllerin daha yüksek bir fraksiyonunun toplanmasına neden olacaktır.
  3. Nanopartikül peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı atın (su dökülebilir veya pipetlenebilir). 15 ml diH2O ekleyin ve nanopartikülleri tamamen yeniden süspanse etmek için bir su banyosu sonikatörü ve / veya girdap kullanın.
  4. İki santrifüj tüpünün içeriğini bir santrifüj tüpünde birleştirin ve her seferinde 30 ml diH2O'da toplam üç yıkama için 2.1-2.3 adımlarını 2 kat daha tekrarlayın. Son pelet resüspansiyonunun sıvı hacmi 4-5 ml.
    olmalıdır Bu noktada bir kriyoprotektan olarak 1: 2 trehaloz: polimer ağırlık oranı eklenebilir (SEM görüntüleme için trehaloz olmadan küçük bir nanopartikül alikotunu dondurun). Dondurma işlemi sırasında oluşan buz kristalleri partikül yüzeyine zarar verebilir ve agregasyona neden olabilir ve trehalozun dahil edilmesinin PLGA nanopartiküllerinin13 düzgün ve tam yeniden süspansiyonunu iyileştirdiği gösterilmiştir.
  5. Nanopartikülleri önceden tartılmış 5 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve -80 °C'de en az 30 dakika dondurun.
  6. Donmuş içeriğin erimesine izin vermemek için hızlı hareket ederek, tüpün kapağını açın ve laboratuvar dokusunu bir lastik bantla üst kısımdan sabitleyerek üst kısmı kapatın. ** Herhangi bir erime meydana gelirse, liyofilizatöre yerleştirmeden önce tekrar dondurun.
  7. 5 ml'lik bir hacim için 72 saat liyofilize edin. Liyofilize partikülleri Parafilm sarılı tüpte -80 °C'de saklayın.

3. Boyutlandırma ve Yüzey Morfolojisi

Taramalı Elektron Mikroskobu

  1. SEM için numuneler görüntülemenin yapıldığı gün hazırlanmalıdır. Bir SEM saplaması üzerine bir çift taraflı karbon bant şeridi yerleştirin. Saplamanın metal kısmını daha sonra başvurmak üzere etiketlemek için kalıcı işaretleyici kullanılabilir.
  2. Az miktarda liyofilize nanopartikül toplamak için metal bir spatula kullanın ve bunları bandın yüzeyine nazikçe yayın. Saplamanın yüzeyini bir laboratuvar mendili ile fırçalayın veya gevşek nanopartikülleri çıkarmak için basınçlı hava kullanın.
  3. Numuneyi 30-120 saniye boyunca altın paladium ile kaplayın. Daha uzun bir püskürtme süresi, görüntüleme için daha pürüzsüz bir yüzey üretecektir, ancak bu, ince yüzey ayrıntılarının kaybolmasına neden olabilir.
  4. Parçacıkları görselleştirmek için tipik parametreler 5-15 mm'lik bir çalışma mesafesi, 5-12 kV'luk bir ışın mukavemeti ve 1-3'lük bir nokta boyutudur. Daha yüksek ışın kuvvetleri, numunenin bölgesel olarak ısınmasına neden olabilir ve bu da parçacıkların yüzey morfolojisini değiştirecektir. Mikropartiküller 100X büyütmede gözlenir ve nanopartiküller 3.000X büyütmede ayırt edilebilir olacaktır.
  5. İdeal numune, saplamanın düz yüzeyi boyunca düzgün bir parçacık kaplamasından oluşacaktır. Bazen, ikincil yapılar (pullar veya küreler dahil) liyofilizasyondan kaynaklanabilir. Pulun bantla buluştuğu bir pulun kenarına veya bir kürenin tepesine odaklanmak, SEM ile kolayca görselleştirilebilen parçacıkların bulunmasına yardımcı olacaktır. Parçacık boyutu ve morfolojisinin temsili bir örneğini elde etmek için parti başına en az üç görüntü toplayın.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak hazırlanan PLGA mikropartiküllerinin ve nanopartiküllerinin temsili SEM görüntüleri Şekil 2a ve Şekil 2b'de gösterilmiştir. Partiküller; pürüzsüz bir yüzey morfolojisine sahip, numuneye yayılmış geniş bir boyut aralığında, birbirine kaynamamış tekil küreler şeklinde görünecektir.

Her partinin ortalama çapını belirlemek için, ImageJ'deki "measure" (ölçüm) işlevi kullanılarak doğrudan SEM görüntülerinden ölçümler yapılır. Temsili bir boyut dağılımı elde etmek için, görüş alanından rastgele seçilen partiküllerin çaplarına ilişkin en az 150 ölçüm alınmalıdır. Bir partikül partisinin ortalama boyutu, formülasyon parametrelerine bağlıdır. Örneğin, Şekil 2a, emülsifiye edici fazda %0,05 Vitamin E-TPGS kullanılarak, 100 mg PLGA başına 1 ml çözücü ile mikropartiküller (ortalama çapı 730 nm±370) oluşturulmuştur; buna karşın Şekil 2b200 mg PLGA'ya 4 ml çözücü kullanılarak, hidrofobik ilaç kamptotesin kapsülleyen ve emülsiyon fazında %0,3 Vitamin E-TPGS içeren nanoparçacıklar (ortalama çapı 340 nm±70) oluşturulmuştur (tam formülasyon parametreleri şekil açıklamasında tanımlanmıştır). Genel olarak, daha yüksek emülgatör konsantrasyonu daha küçük parçacıklar oluşturur; emülgatör konsantrasyonunun %0,3 ile %0,01 arasında değiştirilmesiyle 220-2.000 nm arasında değişen ortalama çaplar elde edilebilir (Şekil 3).

Verimlerimiz %74-98 arasında değişmektedir (tek bir deneyci tarafından farklı solventler, emülgatörler ve emülsifikasyon koşullarıyla hazırlanan 22 nanopartikül partisi). Küçük nanopartiküller, özellikle yıkama süpernatantı peletten dökülürken santrifüj ve yıkama aşamasında kolayca kaybolduğu için, daha büyük (>150 nm) partilerde daha iyi verimler gözlemlenebilir. Sıvının dikkatle pipetlenmesi bu sorunu önlemeye yardımcı olabilir. Daha yüksek hızlar ve/veya daha uzun santrifüj süresi, hem ultra küçük nanopartikül fraksiyonunun toplanmasını iyileştirerek hem de peletin sıkışmasını sağlayarak yıkama aşamasında daha az kayıp verilmesini sağlar ve böylece verimi artırabilir. Burada açıklanan protokol, emülgatör olarak TPGS ve solvent olarak EtAc kullanılarak partikül üretmeye odaklanmıştır; ancak alternatif solventler ve/veya emülgatörler de mümkündür. Genel olarak, muhtemelen EtAc'nin suyla karışabilir, DCM'nin ise karışamaz olması nedeniyle, EtAc'nin DCM'den daha küçük ve daha üniform boyutlu nanopartiküller ürettiğini saptadık (örneğin, solvent içinde 100 mg/ml PLGA'nın 2 ml %0,1 TPGS içinde emülsifiye edilmesi durumunda, EtAc için 540 nm±190'a karşı DCM için 2.160 nm±1.530 çap değerleri). PVA, tarafımızca ve diğer gruplarca yaygın olarak kullanılan popüler bir emülgatördür. Ticari olarak temin edilen farklı PVA partilerinden hazırlanan nanopartiküllerde değişkenlik gözlemledik. Bu nedenle, tekrarlanabilirliği artırmak için mümkün olduğunca aynı PVA stokunun kullanılması önerilir. Kendi çalışmalarımızda, PVA'nın TPGS'den çok daha yüksek konsantrasyonlarda daha etkili bir emülgatör olduğunu saptadık (örneğin, DCM içinde 100 mg/ml PLGA'nın 2 ml %5 PVA içinde emülsifiye edilmesi durumunda 140 nm±48 çap).

Ekipman ve görüntüleme süreci arasındaki farklılıklar nedeniyle nanoparçacıkların SEM ile karakterize edilmesi zorlayıcı olabilir. Bu nedenle, parçacık oluşumuyla ilgili sorunlara işaret eden morfolojik özellikler ile görüntüleme sırasında istem dışı olarak ortaya çıkan artefaktları birbirinden ayırt etmek önemlidir. SEM görüntülerinde bazen parçacıklarda birleşme (Şekil 4a ve 4b), çukurlaşma (Şekil 4c) veya çatlama (Şekil 4f) gözlemlenir. Bu artefaktlar bazen kötü oluşmuş parçacıklara işaret eder (örneğin Şekil 4a'da, emülgatör konsantrasyonu ayrı parçacıklar oluşturmak için çok yüksekti) ancak karakterizasyon yönteminin neden olduğu artefaktlardan da kaynaklanabilir (örneğin Şekil 4b'de, numune sputter kaplama sırasında ısınmış ve Şekil 4c'de, SEM demetinden kaynaklanan yerel ısınma görüntüleme sırasında parçacıkların yüzey morfolojisini değiştirmiştir). Görüntüleme artefaktlarını önlemek için sputter kaplama süresi minimize edilmeli ve demet gücü düşük tutulmalıdır. Daha uzun sputter sürelerinde daha pürüzsüz morfolojiler gözlemlenir, ancak bu durum parçacıkların birleşmesine yol açabilir. Çok kısa olan sputter süreleri, parçacıkların yüklenmesi ve görüntü yakalama sırasında hareket etmesi nedeniyle görüntülemeyi zorlaştırabilir. Görüntülerin hızlı bir şekilde yakalanması, uzun süreli demet maruziyetini ve görüntülerin bozulmasını önlemeye yardımcı olacaktır (Şekil 4d ve 4e). Yüksek demet maruziyeti ayrıca nanoparçacık yüzeyinin genişlemesi ve çatlamasıyla sonuçlanabilir (Şekil 4f). Eğer morfoloji artefaktları karakterizasyon parametreleri değiştirilerek minimize edilemiyorsa, bunların nanoparçacıkların kendileriyle ilgili gerçek sorunları temsil etmesi mümkündür. Üretim sürecinde birleşme; yüksek ultrasonikasyon gücü nedeniyle aşırı ısınma, çözücünün tam olarak buharlaşmaması, yıkama aşamasında eksik resüspansiyon veya başarısız liyofilizasyondan kaynaklanabilir.

Yağ ve su ayırma işlemi; sonikasyon, evaporasyon, toplama; liyofilizasyon diyagramı.
Şekil 1. Nanopartikül üretim şeması. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Nanopartikül yapısı (SEM) ve boyut dağılımı (μm, nm), karşılaştırmalı analiz grafiği.
Şekil 2. Tek emülsiyon yöntemiyle üretilen PLGA mikropartikül ve nanopartiküllerin SEM görüntüleri ve karşılık gelen boyut dağılımları. (A)'de, 1ml etil asetatta çözünmüş 100 mg PLGA'nın 2 ml %0,05 Vitamin E-TPGS içinde emülsifiye edilmesi ve 45 ml %0,01 Vitamin E-TPGS içinde sertleştirilmesiyle partiküller oluşturulmuştur. Karşılık gelen boyut dağılımı (C)'de gösterilmektedir. (B)'de, 4mL etil asetatta çözünmüş 200 mg PLGA ve 40mg kamptotesinin 4 ml %0,3 Vitamin E-TPGS içinde emülsifiye edilmesi ve 90 ml %0,3 Vitamin E-TPGS içinde sertleştirilmesiyle partiküller oluşturulmuştur. Karşılık gelen boyut dağılımı (D)'de gösterilmektedir. Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

Partikül boyutu analizi; sütun grafiği ve SEM görüntüleri, TPGS %'sinin mikroküre boyutu üzerindeki etkisini göstermektedir.
Şekil 3. Partikül boyutu emülgatör konsantrasyonuna bağlıdır. Vitamin E-TPGS konsantrasyonunun artırılması daha küçük nanopartiküllerle sonuçlanmıştır. 1 ml etil asetat içinde çözünmüş 100 mg PLGA'nın (A) %0,01, (B) %0,05, (C) %0,1 veya (D) %0,3 Vitamin E-TPGS içinde emülsifiye edilerek hazırlandığı ve 45 ml %0,3 Vitamin E-TPGS içinde sertleştirildiği partiküllerin ortalama çapları ve ilgili SEM görüntüleri gösterilmiştir. Hata çubukları, tek bir partiden alınan 2 görüntü üzerinden yapılan 200 çap ölçümünün standart sapmasını temsil etmektedir. Ölçek çubuğu (A-C) 5 μm ve (D) 200 nm'yi temsil eder.Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

Partikül morfolojisini ve agregasyonu gösteren SEM mikrografı. Toz mikro yapı analizi.
Şekil 4. SEM ile gözlemlenen yüzey morfolojisi artefaktları. (A) panelinde, tüm numune boyunca yoğun kaynaşmalar ve tabaka benzeri yapılar mevcuttur. Vitamin E-TPGS konsantrasyonu, ayrı partiküller oluşturmak için çok yüksekti (%1). (B) panelinde, numunenin bazı bölgeleri kaynaşmış olsa da, özellikle sputter kaplama boşluklarının olduğu yerlerde ayrı nanopartiküllerden oluşan geniş bölgeler mevcuttu. Bu kaynaşma artefaktlarının sputter kaplama işlemi sırasındaki ısınmadan kaynaklandığına inanıyoruz. (C) panelinde partiküller başlangıçta pürüzsüz görünmüş, ancak numunenin SEM demetine uzun süre maruz kalması çukurlaşma ve kırışıklıklara yol açmıştır. (D) paneli, numunenin SEM demetine minimum düzeyde maruz bırakıldığı düşük çözünürlüklü bir görüntü göstermektedir; partiküller yuvarlak bir morfoloji ile pürüzsüz görünmektedir. (E) panelinde, aynı numune daha uzun süre maruz bırakılmış ve orijinal morfolojilerinin belirgin bir şekilde bozulduğu gözlemlenmiştir. (F) panelinde, yüksek voltaj ayarında (12 kV) uzun süreli demet maruziyeti partiküllerde ısınma ve çatlamaya neden olmuştur. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Tartışma

PLGA partikülleri genellikle boyut, kapsülleyici ve yüzey özellikleri gibi partikül özelliklerini özelleştirme yeteneği sağlayan bir yöntem olan tek veya çift emülsiyon ile hazırlanır7. Bu özellikler ve diğerleri, çözücü tipi, besleme oranları, emülsifikasyon yöntemi ve emülgatör tipi dahil olmak üzere birçok değişkene bağlıdır. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, tek bir deneycinin tutarlı özelliklere sahip parçacıklar üretmesi mümkündür. Aynı protokolü kullanarak, iyi eğitimli bir deneyci, aşağıdaki ortalama çaplara sahip yedi ayrı nanopartikül partisi üretti: 317 nm±99, 342 nm±112, 298 nm±104, 361 nm±110, 339 nm±115, 360 nm±123 ve 364 nm±110. İyi eğitimli deneycinin partilerinin ortalamasının alınması, ortalama 340 nm±25 çap ve 110 nm±8'lik parti içi ortalama standart sapma verir. İlki tarafından eğitilen ikinci bir deneyci, ortalama çapı 328 nm±138 olan nanopartiküller üretmek için aynı protokolü kullandı. Bununla birlikte, birkaç aydır bağımsız olarak nanopartiküller yapan üçüncü bir deneyci, ortalama 220 nm±70 çapında nanopartiküller üretmek için aynı protokolü izledi. Böylece, beklenen bir çap aralığına sahip parçacıklar yapmak mümkündür, ancak bu, ince deneysel tekniğin tam olarak kopyalanmasına bağlıdır. Partilerin havuzlanması, aynı agrega özelliklerine sahip büyük miktarlarda nanopartiküllerin üretilmesini sağlayabilir. Örneğin, in vitro veya in vivo çalışma için nanopartiküllerin yüzeyini değiştirdiğimizde, birden fazla (6'ya kadar) 200 mg'lık parti hazırlanır, yıkanır, toplanır, tek bir tüpte karıştırılır ve daha sonra yüzey modifikasyonu için bölünür. Bu, nanopartikül boyutunun, ilaç yüklemesinin, yükün ve modifikasyon için mevcut yüzey bölgelerinin fraksiyonunun iki tedavi grubu arasında karşılaştırılabilir olmasını sağlar. Başka bir örnekte, ilgilenilen değişken, farklı ajanların farklı nanopartikül partilerine yüklenmesiyle ilaç etkinliği ise, ilaç yüklemesindeki değişkenliği ölçmek ve kontrol etmek önemlidir. Üretilen her partikül partisi için partikül özelliklerinin ölçülmesi ve partiden partiye değişkenliği kontrol etmek için deneylerin tasarlanması ve çoğaltılması kritik öneme sahiptir.

Organik ve sulu fazların tam emülsiyonu, küçük parçacıkların oluşturulması için kritik öneme sahiptir. Poli(vinil alkol) (PVA) belki de en yaygın kullanılan emülgatördür. Biz ve diğerleri, E-TPGS9, PVA14, spans15 ve poloksamerler16 vitamini dahil olmak üzere çeşitli emülsifiye edici ve stabilize edici ajanlar kullandık (PLGA partiküllerinin üretimi için kullanılan çok çeşitli ajanların kapsamlı bir şekilde tartışılması için, Wischke ve diğerleri tarafından yapılan incelemeye bakın.17). Düzgün emülsifiye edilmiş polimer, homojen, süt beyazı/opak bir çözelti olarak görünecektir. Zayıf (veya "kırık") bir emülsiyon, makroskopik heterojenlik veya taneciklilik gösterecektir ve hatta tüpte görsel olarak farklı iki katmana ayrılabilir. Bu genellikle nanopartiküllerin oluşmadığını gösterir. Emülsiyon, ultrasonicator'a hemen aktarılmazsa adım 1.9'dan sonra kırılabilir. Bu meydana gelirse, homojen olana kadar tekrar girdap yapın ve hemen sonikatöre geçin. Sonikasyon adımını (1.10) takiben ayrılma gerçekleşmemelidir. Parçacıklar daha büyük bir sulu hacme dağıldıktan sonra (adım 1.11), çözelti düzgün bir şekilde opak ila hafif yarı saydam olmalıdır. Parçacık boyutu küçüldükçe yarı saydam kalite artacaktır ve çok küçük nanoparçacıklar için mavi bir renk tonu gözlemlenebilir. Parçacıklar bir ilacı kapsüllüyorsa bu renk tonu gözlemlenmeyebilir. Emülsiyon büyük sulu hacme eşit olarak dağılmazsa veya granüler görünüyorsa, deney devam etmemelidir. Parçacık peletinin görünümünde ve kohezyonunda bazı farklılıklar gözlemlemek normaldir. Bazı peletler hafif girdap üzerine yeniden süspanse edilebilirken, diğerleri birkaç dakika su banyosu sonikasyonu alabilir. Yeniden süspansiyon 5 dakikadan uzun sürmemelidir. Liyofilize parçacıklar, pamuğa benzerden serbest akışlıya kadar çeşitli dokular alabilir.

Bir nanopartikül malzemesi olarak PLGA'nın birçok avantajından biri, amaçlanan uygulama için istenen boyutta partikül oluşturmak üzere üretim sürecini optimize etme yeteneğidir. Daha büyük nanopartiküller, küçük nanopartiküllerden daha yüksek bir hidrofobik ilaç fraksiyonunu (polimerin ağırlığına göre) kapsülleyecektir, ancak ilaç salım kinetiği deetkilenebilir 18-20. Nanopartiküllerin boyutu, hücreler tarafından partikül içselleştirme mekanizmaları ve bunların dokudaki dağılımı üzerinde doğrudan bir etkiye sahiptir ve bu da dağıtım etkinliğinde dramatik farklılıklara neden olabilir. Örneğin, mononükleer fagosit sistemi, sistemik dolaşımdaki 1 μm'den büyük ajanları etiketleyecek ve uzaklaştıracaktır. Küçük nanopartiküller, daha büyük nanopartiküllerin sıkı hücre dışı matriste tutulacağı beyne doğrudan infüzyon için ilgi çekici olabilir; Küçük nanopartiküllerin verilmesi, gelişmiş geçirgenlik ve tutma etkisi yoluyla tümörlerin pasif olarak hedeflenmesini de kolaylaştırabilir. İlaç kapsülleme etkinliği, spesifik ilacın özelliklerine, partikülün boyutuna ve emülgatöre (yani çözücüye karşı sudaki çözünürlüğüne) bağlı olarak büyük ölçüde değişir. Tek ve çift emülsiyon, ilaç yüklemesini ve nanopartikül boyutunu da etkileyecektir. Hidrofobik ajanların tek emülsiyon yoluyla kapsüllenmesi, çift emülsiyon yöntemine kıyasla ultra küçük nanopartiküllerin üretimine yardımcı olabilir. Okuyucuyu bu konunun kapsamlı bir şekilde tartışılması için diğer kaynaklara yönlendiriyoruz23-28. Son olarak, yüksek hızlı homojenizasyon dahil olmak üzere alternatif emülsifikasyon yöntemleri mevcuttur ve bu diğer yaklaşımlar, belirli ilaç türleri veya ilaç dağıtım uygulamaları için avantajlar sağlayabilir29.

Tek emülsiyon yöntemi, her biri nanopartikül özelliklerini değiştirebilen çok çeşitli formülasyon değişkenlerinin varyasyonu için bir fırsat sunar. Örneğin, bunun yerine çözücü olarak diklorometan (DCM) kullanmak, genellikle daha geniş bir boyut dağılımına sahip daha büyük nanopartiküller üretecektir. Etil asetat (EtAc) suda karışabildiğinden, birincil emülsiyondaki polimer damlacığının yüzey gerilimi azalır ve daha küçük nanopartiküller üretilir. DCM, aynı hacimdeki EtAc ile ikame edilebilir. İlaç kapsüllemesini ve partikül özelliklerini optimize etmek için alternatif çözücüler veya çözücü karışımları kullanılabilir. Diğer formülasyon parametreleri de partikül boyutunu değiştirebilir: örneğin, artan çözücü hacmi, çözücü: polimer oranı, sonikasyon yoğunluğu veya santrifüjleme hızı / süresi, toplanan parçacıkların boyutunda bir azalmaya neden olacaktır. Sıralı santrifüjleme (örneğin, önce daha büyük parçacıkları çıkarmak için hızlı, düşük hızlı bir santrifüjleme, ardından ultra küçük parçacıkları toplamak için daha uzun bir döndürme) veya filtreleme gerçekleştirerek parçacıkları parçalara ayırmak mümkündür.

Burada, ortalama çapları 220 nm ila 1.98 μm arasında değişen PLGA partiküllerinin hazırlanmasını sağlayan formülasyon parametrelerini açıklıyoruz. PLGA'dan oluşan partiküllerin üretilmesine yönelik bu yöntemler, in vitro veya in vivo gelecekteki ilaç dağıtım uygulamaları için partikül tasarımını (boyut, kapsülleyici ve yüzey özellikleri) optimize etmek için kullanılabilir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarların herhangi bir teşekkür belgesi bulunmamaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Poly(laktik ko-glikolik asit)  (PLGA)figure-materials-1 LactelB6010-2Pİçsel Viskozite: 0.55-0.75 dl/g
Etil asetat (EtAc)Sigma270989
Metilen klorür (DCM)
Vitamin E TPGSSigma57668
Poly(vinil alkol)%87-89 hidrolize, 30,000-70,000 Da
Ekipman
Sonik ParçalayıcıFisher ScientificModel 705700 W (Ultrasonikatör)
Sonikatör ucuFisher Scientific1/8 in
VorteksleyiciVWR58816-121
Çok pozisyonlu karıştırıcıCorningMP5I
UltrasantrifüjBeckman-CoulterL8-80M
Sabit açılı rotorBeckman-Coulter50.2TI
Su banyolu sonikatörFisher ScientificFS30
LiyofilizatörMillrockBT85

Kaynaklar

  1. Peer, D., et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat. Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).
  2. Jiang, W., Gupta, R. K., Deshpande, M. C., Schwendeman, S. P. Biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles for injectable delivery of vaccine antigens. Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 391-410 (2005).
  3. Haag, R., Kratz, F. Polymer therapeutics: Concepts and applications. Angew. Chem. 45, 1198-1215 (2006).
  4. Tong, R., Cheng, J. Anticancer polymeric nanomedicines. Polym. Rev. 47, 345-381 (2007).
  5. Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surf. B Biointerfaces. 75, 1-18 (2010).
  6. Anderson, J. M., Shive, M. S. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).
  7. Jain, R. A. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices. Biomaterials. 21, 2475-2490 (2000).
  8. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: An overview of biomedical applications. J. Control. Rel. 161, 505-522 (2012).
  9. Mu, L., Feng, S. S. A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS. J. Control. Rel. 86, 33-48 (2003).
  10. Mu, L., Feng, S. S. PLGA/TPGS nanoparticles for controlled release of paclitaxel: effects of the emulsifier and drug loading ratio. Pharm. Res. 20, 1864-1872 (2003).
  11. Collnot, E. M., et al. Vitamin E TPGS P-glycoprotein inhibition mechanism: influence on conformational flexibility, intracellular ATP levels, and role of time and site of access. Mol. Pharm. 7, 642-651 (2010).
  12. Dintaman, J. M., Silverman, J. A. Inhibition of P-glycoprotein by D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS). Pharm. Res. 16, 1550-1556 (1999).
  13. Zhou, J., et al. Highly-penetrative, drug-loaded nanocarriers improve treatment of glioblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. , (2013).
  14. Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The uptake and intracellular fate of PLGA nanoparticles in epithelial cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
  15. Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Nohara, M., Kawashima, Y. Biodegradable submicron carriers for peptide drugs: Preparation of dl-lactide/glycolide copolymer (PLGA) nanospheres with nafarelin acetate by a novel emulsion-phase separation method in an oil system. Int. J. Pharm. 121, 45-54 (1995).
  16. Ameller, T., et al. Polyester-poly(ethylene glycol) nanoparticles loaded with the pure antiestrogen RU 58668: physicochemical and opsonization properties. Pharm. Res. 20, 1063-1070 (2003).
  17. Wischke, C., Schwendeman, S. P. Principles of encapsulating hydrophobic drugs in PLA/PLGA microparticles. Int. J. Pharm. 364, 298-327 (2008).
  18. Batycky, R. P., Hanes, J., Langer, R., Edwards, D. A. A theoretical model of erosion and macromolecular drug release from biodegrading microspheres. J. Pharm. Sci. 86, 1464-1477 (1997).
  19. Panyam, J., et al. Polymer degradation and in vitro release of a model protein from poly(D,L-lactide-co-glycolide) nano- and microparticles. J. Control. Rel. 92, 173-187 (2003).
  20. Siepmann, J., Faisant, N., Akiki, J., Richard, J., Benoit, J. P. Effect of the size of biodegradable microparticles on drug release: Experiment and theory. Journal of Controlled Release. 96, 123-134 (2004).
  21. Desai, M. P., Labhasetwar, V., Walter, E., Levy, R. J., Amidon, G. L. The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent. Pharm. Res. 14, 1568-1573 (1997).
  22. Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Mol. Pharm. 5, 505-515 (2008).
  23. Barichello, J. M., Morishita, M., Takayama, K., Nagai, T. Encapsulation of hydrophilic and lipophilic drugs in PLGA nanoparticles by the nanoprecipitation method. Drug Dev. Ind. Pharm. 25, 471-476 (1999).
  24. Mundargi, R. C., Babu, V. R., Rangaswamy, V., Patel, P., Aminabhavi, T. M. Nano/micro technologies for delivering macromolecular therapeutics using poly(d,l-lactide-co-glycolide) and its derivatives. J. Control. Rel. 125, 193-209 (2008).
  25. Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Kunou, N., Kawashima, Y. Preparations of biodegradable nanospheres of water-soluble and insoluble drugs with D,L-lactide/glycolide copolymer by a novel spontaneous emulsification solvent diffusion method, and the drug release behavior. J. Control. Rel. 25, 89-98 (1993).
  26. Yang, Y. Y., Chia, H. H., Chung, T. S. Effect of preparation temperature on the characteristics and release profiles of PLGA microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method. J. Control. Rel. 69, 81-96 (2000).
  27. Yang, Y. Y., Chung, T. S., Ping Ng, N. Morphology, drug distribution, and in vitro release profiles of biodegradable polymeric microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method. Biomaterials. 22, 231-241 (2001).
  28. Zhang, Z., Feng, S. S. The drug encapsulation efficiency, in vitro drug release, cellular uptake and cytotoxicity of paclitaxel-loaded poly(lactide)-tocopheryl polyethylene glycol succinate nanoparticles. Biomaterials. 27, 4025-4033 (2006).
  29. Astete, C. E., Sabliov, C. M. Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 247-289 (2006).
  30. Gaumet, M., Gurny, R., Delie, F. Fluorescent biodegradable PLGA particles with narrow size distributions: Preparation by means of selective centrifugation. Int. J. Pharm. 342, 222-230 (2007).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tekli Em lsiyonTaramal Elektron MikroskobuPartik l Boyutu KontrolEm lgat r KonsantrasyonuSantrif j Y kamaLiyofilizasyon SaklamaHidrofobik la Enkaps lasyonu

İlgili makaleler