Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi In Vitro Yapışma Deneyi

Özet

In vitro yapışma deneyleri, hücre mono tabakaları epitel ve bu pnömokokkal kolonizasyonu inhibe etmek için probiyotiklerin kullanımı potansiyel müdahaleler araştırmak için Streptococcus pneumoniae eki incelemek için kullanılabilir.

Özet

Nazofarenks epitel astar Streptococcus pneumoniae (pnömokok) yapışması kolonizasyonu neden olabilir ve. In vitro deneyler, hücre yapışma epitel pnömokokkinin eki incelemek için kullanılabilir zatürre ve orta kulak iltihabı gibi pnömokok kökenli enfeksiyonları için bir ön koşul olarak kabul edilir ve mono tabakaları, bu tür probiyotiklerin kullanımı potansiyel müdahaleler, araştırmak pnömokokkal kolonizasyonu inhibe. Burada açıklanan protokol (bazen HEp-2 hücreleri olarak da adlandırılır), insan epitel hücre hattı CCL-23, pnömokokkinin yapışması üzerinde, probiyotik Streptococcus salivarius etkilerini incelemek için kullanılır. Deney üç ana adımdan oluşur: epitel ve bakteri hücrelerinin 1) hazırlanması, hücre mono tabakaları epitel bakteri 2) ilavesi ve canlı sayısı (seri seyreltme ve kaplama) ya da kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR yapışık pnömokokkinin 3) tespiti .) Bu technique nispeten basittir ve bir doku kültürü kurulum dışındaki özel ekipman gerektirmez. Deney, diğer probiyotik türler ve / veya kolonizasyon pnömokok potansiyel inhibitörlerini test etmek için kullanılabilir ve kolayca pnömokok yapışma ve yayılım ile ilgili diğer bilimsel soruları için modifiye edilebilir.

Giriş

Streptococcus pneumoniae (pnömokok) pnömoni, otitis media ve menenjit gibi enfeksiyonlara neden olabilen bir Gram pozitif bir bakteridir. Düşük gelirli ülkelerdeki çocukların ve yıllık ¹ beş yaşın altındaki çocukların yaklaşık 800.000 kişinin ölümünden sorumlu hastalığın önemli bir nedenidir. Pnömokok sıklıkla genç çocukların nazofarenks yapılmaktadır. Bu kolonileşme genellikle asemptomatik kabul edilir olsa da, bu pnömokok kökenli enfeksiyon takip eder ve insan popülasyonlarında ^2'deki bakteriler için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir. Pnömokok kökenli konjügat aşısı etkili aşı içinde bulunan serotiplerin taşıma azaltır. Ancak, 90 pnömokok serotipleri üzerinde olan ve aşı serotiplerinin ortadan kaldırılması nonvaccine serotip ³ kaynaklanan taşıyıcı ve hastalık bir artış takip etmektedir, burada serotip değiştirilmesi, yol açabilir. Ayrıca, bazı yüksek riskli popülasyonlarda, pnömokokkolonizasyon genellikle önce ilk aşı dozu ^4,5 tatbikatından, çok erken yaşta ortaya çıkar. Son zamanlarda, probiyotiklerin kullanımı pnömokok kolonizasyon ^6,7 inhibe etmek için ilave bir strateji olarak teklif edilmiştir. In vitro deneyler, yapışma pnömokokkal yapışmayı ^8,9 incelemek için kullanılmıştır. Bu deneyler pnömokok bağlılık ¹⁰ probiyotik Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) etkisini araştırmak için adapte edilmiştir.

LGG ve diğer laktik asit bakterileri ek olarak, Streptococcus salivarius, ağız boşluğu, ortak yerleşik nedeniyle potansiyeli ve in vitro ¹¹ pnömokok ve diğer solunum yolu patojenleri inhibe etme yeteneği ile kolonizasyon için solunum yolu için potansiyel bir probiyotik olarak incelenmiştir ^{- 13.} Burada sunulan protokol S. etkilerini araştırmak için kullanılan bir bağlılık tahlili tarif Pnömokok bağlılık üzerine salivarius K12insan epitel hücre hattı CCL-23. Büyümesi ve yapışma özellikleri izolatların ^10,14 arasında önemli ölçüde değişebilir olarak deneyde kullanılmadan önce, pnömokok izolatı, yapışma özellikleri için değerlendirilmiştir. Pneumococci ve S. büyüme eğrileri salivarius (OD, Şekil 1) optik yoğunluk ile orta log fazı ve tahmini konsantrasyon (koloni oluşturan birim veya CFU / ml) tespit etmek için yapılmıştır. Her deneyde kullanılmadan önce izole edilmesi için uygun bir sayısı ve OD ile büyümesini incelemek için tavsiye edilir. Bu deney, standart doku kültürü tesisleri ve ekipmanları ile herhangi bir laboratuvarda yapılabilir. Bu protokol, S. üç doz etkisi salivarius önce S. uyumda pnömokok ilavesinden 1 saat uygulanmıştır pneumoniae PMP843, bir nazofarenks sürüntü türetilmiş bir serotip 19F taşıma izole incelenmiştir. Yapışık pnömokok ölçmek için iki farklı yol sunulmuştur: caydırmak için kan agar üzerine kaplamamaden canlı sayımları ve DNA ekstraksiyon ve qPCR ¹⁵ tarafından pnömokok lytA geninin tespiti. Temel yapışma tahlili protokolü kolay farklı dozlarda ve probiyotik tatbikat süresi test etmek için modifiye edilebilir ve aynı zamanda, diğer bakteri türleri ya da türleri ile kullanılabilir.

Protokol

1.. Epitel hazırlanması ve bakteriyel hücreler

1. CCL-23 epitel hücrelerinin Çözülme
   1. ~ 30 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ihtiva eden ön ısıtılması Minimum Essential Media (MEM).
   2. Kullanmadan önce en az 10 dakika boyunca UV ışığı ile doku kültürü onaylı biyogüvenlik kabini sterilize ve% 70 etanol ile çalışma alanını silin. Biyogüvenlik kabini içinde% 70 etanol ve yer ile ısındı medya şişe silin.
   3. 25 ml'lik bir pipet kullanarak, bir T-75 balon içine ortam 14 ml aktarın. Hücreleri (bölüm 1.1.4) buzunu iken 37 ° C inkübatör şişesi yerleştirin.
   4. ~% 80 çözülmüş kadar bir 37 ° C su banyosu içinde uygun güvenlik önlemleri ve sıcak kullanılarak sıvı azot depolama CCL-23 hücreleri bir şişe çıkarın.
   5. Biyogüvenlik kabine bölümünde 1.1.3 hazırlanan şişeyi döndürür. T içine,% 70 etanol ve transfer içeriği (1 mi) ile CCL-23 hücrelerinin şişenin dış yüzeyi silinP1000 bir pipet kullanarak şişeye -75.
   6. 37 ° C,% 5 _CO2,% 95 nispi nem doku kültürü kuluçka makinesi gece boyunca (16-20 saat) kendi tarafında şişe inkübe edin.
   7. Sağlıklı bir morfoloji onaylamak için bir mikroskop altında hücrelerin kontrol, medya kaldırmak ve taze 15 ml ile değiştirin, MEM +% 10 FBS prewarmed.
2. CCL-23 epitel hücrelerinin bakımı
   1. Hücreler ~% 80 konfluent (1-2 gün), 25 ml bir pipet kullanılarak ortam kaldırılması ve hafifçe 8-10 arası hücreleri iki kez yıkama ile geçit kez mi, 10 ml bir pipet kullanarak, önceden ısıtılmış, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS).
   2. PBS çıkarın ve steril% 0.25 tripsin-EDTA 1 ml (% 0.25 (a / h) tripsin, 0.1 mM EDTA) ekleyin. Yan balon açın, tripsin hücrelerinin konfluent katmanı kapsar garanti eder ve 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatörü içinde, 2-3 dakika boyunca bir balon içinde inkübe döndürün.
   3. Biyogüvenlik kabine şişeyi dön eklemek, 9 ml yukarı ve aşağı 6 MEM +% 10 FBS ve pipet prewarmed -8x hücreleri çıkarmak için şişenin tarafında aşağı sıvının çıkarılması, hücreler tekrar süspansiyon.
   4. Bölünmüş hücreler, 1:15 (1 ml + 14 ml MEM +% 10 FBS) veya 01:30 (0.5 ml + 14.5 ml MEM +% 10 FBS), aşırı hücreleri atmak ve 37 ° C,% 5 CO için şişeyi geri ₂ inkübatör.
   5. Geçiş, en azından iki kat yapışma deneyde kullanmadan önce hücreler. Genellikle hücreler 3-4 gün her bölünür.
3. CCL-23 epitel hücrelerinin Tohum (bir gün önce deney, Protokolü 2 yapışma için)
   1. Önceden ısıtılmış MEM içinde tekrar askıda bırakılması, 1.2.1-1.2.3 bölümlerinde tarif edildiği gibi birleşik hücreler bölünmüş +% 5 FBS (FBS konsantrasyonu, deneyde müdahale serum bileşenlerinin olasılığını azaltmak için indirilir). Hücrelerin 20 ul çıkarın ve tripan mavi boyama ve Hemasitometre kullanarak saymak.
   2. Bir steril 50 ml tüp içinde 1.5 x 10 ⁵ hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar önceden ısıtılmış MEM +% 5 FBS içinde hücreleri seyreltin.
   3. Tohum 1 hücreleri ml / oyuk bir dokudaKültür 24 oyuklu plaka işlemden geçirildi.
4. Bakterilerin hazırlanması
   Bu prosedür, pneumococci ve S. hazırlanması için takip edilebilir salivarius. Bakteriyel büyüme ortamı tipik (kirlenmiş ise genellikle bulanık görünür) Prewarm ve kısırlık testi için bir gecede 37 ° C inkübatör tutulur.
   1. At kanı agar (HBA) plakalar üzerinde deney, çizgi bakteri bağlılığın ve 35-37 ° C ve 18-24 saat süreyle% 5 CO ₂ inkübe öncesinde iki gün. Koyun kan agar bir alternatif olarak kullanılabilir.
   2. Ertesi gün, steril bir 30 ml tüp içine% 0.5 maya ekstraktı (THB + YE) ortam ile 10 ml Todd-Hewitt Broth pipetle her bir bakteri türlerinin bir gecelik kültürü için hazırlar. 10 ul döngü kullanarak, yaklaşık 10-12 iyi ayrılmış koloniler aşılamak. Kısaca vorteks ve 35-37 ° C ve 14-16 saat süreyle% 5 CO ₂ inkübe. Çorba kültürü çok uzun bırakılırsa pnömokokki autolyze unutmayın.

2. Yapışma Deneyi:. Epitel hücre mono tabakaları için Bakteri ilavesi

1. Pneumococci ve S. orta log bakteri kültürlerinin hazırlanması salivarius
   1. Pipet, iki steril 30 ml tüpler, tek etiketli pneumococci ve diğer S. her birine önceden ısıtılmış THB + YE 10 mi salivarius.
   2. Orta-log fazı ulaşmak için pneumococci'ye ~ 3 saat ve S. gerektirir salivarius (bkz. Şekil 1) ~ 2 saat inkübasyon gerektirir. Aynı anda hem kültürleri başlayın. Vortex (3-5 sn) gece bakteri kültürleri ve eklemek 100 ul pnömokokki ve 100 ul S. karşılık gelen tüpler içine salivarius.
   3. Kısaca girdap S. ve yaklaşık 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe kültürleri salivarius ve pnömokoklar için 3 saat.
2. Yapışma deneyi için CCL-23 hücrelerinin hazırlanması
   1. Içbükey bir mikroskop kullanarak, confluen için 24 oyuklu plaka kontrolsağlıklı hücre morfolojisi ile t tekkatmanları. Monokatmanlar hücre topaklanma veya bu bağlılığın hücre yuvarlanması veya zarar (bkz. Şekil 2) gibi sitopatik etkileri kanıt olmaksızın,>% 80 birleşmiş olmalıdır.
   2. Her bir hücre tek tabaka rahatsız etmemek için hafifçe eğerek plaka, bir transfer pipeti kullanarak Ortamı çıkarın.
   3. Nazikçe, hücreleri yıkayın her iyi bir serolojik pipet kullanarak içine ~ 500 ul önceden ısıtılmış PBS ekleyin ve hafifçe eğerek plaka, bir transfer pipet ile çıkarın. PBS atın. Bir kez yıkama işlemi tekrarlayın.
   4. Her kuyuya, önceden ısıtılmış MEM +% 5 FBS 500 ul ekleyin. Bakteri kültürlerinin hazırlarken _CO2 inkübatör 24 oyuklu plaka döndürür.
      Not: enfeksiyon (MOI) çokluğu için kesin CCL-23 hücre sayısını belirlemek için, iki kuyu tripsinize edilmiş ve enfeksiyon gününde sayılabilir.

3.. Yapışma Deneyi

1. Pnömokokkinin eklemebir MOI ~ 10:1 CCL-23 hücreleri. Çift kaynaklar içerisinde, Tablo 1 'de listelenen koşullar test edin.
   1. S. 1 ml'lik bir ₆₀₀ (OD) de optik yoğunluğu ölçmek salivarius kültürü. OD 0.3-0.6 arasında olmalıdır.
   2. S. 5 ml transfer 4 dakika boyunca 1870 x g'de, 10 ml bir tüp ve santrifüj içine salivarius kültürü.
   3. Süpernatantı atın ve bölüm 3.1.1 'de OD okuma dayalı, S. tekrar süspansiyon % 0.85 NaCl (nihai konsantrasyon ~ 1.5 x 10 ⁹ CFU / ml) içinde, 200-1,000 ul salivarius. Genel bir kural olarak, 0.375 bir OD 260 ul içinde yeniden süspanse edilecektir. S. 1:10 ve 1:100 seyreltimler hazırlayın salivarius NaCl 0.85% kullanarak.
      Not: Toplamda, S. (yüksek, orta ve düşük doz temsil eden) üç konsantrasyonları salivarius tahlilde test edilecektir. Yüksek doz, ~ 10 S. oranıdır salivarius: 1 pnömokoklar, ortam ~ 1 S. salivarius: 1 pnömokok ve düşük ~ 1 s'dir. salivarius: 10 pnömokokki.
   4. Inkübatör 24-plaka dışarı atın.
   5. Heparin kontrol kuyuları kaynaktan, ortam, 40 ul çıkarın ve 100 U / ml 'lik bir son konsantrasyon için heparin 50 ul (1.000 U / ml stok konsantrasyonu) ilave edilmektedir.
   6. CCL-23 hücreleri, sadece ve CCL-23 hücreleri ve pnömokok (no S. salivarius) içeren kuyu içeren oyuklara% 0.85 NaCl içinde 10 ul ekle.
   7. 10 sulandırılmamış ul, 01:10 ve S. 1:100 ekle ilgili oyuklara salivarius.
      Not: S. pnömokokki (post-ekleme) probiyotik tatbikat süresi etkisini incelemek sonra salivarius da pnömokok (coaddition) veya 1 saat ile aynı anda ilave edilebilir.
   8. Hücre tabakası ile temas bakteri teşvik etmek ve 37 ° C,% 5 _CO2 seviyesinde 1 saat boyunca inkübasyona 3 dakika boyunca 114 x g 'de 24-yuvalı plaka santrifüjleyin.
   9. S. seri seyreltme yapın yinelenen HBA 0.85% NaCl ve plakadaki salivarius hissecanlı sayısı plakalar. İlk olarak, bir 10 ^-1 seyreltme için% 0.85 NaCI 450 ul stok 50 ul ekle ve sonra vorteks (5 saniye), değişim ipuçları nabız ve% 0.85 NaCl içinde 450 ul seyreltme 10 ^-1 50 ul ekle benzeri kadar 10 ^-7 10 ^-2 seyreltme yapmak ve.
   10. Levha 100 10 ^-5 ul, HBA plakaları üzerinde iki kez 10 ^{-6, -7} ve 10 seyreltmeler ve steril bir yayıcı ile yayılan. 37 ° C,% 5 _CO2, gece boyunca ters HBA inkübe edin.
   11. 1 saat inkübe edildikten sonuna doğru, pnömokoklar için bölümleri 3.1.1-3.1.3 tekrarlayın. ODS 0,2-0,7 arasında olmalıdır. Aşağı pnömokok kültürün 1 ml Spin ve 1.5 x 10 ~ ⁸ CFU / ml 'lik bir konsantrasyona kadar (OD okuma dayalı olarak)% 0.85 NaCI 300-2,000 ul pelletini. Genel bir kural olarak, 0.3 'lük bir OD 500 ul içinde yeniden süspanse edilecektir.
   12. S ile 1 saat inkübe edildikten sonra salivarius, 10 μ eklemekVe negatif kontrol havuzları dışındaki tüm oyuklara l seyreltilmemiş pnömokokki (hücreleri içeren sadece).
   13. 3 dakika boyunca 114 x g 'de 24-yuvalı plaka santrifüj ve 37 ° C, 3 saat boyunca% 5 _CO2 ile inkübe edilir. Bölüm 3.1.9 ve plaka seyreltilerde 10 ^-4, canlı sayısı yinelenen HBA plakaları 10 ^-5, 10 ^-6 açıklandığı gibi% 0.85 NaCl pnömokokki stokunun seri seyreltme gerçekleştirin.
2. 3 saat sonra, tekkatmanları (bkz. Şekil 2) sağlıklı bir görünüm sağlamak için bir mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Her bir gözden Ortamı çıkarın ve yavaşça 2.2.3 bölümünde tarif edildiği gibi hücreler 3 kez yıkayın. her bir durum için ayrı bir pipet kullanarak. Bu adım nonadherent pnömokok kaldırmak esastır. Tek molekül sıraları, yıkama işlemi sırasında ayrı olmamalıdır; Bu mikroskop altında tekrar kontrol ile teyit edilebilir.

Not: Bu kademe sırasında çıkarılan Media (ek analizler için -20 ° C'de saklanabilir örneğin sitokin düzeylerinin ölçümü).

1. Her kuyuya% 0.1 digitonin (hafif bir deterjan) 200 ul ilave edin ve 7, 37 ° C'de dakikada,% 5 _CO2 inkübe edilir.
2. Her bir oyuğa THB medya 800 ul ekleyin. Gerekirse, yukarı ve aşağı pipetleme ve ile eritilir hücreleri emin hücre tek tabaka tamamen kaldırılır yapmak için pipet ucu ile kuyu 3-4x kazıyın. Kuyuları arasındaki ipuçları değiştirin.
3. Her bir P1000 pipet kullanarak içeriğini çıkarın ve etiketli mikrofüj tüplere aktarın.

Yapışık Pnömokok 4. Kantitasyonu

Yapışık pnömokokkinin uygun sayılarını belirlemek (seri seyreltme ve kan agarı üzerinde kaplama) ya da kantitatif gerçek zamanlı PCR ile tayin edilebilir.

1. Canlı sayım yöntemi
   Bu yöntem, hemen yapışma deneyi aşama 3.5 sonra gerçekleştirilmelidir.
   1. Her bir deney için, kuyu, toplanan numunelerin seri seyreltileri hazırlamak% 0.85 NaCl, darbe vorteks 450 ul numune 50 ul ekleyerek ve 10 ^-6 seyreltme kadar 3.1.9 bölümünde tarif edildiği gibi seri olarak seyreltilmesi ile yapışma deneyinde 3.5 adım.
   2. 100 10 ^-3 ul, 10, ^-4, 10, ^-5 ve Plate Kan agarı üzerinde iki kez 10 ^-6 dilüsyonlar steril bir yayıcı ile yayılır ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe ters plakalar,% 5 _CO2. Tek başına CCL-23 hücreleri içeren çukurlar bir bakteri içermemelidir ve kaplama olabilir unutmayın temiz (100 ul sulandırılmamış) bir sterilite kontrolü olarak.
   3. Ertesi gün, yapışma deneyi bölüm 3.1.13 hazırlanan (30-300 kolonileri ihtiva eden) uygun seyreltme plakaları üzerindeki kolonilerin sayılması suretiyle inokulum pnömokok belirler. İki plaka arasındaki ortalama değeri kullanarak inokulum CFU / ml hesaplanır. Benzer şekilde, S. belirler hazırlanan plakalar üzerinde koloniler sayılarak salivarius inokulabölümünde 3.1.10 içinde.
      Not: Tabaklar sadece pnömokok içermelidir; diğer türlerin varlığı, kirlenmiş ve deney sonuçları geçersiz olduğunu gösterir.
   4. Pnömokok bağlılık düzeylerini belirlemek için, 4.1.1 bölümünde hazırlanan her bir örnek için (30-300 koloni içeren pnömokok) uygun seyreltme plaka saymak. Not S. Şekil 3'te gösterildiği gibi, pnömokoklar, α-hemoliz düz ve yeşilimsi nedeniyle olacak ise salivarius koloniler, küçük ve beyaz olacaktır., pnömokokkal yapışmayı hesaplamak durum b yapışkan pnömokok sayısını normalize edilmesi için. CCL-23 hücreleri,% 100 + pnömokokkinin ve diğer koşullar bu durum yapışkan pnömokok karşılaştırın.
2. QPCR yöntemi
   Yapışma Tahlili toplanan örnekler 3,5 DNA ekstre kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir nolu aşama. DNA izolasyonu bir ticari kit kullanılarak ve bölümlerde tarif 4.2.1-4.2.9 ve QPCR gibi olduğubölümlerde 4.2.10-4.2.20 söylüyorlar.
   1. Enzimatik Lizis Tamponu (50 mM fosfat tamponu, pH 6.7 ihtiva eden 1 mg / ml lizozim, 0.075 mg / ml mutanolysin ve 2 mg / ml proteinaz K) hazırlayın. Aşağıdaki tarifi kullanılabilir (ekstraksiyon için yeterli 50) 10 ml yapmak. Enzimatik parçalama tamponu taze kullanımdan önce hazırlanmalıdır.
      
      50 mM fosfat tampon çözeltisi içinde 7.25 ml (pH 6.7)
      Nihai [1 ​​mg / ml] 1.00 ml 10 mg / ml lizozim hazır
      1 mg 0.75 ml / nihai [0.075 mg / ml '] için stok mutanolysin ml
      Nihai [2 mg / ml] 1.00 ml 20 mg / ml proteinaz K hazır
      
   2. Buz üzerinde ya da 4 ° C 'de örnekleri Çözülme Vorteks ve etiketlenmiş mikrofüj tüplerine aktarma her bir numune 100 ul alikotları. Geri -20 ° C derin dondurucuya özgün örnekleri dönün.
   3. 10 dakika boyunca 6700 x g'de santrifüje örnekleri.
   4. Çıkarın ve süpernatant atın. Ve pelet tekrar süspansiyon vorteks enzimatik lizis tamponu 200 ul ekleyin. Inkubasyon30 dakika boyunca 56 ° C'de numunelerin yedi. Tüpün altındaki sıvıyı toplamak için 6700 x g'de santrifüjleyin kısa bir süre (5 saniye).
   5. Hücre lizizi doldurun ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın,% 20 SDS içinde 10 ul ekle.
   6. RNase A (100 mg / ml stok) ilave edin ve 4 ul (bir rocker veya tüpler ters çevrilerek), 2 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın.
   7. 200 tampon AL ul (kit) ve 15 saniye vorteks ekleyin. 10 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edin. Tüpün altındaki sıvıyı toplamak için 6700 x g'de santrifüjleyin kısa bir süre (5 saniye).
   8. 15 saniye boyunca% 100 EtOH ve girdap 200 ul ekle. Kenar ıslatmadan (2 ml'lik bir toplama tüpü içinde) döndürme kolonuna (herhangi bir çökelti de dahil olmak üzere) karışımı aktarın sonra, tüpün altındaki sıvıyı toplamak için kısa bir süre için Spin. Üreticinin protokolü uyarınca yıkama adımları (burada gösterilmemiştir).
   9. , DNA Zehir etiketli mikrofuj tüpüne sütun aktarmak için, Tampon AE 50 ul ekleyin (from kit) ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 1 dakika boyunca 4.300 x g'de santrifüj. 100 ul bir son elusyon hacminde bir kez tekrarlayın. DNA, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
   10. 15 dakika önce başlamak için qPCR gerçekleştirmek için, UV ışığı ile davlumbaz sterilize edin. Her numune için iyi yerleri kaydetmek için bir 96 oyuklu plaka harita çalışma hazırlanması tavsiye edilir.
   11. (Referans suşu ATCC 6305 ayıklanır) genomik pnömokok DNA 10 ng / ml stok kullanılarak standart bir eğri hazırlayın.
       1. Pnömokok stok DNA çözülme ve bir masaüstü santrifüj kısaca (5 sn) aşağı doğru döndürün.
       2. Her bir seyreltme ile ipuçları ve vorteks değişen, 27 ul nükleaz içermeyen _H2O için 3 ul DNA eklenmesi ile 6 prelabeled mikrofüj tüplerinde 01:10 seri dilüsyonları yapın. 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 ve ng / ul: nihai seyreltme serisi 6 borulardan oluşmaktadır.
          Not: Bu en fazla bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
   12. Preparsteril bir PCR başlığı içinde steril 15 ml konik bir tüp içinde, aşağıdaki gibi e lytA master. Buz ve kullanımdan hemen önce girdap bileşenleri çözülme.

       bileşen	reaksiyon başına	x 102 (tam plaka)
       lytA F	10 mcM stokunun 0.25 ul	25.5 ul
       lytA R	10 mcM stokunun 0.25 ul	25.5 ul
       lytA prob	10 uM stoklar 0.5 ul	51 ul
       H 2 O	9.5 ul	969 ul
       Usta mix	12.5 ul	1.275 ul
       Final hacmi	23 ul	2.346 ul

       Not: Bazı gerçek-zamanlı PCR makinesi bazı ticari Master karışımı içinde yer alır ya da ayrı ayrı ilave edilebilir bir referans boya kullanımını gerektirir. Bu protokol, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 25 ul reaksiyonları çalıştırmak için tasarlanmıştır, ancak farklı bir gerçek-zamanlı PCR makineleri uyum sağlamak için ayarlanabilir. Primerleri ve prob dizileri ilk Carvalho et al. ¹⁵ tarafından yayınlanan ve malzeme listede gösterilmektedir.
   13. LYTA'nın Vortex ve yük 23 ul / kuyucuk uygun kuyulara karıştırın. Plaka haritaya bakın.
   14. Örnek yüklemesi için ilave alanı (ayrı bir odada, tercihen steril kabin) şablona taşıma plakası.
   15. Her bir kuyu için ipuçları değişen, örnekleri yüklemek için bir P2 pipet kullanın. Tüm örnekler ikişer kez çalıştırılır. Konumu için plaka haritaya bakın.
   16. Standart eğri oyuklara için, 1 | il / göz, standart eğri ve 1 ul DNA, uygun seyreltme ekleme / oyuk ₂ H O 25 ul son hacim getirmek.Hedef içermeyen kontrol kuyuları için, 2 ul _H2O eklemek
   17. Uygun kuyulara 2 ul / göz örnek DNA ekleyin.
   18. Kullanılan tüm kuyuları kap. Emin olun kapakları sıkıca kapatılır. Hızlı bir şekilde gerçek-zamanlı PCR makinesinin içine plakasını yüklemeden önce PCR plaka (5 sn) dönerler.
   19. Makine üreticisi tarafından sağlanan talimatlara göre PCR makine ve çalışma QPCR içine plaka yükleyin. Aşağıdaki hidroliz prob döngü koşulları tavsiye edilmektedir:

       Aşama 1 (1x):	95 ° C'de 3 dakika
       Aşama 2 (40x):	95 ° C'de 20 saniye
       	60 ° C'de 20 saniye

   20. Veri toplamak ve standart eğri kullanılarak pnömokok DNA ölçmek. Genomik DNA, daha önce 1 pg 447.4 hücreleri eşdeğer olduğu tahmin, ^17, açıklanan ve CFU / ml (varsayarak o kadar rapor edilen bakteriyel yükleri hesaplanırne CFU başına genom ve genom başına Lyta'nın bir kopyası; bakınız Şekil 4). Başarılı bir tahlil için, R ² değeri 0,98 ≥ olmalıdır ve standart eğrinin aralığındaki tüm olumlu sonuçlar (CT 0.00001 ng için elde edilen daha az değeri / ul standart eğri noktası arka / lytA negatif olarak kabul edilir).
       Not: Bazı real-time PCR sistemleri, standart eğrileri oluşturmak ve bilinmeyenler hesaplamak için kullanılan analiz yazılımı ile birlikte gelir. Aksi takdirde, bu hesaplamalar Excel veya benzer programlar yapılabilir. Bir örnek, standart bir eğri, Şekil 4 'de gösterilmiştir.
   21. Pnömokokkal yapışmayı hesaplamak için, durum b yapışkan pnömokok sayısını normalize. CCL-23 hücreleri,% 100 + pnömokokkinin ve diğer koşullar bu durum yapışkan pnömokok karşılaştırın.

Sonuçlar

Temsili bir deneyden elde edilen sonuçlar, bu pnömokok in (S. pneumoniae PMP843, bir kolonize 19F izole edilmiş) 1 saat S. eklenmesinden sonra CCL-23 hücrelerine ilave edildi salivarius ve pnömokokkal yapışmayı canlı sayımı ve lytA qPCR her ikisi tarafından nicelleştirilmiştir Tablo 2 'de gösterilmiştir. Sonuçlar sayısına normalize bakteri mutlak sayısı (CFU / ml olarak gösterilmiştir) ve% bağlılık, her ikisi için de, iki yöntem arasındaki uyumluydu yalnız pnömokok iç...

Tartışma

Bu tahlilde önemli bir kısmının S. uygun konsantrasyonları katmaktadır bölümlerde 3.1.7 ve 3.1.12 de salivarius ve pneumococci'ye. Konsantrasyonlar OD okumaları kullanılarak tahmin edilir, ancak bir sonraki gün plakalar sayılmıştır kadar tam olarak uygulanması gibi tespit edilmez. Bu nedenle, orta log fazı belirlemek ve OD ile konsantrasyonunun tahmin yardımcı olmak için tahlilde kullanılan tüm bakteriyel suşlar için zamanla OD ve uygun bir sayıları (CFU / ml) ölçmek için büyüme eğrileri gerçekleşt...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Minimum Esansiyel Medya (MEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30244.01
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30084.03
T-75 Matara	Nunc	156472
CCL-23 hücreleri	ATCC	CCL-23
Tripsin	Yaşam Teknolojileri	15090046
24 oyuklu Hücre kültürü plakası	Nunc	142475
At kanı agar (HBA) plakaları	Oxoid	PP2001	Koyun kanı agar plakaları da kabul edilebilir
Todd-Hewitt Et Suyu	Oksoit	CM0189
Maya Özü	Beckton Dickinson	212750
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Tek kullanımlık küvetler	Kartell	1938
Heparin	Pfizer	2112105,	5.000 IU / 5m/ 'de steril ampullerde gelir;
Steril yayıcı	Technoplas	S10805050	alternatif olarak, bir cam yayıcı %96 etanole batırılabilir ve her kullanımdan önce alevle sterilize edilebilir
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Mutanolizin	Sigma-Aldrich	M9901
Proteinaz K	Qiagen	19133
SDS% 20 çözüm	Ambion	AM9820
RNase A	Qiagen	19101
QIAamp DNA mini kiti (250)	Qiagen	51306
LytA F astar	Sigma-Aldrich	Özel yapılmış	5 '-> 3' dizi ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R astar	Sigma-Aldrich	Özel yapılmış	5 '-> 3' dizi  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probu	Eurogentec	Özel yapım	5 '-> 3' dizi Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternatif floroforlar kullanılabilir
Nükleaz içermeyen su	Ambion	AM9906
Brilliant III Ultra Hızlı QPCR mastermix	Agilent Technologies	600880
Termo-Hızlı 96 Algılama plakası	Thermo Fisher Scientific	AB-1100
Ultraclear qPCR kapak şeritleri	Thermo Fisher Scientific	AB-0866
Mx3005 QPCR Sistemi	Agilent Teknolojileri	401449
		ürünlerin çoğu/tümü için alternatif kaynaklar mevcuttur