Yöntem makalesi

Pankreas Nöroplastisite benzetme:

9.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51049

⸱

14 Nisan 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Biotechnology, University of Applied Sciences Kaiserslautern/Zweibrücken

Bu makalede

Özet

Nöronal plastisite gastrointestinal (Gİ) sistem giderek tanınan, fakat yeterince anlaşılır bir özelliktir. Burada, insan pankreas bozuklukların örnekte, morfolojik ve fonksiyonel hem düzeyinde GI nöronal plastisite çalışma için, bir in vitro deneyi nöroplastisite mevcut.

Özet

Nöroplastisite patolojik koşullar altında, enterik sinir sistemi ve gastrointestinal (GI) innervasyonunun içsel bir özelliğidir. Ancak, GI bozuklukları nöroplastisitesi patofizyolojik rolü bilinmemektedir. Simülasyon ve GI nöroplastisitesi modülasyonu sağlayan yeni deneysel modeller gibi pankreas kanseri (PCA) ve kronik pankreatit (CP) olarak özellikle GI hastalıkların nöroplastisitesi katkısının gelişmiş takdir sağlayabilir. Burada, yeni doğan sıçan dorsal kök ganglionlar (DRG) ve myenterik pleksusu (MP) nöronlar kullanılarak in vitro koşullarda pankreas nöroplastisitesi simülasyonu için bir protokol mevcut. Bu çift-nöron yaklaşım hem organ içsel ve dışsal-nöroplastisite izlenmesini sağlar, ama aynı zamanda nöronal ve glial morfolojisi ve elektrofizyoloji değerlendirmek için değerli bir araç temsil değil sadece. Dahası, onların IMPAC eğitim için verilen microenvironmental içeriklerin fonksiyonel modülasyonu sağlarnöroplastisitesi t. Bir kez kurulan, mevcut nöroplastisite tahlil herhangi GI organ nöroplastisitesi çalışmaya uygulanabilir olma potansiyelini taşımaktadır.

Giriş

Gastrointestinal (Gİ) sinir morfolojisi ve yoğunluğu değişiklikler uzun bir süre için gastroenterolog ve patologlar dikkatini çekti, ama GI hastalıkların patofizyolojisi için kendi alaka 1-3 bilinmemektedir. Gerçekte, bu tür gastrit, reflüks yemek borusu iltihabı, kolit, divertikülit ve apandisit gibi birkaç derece yaygın GI hastalıkları, iltihaplı doku alanlarında 1 'de artan innervasyon yoğunluğuyla ilişkilidir. Ancak, gerçek bir ilgi kadar GI de mekanizmaları ve nöroplastisite anlamı ödenmiştir. Morfolojik değişmiş GI sinirler fonksiyon açısından, enterik sinir sisteminin normal devlet, yani normal bir GI sinirler farklı mı? Plastik enterik sinir değişmiş nöropeptid / nörotransmiter içeriği etkileri nelerdir? Periferik nöroplastisite her zaman merkezi sinir sistemi değişmiş sinyalizasyon gerektirmez mi? Ve nerede plastik kurtarmasına merkezi projeksiyonları vardırnsic GI sinir yolları? GI nöroplastisitesi fonksiyonel yönleri üzerinde bilgimizin azlığı bakarken gibi önemli soruların uzun bir dizi kolaylıkla oluşturulabilir.

Fonksiyonel düzeyde GI nöroplastisitesi çalışma, geçerli tekrarlanabilir ve hala kolayca uygulanabilir deneysel modeller gerektiriyor. Artan bir dönemde popülerlik ve bu vivo ortamlarda GDO'lu koşullu fare modelleri (GECoMM), kabulü gerçekçi bir şekilde 1 GI nöroplastisitesi önceden bilinmeyen yönleriyle aydınlatmak potansiyelini taşımaktadır. Ancak, GECoMM tasarım ve üretim, pahalı kalır emek-yoğun ve özellikle, zaman alıcıdır. Bundan başka, koşullu olarak genetik olarak değiştirilmiş fare (bağırsak epitel hücrelerinde sinir büyüme faktörü / NGF örneğin transgenik aşırı ekspresyonu) modüle edilecek hedefin önsel seçimi gerektirir. Bu nedenle, des içinBaşarılı bir GECoMM bir ign, araştırmacılar, bir değerli hedefin bazı göstergeler (örneğin önceki deneysel veri) gerekir (burada NGF) ilgilenilen molekül en az GI sinirler üzerinde bazı biyolojik ilgili etkiler yarattığı bekleniyor olabilir yani.

Bu tip göstergeler kolayca in vivo sistemin karmaşık mikro-izole edilmiş hücre alt tipi seçici bir heterotipik şekilde 4-7 kültüre edilebilir in vitro modellerde yeterli türetilebilir. Bir heterotipik kültür ortamda moleküler hedeflerin modülasyonu, daha hızlı, daha az ortalama teknik zahmetlidir ve bu nedenle in vivo çalışmalarda doğrulanması için değerli hedeflerin ön süzme yardımcı olabilir.

Son zamanlarda, intrapankreatik NE artan sinir yoğunluğu ve hipertrofisi taklit etmek için tasarlanmış bir in vitro deneyi nöroplastisite sunulmaktadırinsan pankreas kanseri (PCA) ve kronik pankreatit (CP) dokuları rves. Burada, yeni doğmuş fare dorsal kök ganglion (DRG) veya miyenterik pleksus (MP) türetilen nöronlar cerrahi olarak kesilmiş dokuları PCa ya da CP örneklerden doku özleri maruz kalmış ve normal insan pankreas (NP), doku ekstreleri 5 kültürlenmiş ile karşılaştırıldı. Bunun yerine, doku özleri, bir de nöroplastisitesi üzerine seçilen hücre türlerinin etkilerini incelemek için hücre hattı, üst fazlar kullanabilir. Standardize morfometrik ölçüm ile kombine edildiğinde, sunulan nöroplastisite tahlil farklı pankreas mikroçevrelerde yanıt nöronal plastisite geçerli ve tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar. Özel olarak, bu sağlayan nevrit dışa büyümesinin, desen ve nöronal dallanma boyutu, ve 2) fonksiyonel nöroplastisite, periferal sinir hücrelerinin uyarılabilirliğinin yani değişikler değişikliklerin, yani 1) morfolojik nöroplastisitesi simülasyon. Ayrıca, çevresel sadece (örn. Bağırsak) değil, aynı zamanda, merkezi (örn. DRG ya da ikinci derece spinal) nöronları farklı GI doku içeriğine morfolojik ve fonksiyonel reaksiyon değerlendirmek için, bu deneyde dahil edilebilir. Mevcut video ders, biz bu testin performans için teknik protokolünü göstermek ve avantajları ve zayıf yönlerini tartışmak. Ayrıca, herhangi bir GI organ nöroplastisitesi çalışmada bu testin temel kavramının uygulanabilirliğine dikkat çekmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Protokoldeki tüm hayvan deneysel prosedürleri Technische Universität München, Almanya'da hayvan bakım yönergeleri izleyin.

1.. Medya / Hazırlık Özü

  1. Doku homojenizasyon
    Doku homojenizasyonu kalitesi kültürlenmiş nöronlar içinde nöroplastik değişiklikler daha sonra tespit edilebilmesi için çok önemlidir. Burada, homojenleştirici doku sıcaklık önemli bir artış olmadan, doku ayrılmasını sağlayan önerilir.
    1. Aktarım 5 mm x 5 mm x 5 mm doğrudan doku homogenator bir katı fazda ve sıvı azot yerine -80 ° C ila pankreas dokusu küp. İdeal homogenator bu defreeze izin vermeden, yeterince hızlı doku ayırmak olacaktır.
    2. Hemen ayrıldıktan sonra, 0,1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 300-500 ul katı, toz-benzeri Homojenat yeniden süspanse edin. İşte, bu nöronlar lyse olabilir çünkü (örneğin RIPA'da gibi) herhangi bir lizis tampon kullanmayın.
    3. Bench santrifüj (örneğin 21.130 xg) maksimum hızı en az 15 dakika boyunca homojenatlarına santrifüj. Doku özü temsil berrak süpernatant toplayın.
  2. Hücre hattı süpernatanlan
    1. Normal bir büyüme ortamı içinde% 80 izdiham -, ilgi konusu hücreler, en az 70 ulaşmak olsun.
    2. Genellikle, bu medya serum bileşenlerini içeren ve nöronal büyüme üzerinde kontrol edilemeyen etkiler yapabilir. Bu nedenle, istenen hücre yoğunluğuna ulaştıktan sonra, hücre kültürü dereceli PBS ile en az 3 kere hücreleri yıkamak ve en fazla 48 saat boyunca serumsuz ortamda (SFM) yerleştirin.
      Not: Burada, (pankreas stellat hücreleri gibi) bazı hücreler normal durumunu ve yapısını korumak için kendi büyüme ortamı içinde serum gerekebilir düşünün. Bu gibi durumlarda, sağlam hücre functio için gerekli olası en düşük serum içeriği bulmak için ilgi hücrenin ortam içinde seri serum seyreltmeleri gerçekleştirmekn.
    3. Bradford protein deneyi ile doku ya da hücre homojenatının süpernatantların protein konsantrasyonu ölçülür. Bu değerler, doku ve hücre tipine bağlı olarak farklı olsa da, pankreas doku özleri için, tek bir 5-12 mg / ml arasında bir konsantrasyon aralığı beklemek ve 3-8 ug / ul arasında hücre hattı için yüzer olacaktır.

2.. Kısım özleri ve Hücre üst fazlan

Deneyde kullanılması için konsantrasyona bağlı olarak, nöronal ortam içinde özü veya yüzer nihai konsantrasyonu, 100 ug / ml 5,8 olmalıdır.

Not: nöronlar, 24 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna 500 ul ortam içinde büyüyen bir tahlil için, bir de başına her özü ya da süpernatanmdan proteinin 50 ug gerekmektedir. Yaklaşık 10 mg / ml bir konsantrasyonda, tipik özü, her bir oyuk için bir özü / yüzer 5 ul gerekir. Her setting, bir üç kopya olarak gerçekleştirilmiştir, bu özü / süpernatan 15 ul karşılık gelir. Farklı doku ya da hücre tipi için, son yüzer özü veya konsantrasyon seri seyreltileri yapmak ve farklı özü / yüzer konsantrasyonları arasında gözlenen nörotrofik etkilerinin karşılaştırılması.

Nöronlar 3. İzolasyonu

Extract / yüzer toplama bittiğinde, nöronların izolasyonu ile devam.

  1. DRG nöronlar için, doğum sonrası gün (P) 2-12 decapitation ve DRG stereomicroscopic diseksiyonu (Şekil 1A) sonra yenidoğan sıçanların DRG'yi lomber servikal toplamak. , 24-delikli plaka için yeterli DRG nöronlarını sahip plaka başına (52 DRG eşit), bir yeni doğmuş sıçan DRG lomber tüm servikal toplamak için.
    1. Microscissors vasıtasıyla periferik (sinirsel) ve DRG merkezi projeksiyonlar (kök) kesip.
      Yerinde projeksiyonlar bırakmak öğütülmesinden engeller ve t artırırO fibroblastlar tarafından kültür riskini kontamine.
  2. MP nöronlar için, elle ince bağırsak ve gelen mezenteri kesip ve dikkatle ince bağırsak (MP izolasyon ayrıntılı bir protokol için, Schäfer ve diğ. 9 Şekil 1B bakınız) seromüsküler tabakası kapalı şerit. MP için, 24 kuyulu bir levha başına iki sıçan pleksus toplar.
    Not: ince bağırsaktan başarılı ayrılmasını engelleyen beri seromüsküler katmanında gözyaşları önlemek için mümkün olduğunca nazik olmaya çalışın.
  3. Gentamisin (500ml bir ortam içinde 20 mg) ve metronidazol (500 ml ortam içinde 2.5 mg) ile birlikte buz soğukluğunda minimal esas ortamı içinde DRG ve seromüsküler tabaka (MEM) toplayın.
  4. DRG toplanmasından sonra, 20-30 dakika boyunca kolajenaz Tip II ile birlikte Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde inkübe. MP izolasyonu için, yaşına bağlı olarak 1-3 saat arasında kollajenaz tip inkübehayvanın (Şekil 1C).
  5. MP için, stereomicroscope altında net gibi MP parçalarını toplamak ve buz gibi soğuk MEM transfer.
  6. Ardından çapı azalan şırınga yoluyla DRG ve MP çiğnemek.
    Not: Aşırı triture nöronları yok, ama daha az glia hücreleri olabilir.
  7. DRG veya MP içeren ortam, 5 dakika boyunca 93.9 xg'de bulutlu süspansiyon, santrifüj hale geldikten sonra, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 0.5 mM L-glutamin ile takviye edilmiş ortam içinde Neurobasal orta ve tekrar süspansiyon (atmak ve% 2 B-27).
  8. Bir hemasitometre ile hücrelerin toplam sayısını (örneğin, nöronlar ve glia) sayılır.
    Not: gereken hücre sayısı ölçü parametresine bağlıdır. Nörit yoğunluğunun ölçümü için, bir nevrit dışa büyümesinin, perikaryonal boyutunun ölçülmesi için daha yoğun kültürleri ve böylece hücrelerin büyük bir sayıda ihtiyacıve bireysel nöronların desen dallanma. Nörit yoğunluk ölçümleri için, örneğin iyi 10,000 hücreleri (nöron + glia) / veya 1.500 nöronlar / iyi kullanın. Bireysel nöronlar, kısa (1 dakikalık uzun) hücrelerinin tripsinizasyon ve 2.500 hücre / kuyu veya 400 nöronlar / of ekimi üzerine morfometresi için de önerilir. Bir sıçandan alınan hücrelerin tipik bir verim yaklaşık 300.000-500.000 hücredir.
  9. Gece önce kaplanmış 13 mm kapak hücreleri ve tohum (100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 0.5 mM L-glutamin ve% 2 B-27) Neurobasal ortamı (Şekil ile kuyu üst 1D).
    Not: Kullanım poli-D-lisin (40 mg / m 2) ya da ornitin ve laminin ile kaplanmış kaplama (1 mg / ml her biri) kapak slipleri. Hücreler bu nedenle birçok hücreler ihtiyaç olduğu deneylerde (yani akson yoğunluk ölçümleri) için uygun hale, son derece hızlı poli-D-lisin eklemek. Laminine Ek genel bazılarında olduğuNe zayıf ama laminin nevrit dışa büyümesinin güçlü bir promoterdir. Bu nedenle, dallanma nöronal ve nörit uzunluğu ölçümleri, ornitin / laminin-kaplama tercih ederim.
  10. Hücreler, gece boyunca oyuklara takmak izin verin. Bir sonraki gün, (100 ug / ml 'lik bir son özü / yüzer madde konsantrasyonunda) ekstresi ile takviye edilmiş ortam hazırlar.
  11. Tohumlama orta aspire ve PBS ile isteğe bağlı, çok nazik yıkama gerçekleştirmek, ve sonra yavaş yavaş extract / yüzer-desteklenmiş medya (Şekil 1E) pipetle.
  12. Hücreler 48 saat için büyümeye izin verin. Medya aspire ve (Şekil 1F) immünboyama için% 4 paraformaldehid düzeltmek.
  13. Nöron-spesifik (örneğin beta III-tubulin) ve glia-spesifik (örneğin, glial fibriallary asidik protein / GFAP) belirteçleri (Şekil 1G) kullanılarak çift immünofluoresans boyanma gerçekleştirin.
  14. Morfometresi için, kombinasyon wi bir CCD kamera ile donatılmış bir ters ışık mikroskobu kullanınnörit yoğunluk ölçümünü sağlar otomatik yazılım (bkz. Tablo) inci.
  15. Nöronal kültürlerin yoğunluğu, nevrit 50 um x 50 um ızgara uzanır ve bununla kesişen liflerin ölçülen kare başına lif yoğunluğu sayılarak her bir lamel üzerine yoğun büyüme 4 farklı bölgelerinden 200x büyütmede 4-5 Örnek fotomikrograflarında ölçülür. Nörit gelişimi, nöron başına düşen şube sayısı ortalaması, ortalama dal uzunluğu ve perikaryonal boyutu nevritlerle ve perikarya (Şekil 1H) işaretleyerek her lamel rastgele seçilen 30 yalnız nöronlardan ölçülebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Morfolojik nöroplastisite

Yeni doğmuş farelerin (P2-12) ile tohumlama yoğunluklarının belirtilen yaş aralığında, MP ve DRG nöronları daha önce 48 saat (Şekil 2A) sonra yoğun nöronal ağlar oluşturmak. PKa, CP yetiştirilmektedir nöronlar arasındaki nörit yoğunluğu ve NP özler karşılaştırması NP ekstrelerinde ya da daha PCa CP ekstrelerinde DRG nöronlarının nörit büyük yoğunluğa (Şekil 2A) 5 ortaya koymaktadır. MP nöronlar daha kolay DRG nör...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut protokol son zamanlarda PCa'nın ve CP 5 nöroplastisitesi mekanizmaları incelemek için bizim grup tarafından geliştirilen in vitro pankreatik nöroplastisite tahlil arkasındaki metodoloji göstermek için tasarlanmıştır. Protokol sanatçı DRG ve MP nöronların izolasyonu ve kültürü yeterli deneyim kazanmıştır sonra kolayca uygulanabilir üç günlük bir prosedür içerir. Ayrıca, pankreas microenvironmental bileşenlere enterik ve DRG ilişkili glia birlikte reaksiyonu incelemek için değerli bir araç t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması ve finansal açıklamaları var.

Teşekkürler

Tüm yazarlar sunulan analizin kurulması ve doğrulama doğru ve yazının taslak katkıda bulunmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Poli-D-lizin hidrobromürSigma-AldrichP1149
Ornitin / lamininSigma-AldrichP2533 / L4544
13 mm LamellerMerck24 oyuklu plakalarda kullanım için
Dağıtıcı SSartorius
Anti-Beta-III-tubulin antikoruMilliporeMAB16371:200 konsantrasyon
Anti-GFAP-antikoruDAKOM07611:400 konsantrasyon
RIPA tamponu + proteaz inhibitörüHerhangi bir tedarikçi
Nörobazal ortamGibco/Yaşam Bilimleri21103-049
B-27 EkiGibco/Yaşam Bilimleri17504044B-27'nin kalitesinin lot numarasına bağlı olduğu bilinmektedir
Gentamisin/MetronidazolHerhangi
tedarikçi Minimal esansiyel ortamGibco/Yaşam Bilimleri31095-029
Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Gibco/Yaşam Bilimleri24020133Ca/Mg Kollajenaz tip II içerdiğinde kollajenaz aktivitesini iyileştirir
Worthington BiyokimyasalCLS-2En az 200 U/mg aktiviteye sahip lotlar elde edin
Tripsin-EDTA %0.25Gibco/Yaşam Bilimleri25200056
%4 ParaformaldehitHerhangi bir tedarikçi
analiziSIS docu yazılımOlympus

Kaynaklar

  1. Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
  2. Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
  3. Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
  4. Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
  5. Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
  6. Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
  7. Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
  8. Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
  9. Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
  10. Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
  11. Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
  12. Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DRG N ronlarMiyenterik PleksusDoku Lizatlarmm nofloresan BoyamaNeurit Yo unlu uGlial H cre Say mN rotrofik Fakt rlerH cre K lt rWestern Blot

İlgili makaleler