Yöntem makalesi

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

DOI:

10.3791/51044

⸱

3 Ekim 2014

 ,  , 
1School of Engineering, University of California, Merced

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karmaşık dokunun son derece organize yapılarının oluşturulması için, birden fazla materyal ve hücre tipini entegre bir kompozitte bir araya getirmek gerekir. Bu kombinatoryal tasarım, güçlü bir fibröz matris tabanı içeren iki farklı biyolojik olarak türetilmiş materyal ve yeni damar oluşumunu arttırmak için endotel hücreleri ile organa özgü katmanlı hücre tabakalarını içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böyle yetişkin insan kalpleri gibi birçok dokular, yeterince hasar sonra yeniden edemiyoruz. Doku mühendisliği 2,3 Stratejileri kurtarma ve tamir vücut yardımcı yenilikler öneriyoruz. Örneğin, TE yaklaşımlar miyokard infarktüsü (MI) sonrası kalp biçimlenme zayıflatır ve muhtemelen normale yakın ön-MI düzeyine toplam kalp fonksiyonunu artırmak mümkün olabilir. 4, kalp dokusu başarılı rejenerasyon doğru teslimini içeren herhangi bir fonksiyonel doku gibi implante hücre / doku greft entegrasyonu ve hayatta lehine çevre ipuçları ile birden fazla hücre tipleri. Verme araçları, hücre hayatta kalması üzerindeki etkileri, malzeme mukavemeti, ve hücre-doku organizasyon kolaylaştırılması olarak değerlendirildiğinde çözünür sinyalleri, hücre-hücre etkileşimleri ve matris malzemeleri: İşlenmiş dokular da dahil olmak üzere, birden çok parametre yönelik olmalıdır. Greft hücreleri doğrudan enjeksiyon sadece bu temel unsurlarını görmezden istihdam Çalışmaları. 2,5,6Bu malzemelerle birleştirerek bir doku tasarım henüz geliştirilecek gelmiştir. Burada, "doku" olarak yeni damar oluşumunun arttırılması için hedef organ, hücre tipi ve endotelial hücreleri içeren biyolojik şekilde türetilmemiş malzemelerden iki ayrı tip desenli hücre tabakaları perdelenmesini kullanarak entegre tasarımlarının bir örnek sunulmuştur. Bu çalışmalar kalp-benzeri doku nesil odaklanmış olsa da, bu doku tasarım, minimal tasarım ve malzeme değişiklikleri ile kalp daha başka birçok organ uygulanabilir ve rejeneratif tedaviler için bir off-the-raf ürünü olması gerekiyordu. Protokol beş ayrıntılı adımlar içermektedir. Bir ısıya duyarlı Poli (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) kat doku kültür tabaklarına kullanılır. Daha sonra, doku spesifik hücreler, güçlü bir yan yapışıklığı hücre tabakaları meydana getirmek üzere kaplanmış plakalar / mikrodesenlerle yüzeylerin yüzeyi üzerinde kültürlenmiştir. Üçüncü olarak, bir taban matris neovasküler üreti gözenekli bir matris ile birleştirerek dokusu oluşturulurhidrojeller ve endotel hücreleri ettik. Son olarak, hücre tabakaları pNIPAAM kaplı kaplar kaldırılır ve komple yapı yapım taban elemanına transfer edilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerin ve/veya tek materyallerin enjeksiyonu tek başına diğer organ sistemlerinde değişken başarı ve kardiyak rejenerasyonda sınırlı başarı göstermiştir. 5,7-12 Şu anda, kök hücre türevli hücreler, dokuya doğrudan hücre enjeksiyonu ve kan kaynağına perfüzyon dahil olmak üzere çeşitli dağıtım yöntemleri kullanılarak hasarlı dokuya verilmektedir. 13-17 Diğerleri, hasarlı organların yenilenmesine yardımcı olmak için tek başına hücreler, tek başına materyaller ve/veya materyal taşıyıcılarla kombinasyon halinde implante etmişlerdir. 18-21 Bu tasarım, malzeme mukavemeti, çoklu malzemelerde desenleme ve çoklu hücre tipleri sağlayan çoklu stratejileri birleştirir.

Özellikle, baz hücrelileştirilmiş fibröz matris, yapıya temel fiziksel gücü sağlar ve gerekirse hastaya dikmek için uygun hale getirir. Baz matrisindeki boş alanlar, implante edilen yapının hızlı bir şekilde vaskülarizasyonunu sağlamak için neovasküler izin veren bir hidrojel22 içindeki endotel hücreleri ile doldurulur. Bu kompozit daha sonra, hücreden hücreye iletişimin geliştirilmesine izin veren, doğal dokuyu daha yakından taklit eden önceden modellenmiş hücre tabakaları ile entegre edilir. 1,23-25 Katmanlı hücresel yama için genel üretim süreci, Şekil 1'deki akış şeması ile özetlenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PNIPAAM kaplı Tabaklar 1. Yaratılış

  1. % 60 toluen /% 40 heksan solüsyonu 2 ml pNIPAAM arasında 2.6 g çözülür.
  2. PNIPAAM çözünene kadar karıştırılır, 10 dakika boyunca 60 ° C'ye kadar karışım ısıtılır.
  3. Büchner hunisi bir 60 mm çapında bir daire ve bir yerde kağıt içine filtre kağıdı kesin.
  4. Önceden tartılmış bir cam kabın içine Buchner hunisinden çözeltisi (heksan plastikleri eritmemesi gibi, plastik kullanmayın) filtre.
  5. Bir çan vakum (24 psi) O / N (16 saat) içine kabını ve içeriğini yerleştirin. Not: Artık madde isopropil reaksiyona girinceye kadar çok oksijen ile temas olmadığından emin olmak oksitlenir.
  6. PNIPAAM ağırlığını tespit etmek için bir beher tartılır.
  7. Çözeltisi bir a / a 50/50 oluşturarak, pNIPAAM izopropil alkol ekleyin.
  8. UV ışığı altında 5 dakika boyunca doku kültür plakasının yüzeyinde çözeltisi ve ceket 2 ml yerleştirin.
  9. Katı iki kez sıcak PBS ile 2 ml plakayı yıkayınHücre kültürü için kullanmadan önce.

Hücre Sheets 2. Yaratılış

Not: hedef organ birincil hücrelerin hücre katların farklı bir dizi yöntem kullanılarak oluşturulabilir, ya da burada tarif edildiği gibi termo-duyarlı polimer ile doku kültür yüzeylerin kaplanması ile. Ön kaplanmış ısıya duyarlı plakaları, aynı satıcıdan tarafından sunulmaktadır.

Not: Bu protokol, 35 mm tabak kullanarak kültür içindir. Kısaca açıklamak gerekirse hücreler önce, bitişik hücreler arasında yanal bağlantı kurmak için birleşme noktasında 24 saat arasında, en az 37 ° C'de inkübe edilir. Hücre tabakaları açmak için, plakalar, 32 ° C'nin altındaki bir sıcaklıkta tabi tutulur. Hücre tabaka daha sonra, vasküler endotel hücreleri ile bir neovasküler hidrojel içeren izin veren güçlü baz lifli matrise transfer edilir.

  1. Hücre popülasyonu izole. Not: Bu yöntem, bireysel türev usul ve hücre tipine bağlıdır. Sıçan aorta ait yumuşak uSistemik lupus hücreleri (RASMC) bu örnekte kullanılmıştır. Bunlar, bir sıçan karın aortundan izole edilen primer düz kas hücreleridir.
  2. Sıcak 2 ml PBS ile hücreleri yıkayın.
  3. 5 dakika boyunca, hücrelere tripsin (ya da diğer molekül ayrılması / ayrışarak çözelti) 3 ml ilave edilir.
  4. % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren kültür ortamı ya da fosfat tampon solüsyonu (PBS) 3 ml tripsin ilave edilmesi ile inhibe eder.
  5. Konik bir tüp içinde hücreleri toplamak ve bir kısım sayısı.
  6. 5 dakika boyunca 1000 rpm'de (228 xg) hücreleri dönerler.
  7. Süpernatantı aspire ve büyüme ortamı hücreleri tekrar süspansiyon (SmGM2 artı mermi kiti kültür ortamı RASMC için kullanılır).
  8. 100% izdiham elde edileceği bir konsantrasyonda pNIPAAM kaplı plaka - 35 mm bir ısıya-duyarlı levha üzerindeki hücreleri ihtiva eden ortam yerleştirin. Not: RASMCs için bu sayı / cm2 100,000 hücre olduğu belirlenmiştir. Bu va Bununla birlikte, bağlı geçen boyunca hücrelerin kaybı,% 120 Lue kullanılır.
  9. 37 ° CO / N bir kuvöz içine yerleştirin. Not: levhaya hücre yapışmasını sağlamak için, 37 ° C'de hücreleri korumak için önemlidir.

Foundational Matrix 3. hazırlanması

Not: Çeşitli 3D lifli matrisleri hassas hücre tabakaları arasında güçlü bir elyaflı matris tabaka için kullanılabilir. Bazı örnekler: gelfoam, biyo-cam, doğal asellülarize malzeme 26 ya da nanospun malzeme 27,28 Bu çalışmalarda kullanılan domuz mesane matrisi (UBM) cömertçe ortak çalışan Dr Badylak sağlandı 29.

  1. Hücresizleştirilmiş matris kullanıldığında, hücresel içeriği olmaması da dahil olmak üzere matris özelliklerini belirlemek 27,28, hücre spesifik canlılığı ve boş hacim, Kullanımdan önce. 22
  2. Arzu edilen bir boyut ve şekil, önceden sterilize edilmiş matris kesin. Not: Burada, bir delik yumruk 4 mm çaplı daire kesmek için kullanılır.
ve_title "> 4. bir Neovasküler Hoşgörülü Hidrojeli içine Tohumculuk Endotel Hücreleri

Not: Endotel hücreleri, kök veya projenitör hücrelerinin farklılaşma dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan elde edilen edilebilir. Burada, HuVECler kullanılır.

  1. Çapraz bağlama süresi olduğu sürece herhangi bir geçirgen hidrojel (fibrin, kolajen jeli) kullanarak canlı hücreler kalmak izin verecek kadar kısadır. Not: Burada, Hiyalüronan (HA) bazlı bir jel, bir disülfid köprüsü ile birlikte kullanılan çapraz bağlanmış olabilir.
  2. Işletme protokolüne uygun olarak HA hidrojel hazırlayın.
  3. Endotel hücrelerini toplamak ve 1x tripsin kullanılarak, tek bir hücre çözeltisi içine dağılırlar. Not: Accutase ya da hücre ayırma tamponu, aynı zamanda, tek bir hücre dağılımı için kullanılabilir.
  4. Ya da PBS içinde% 10 FBS çözelti / 15 ml konik bir tüp hücre toplanmasını içerir (bu hücrelerin serumu ile temas etmemesi çok önemlidir ise) soya fasulyesi tripsin inhibitörü eşit miktarda kullanılarak tripsin enzimi devre dışı bırakır.
  5. Chücreleri ount ve yama boyutları için gerekli hacmini hesaplamak (daha önce sayısal). Not: 4 mm yama için, buraya 2.000.000 endotel hücreleri kullanılır.
  6. 2 milyondan hücreleri Özü ve yeni bir 15 ml konik tüp içine yerleştirin.
  7. 5 dakika boyunca (228 xg) dönerler.
  8. Bir konik bir tüp içinde bir pelet gibi hücreleri bırakarak, süpernatan aspire.
  9. 1 oranından: 1, HA ve jelatin sıvı malzeme karıştırın. Daha sonra pelet içeren konik tüp içine, toplam hacmin% 80 ekleyin.
  10. 1, HA / Jelatin karışımı: 1 endotel hücrelerinin yeniden süspanse
  11. Kademe 2 de elde baz lifli matris içine HA / Jelatin karışımı içinde süspansiye edilmiş hücreler yerleştirin.
  12. Çapraz bağlayıcının istenen toplam hacminin 1/5 (yüzde 20) ilave
  13. 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin.

Hücre Sheets 5. İzolasyon

  1. Bir hücre kültür kaput bekletildi ve yerden hücreleri ihtiva eden 35 mm pNIPAAM-işlemden geçirilmiş olan levhalarda kaldırRT.
  2. Hızlı bir şekilde hücrelerden ortam havalandırın, ve 37 ° C'ye ısıtılmış olan% 6, normal jelatin 2 ml ekleyin.
  3. Jelatin hala sıcak iken, normal jelatin (Film 1) yüzeyinin altına daldırılması, jelatin içine metal kafes yerleştirin.
  4. Jelatin sertleşmesine izin 5-7 dakika boyunca buz üzerine tüm plaka koyun.
  5. 7 dakika sonra, dikkatli bir şekilde levhanın yan kenarları jelatin ayırmak için bir ıspatula kullanarak ve daha sonra plaka Not metal kafes kaldırmak için forseps kullanımı:% 6 jelatin ve hücre yapraklan çıtalı kaldırmalıdır.
  6. Çanak hücre tabakasını taşı ve dikkatli bir yapının üzerine kafes ayarı, baz lifli matris, hidrojel kombinasyonunun üzerine yerleştirin. Not: hücre tabakanın tepe tarafı hala en üst konumunda olacaktır.
  7. Sıcak ortamda (37 ° C) 2 ml ekleyin.
  8. O / N, hidrojel yüzeyine yapışma hücrelerinin Ön izin inkübe edin.
  9. T kaldırÇözelti (yaklaşık 1 saat), ya da bir sonraki gün ısındıktan sonra o, metal kafes.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akış diyagramıdır (Şekil 1) çok tabakalı yama yapılması için genel bir yöntem gösterir. Hücre levhalar 32 ° C'nin altında bırakarak pNIPAAM tedavi plaka ayrılmaktadır. Daha sonra hücre tabakası altta uzanan elyaflı matrisi (Şekil 1) içine ekildi endotel hücreleri içeren çapraz bağlanmış hidrojel üstüne yerleştirilir. Önceden işlem görmüş ısıya duyarlı Levhalar, aynı zamanda, hücre tabakaları oluşturmak için kullanılabilir. Özel topolojik yüzeyler, özellikle model 30 hücreleri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolde kritik adımlar şunlardır: thermoresponsive polimer ile levha yüzeylerinin kaplanması ve plakaların soğutulduktan sonra hücre tabakalan manipüle. Farklı hücrelerin farklı fiziksel özellikler sergiler, çünkü yapışkanlık gibi, kaldırma zaman her bir farklı bir hücre tipi için optimize edilmelidir. Bu protokolün ikinci ve en önemlisi zorlu bileşeni, hücre zarının, doku montaj yöntemleri eleştirel bir yönü manipülasyon merkezleri. Hücre sayfasındaki tek hücre tabakası oldukça kırılgan ve forseps ile manipüle bile ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, California Rejeneratif Tıp Enstitüsü'nden (CIRM; RN2-00921-1), NIH tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Ödülü (F32-HL104924) ve CIRM Eğitim Bursu (TG21163). Materyaller şu kişiler tarafından sağlandı: Glycosan Biosystems Inc / BioTime ve Dr. Stephen Badylak (Pittsburgh Üniversitesi)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reagents
Calcein-InvitrogenC3099Hücre izleyici / canlı boya
Lysotracker RedInvitrogenL7528Hücre izleyici
Nötr KırmızıSigmaN7005Görünür Hücre boyası
pNIPAAMSigma Aldrich412780250Poli(N-izopropilakrilamid)
ToluenSigma Aldrich244511-1L
HekzanSigma Aldrich296090-1L
RAOSMCLonzaR-ASM-580Sıçan Aort Düz Kas Hücreleri
SmGM2LonzaCC-4149Düz Kas Ortamı
HUVECInvitrogenC-003-5Cİnsan Venöz Endotel Hücreleri
HyStemGlikozan / Biotime
İzopropil alkolVWR InternationalBDH1133-4LP
TripsinCorning Cellgro25-053-C1
PBSGibco14287-072
FBSGibco16140-071
Specific Equipment
Filtre kağıdıAhlstrom 6310-0900 
Buchner Hunisi Sigma Aldrich Z247308 
UpCell Plakaları Nunc 2014-11 
UV ışığıJelight Şirketi UVO Temizleyici Model No.42

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ohashi, K., Okano, T. Functional tissue engineering of the liver and islets. Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).
  2. Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey. Mat Sci Eng R. 59, 1-37 (2008).
  3. Jakob, P., Landmesser, U. Current status of cell-based therapy for heart failure. Curr Heart Fail Rep. 10, 165-176 (2013).
  4. Tongers, J., Losordo, D. W., Landmesser, U. Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges. Eur Heart J. 32, 1197-1206 (2011).
  5. Etzion, S., et al. Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 33, 1321-1330 (2001).
  6. Masuda, S., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering for heart tissue repair. Adv Drug Deliv Rev. 60, 277-285 (2008).
  7. Koh, G. Y., Soonpaa, M. H., Klug, M. G., Field, L. J. Strategies for myocardial repair. J Interv Cardiol. 8, 387-393 (1995).
  8. Li, R. K., et al. Construction of a bioengineered cardiac graft. J Thorac Cardiovasc Surg. 119, 368-375 (2000).
  9. Muller-Ehmsen, J., et al. Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function. Circulation. , 105-1720 (2002).
  10. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. , 100-193 (1999).
  11. Roell, W., et al. Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury. Circulation. 105, 2435-2441 (2002).
  12. Soonpaa, M. H., et al. Potential approaches for myocardial regeneration. Ann N Y Acad Sci. 752, 446-454 (1995).
  13. Akins, R. E. Can tissue engineering mend broken hearts. Circ Res. 90, 120-122 (2002).
  14. Goodell, M. A., et al. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. Ann N Y Acad Sci. 938, 208-218 (2001).
  15. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  16. Murry, C. E., Wiseman, R. W., Schwartz, S. M., Hauschka, S. D. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest. 98, 2512-2523 (1172).
  17. Orlic, D., et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci. 938, 221-229 (2001).
  18. Elia, R., et al. Silk-hyaluronan-based composite hydrogels: a novel, securable vehicle for drug delivery. J Biomater Appl. 27, 749-762 (2013).
  19. Kai, D., et al. Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model. Acta Biomater. , (2014).
  20. Hong, H. J., et al. Tracheal reconstruction using chondrocytes seeded on a poly(l-lactic-co-glycolic acid)-fibrin/hyaluronan. J Biomed Mater Res A. , (2014).
  21. Serpooshan, V., et al. The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction. Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).
  22. Turner, W. S., et al. Cardiac tissue development for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial and cardiac cells in natural matrices. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 2060-2072 (2012).
  23. Sato, M., Yamato, M., Hamahashi, K., Okano, T., Mochida, J. Articular cartilage regeneration using cell sheet technology. Anat Rec (Hoboken). 297, 36-43 (2014).
  24. Sawa, Y., Miyagawa, S. Present and future perspectives on cell sheet-based myocardial regeneration therapy. Biomed Res Int. 2013, 583912(2013).
  25. Demirbag, B., Huri, P. Y., Kose, G. T., Buyuksungur, A., Hasirci, V. Advanced cell therapies with and without scaffolds. Biotechnol J. 6, 1437-1453 (2011).
  26. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol Med. 17, 424-432 (2011).
  27. Badylak, S. F., et al. The use of extracellular matrix as an inductive scaffold for the partial replacement of functional myocardium. Cell Transplant. 15, Suppl 1. S29-S40 (2006).
  28. Wang, Y., et al. Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds. Hepatology. 53, 293-305 (2011).
  29. Gilbert, T. W., et al. Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix. Biomaterials. 29, 4775-4782 (2008).
  30. Luna, J. I., et al. Multiscale biomimetic topography for the alignment of neonatal and embryonic stem cell-derived heart cells. Tissue Eng Part C Methods. 17, 579-588 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tissue EngineeringCell SheetspNIPAAM CoatingFibrous Matrix HydrogelEndothelial CellsRat Aortic Smooth Muscle CellsLight MicroscopyCell Sheet TransferHydrogel CrosslinkingThermo Sensitive Polymer

İlgili makaleler