Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

12.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51085

⸱

15 Kasım 2013

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine , 2Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Ketokonazol, Pregnane X Reseptörü (PXR) aktivasyonuna bağlanır ve antagonize eder. PXR mutantlarının maya yüksek verimli ekranları, ketokonazol bağlanması için benzersiz bir bölge tanımlar. Bu maya bazlı genetik yöntem, yüzey bağlanma bölgeleriyle ilişkili ligandlarla yeni nükleer reseptör etkileşimlerini keşfeder.

Özet

İlaç metabolizması ve inflamasyon kritik bir düzenleyicisi olarak, pregnan X Reseptör (PX), metabolizma ve enflamasyon (örneğin, karaciğer yağlanması) 1,2 bağlama hastalığın patofizyolojisinde önemli bir rol oynar. PX için agonist ligandların belirlenmesinde çok ilerleme olmuştur Bununla birlikte, ilaç-benzeri antagonistler ve PX 3,4,5 üzerindeki bağlanma siteleri sınırlı açıklamaları vardır. Kritik bir bariyer verimli PX 1998 klonlandı ve karakterize edildi rağmen antagonistleri ile yapı çalışmaları için de tam uzunluktaki proteini saflaştırmak için yetersizlik olmuştur. Bizim laboratuar PX 6 artıkları bağlayıcı, bir antagonist, ketokonazol en tanımlamak için temel alan yeni yüksek kapasiteli maya iki-hibrid tahlili geliştirilmiştir. Bizim yöntem ketokonazol ile etkileşim beklenen pxr ve AF-2 yüzeyinde tek mutasyonların etkisini kurtarırdı mutasyon kütüphanelerini oluşturma içerir. Kurtarma veya "kazanç fonksiyon-" sekond mutasyonlar PX üzerinde ketokonazol genetik etkileşim ve kalıntı yüzey (ler) ile ilgili sonuçlar, uygun olduğu şekilde yapılabilir. Böylece, kendi koaktivatörle, SRC-1 ile etkileşim PX mutantlarının veren yüksek işleme kapasiteli, iki maya hibrid ekran geliştirdi. Maya antifungal ilaç, ketokonazol çalışma karşılamak için modifiye edildiği, bu yaklaşım kullanarak, ketokonazol bağlamak için mümkün klonlarında zenginleştirilmiş PX belirli mutasyon göstermek olabilir. Ters mantıkla, biz orijinal kalıntıları ketokonazol ile doğrudan etkileşim kalıntıları olduğu sonucuna. Bu deney, bir yeni, nükleer reseptör yüzeyler üzerinde antagonist bağlanma bölgeleri için ekrana uysal genetik deneyi temsil etmektedir. Bu deney, maya hem de standart yapısal biyoloji veya proteomik göre yöntemler kullanılarak incelendi edilemez hücresel protein (ler) bağımsız olarak bir sitotoksik potansiyel herhangi bir ilaç için uygulanabilir. Potansiyel tuzaklar verilerin yorumlanmasını (tamamlayıcı yöntemler yararlı), dinleri dahilTek Y2H yöntemi, maya taşıma veya maya iki hibrit deneyleri performans uzmanlık ve tahlil optimizasyonu ance.

Giriş

Maya iki-hibrit (Y2H) testi, protein-protein etkileşimlerini keşfetmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve daha yakın zamanda protein-protein etkileşim kompleksleri 7, 8, 9, 10, 11'i bozan yeni küçük moleküllerin keşfi için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ilaç keşfi veya "isabetler" için kullanılan bu tahlilin geleneksel yaklaşımları, protein-protein yüzeyleri içindeki kimyasal bileşiklerin allosterik etkileşim kalıntılarının tespit edilmesine izin vermez, bunlar değiştirildiğinde hala etkileşime girer ve değiştirilmiş kalıntıların sorgulanmasına izin verir11. Gerçekten de, böyle bir yöntem(ler)in geliştirilmesi mümkünse, protein-protein etkileşiminin bozulması için kritik olan allosterik etkileşim kalıntılarının yüksek verimli değerlendirmesi için izlenebilir bir maya sistemi sağlayacaktır. İlaç keşfi bağlamında, bileşiklerin proteinlerle etkileşimini kurmanın en doğrudan yolu, yapısal belirlemeyi (örneğin, protein inhibitörü kompleksinin kristalizasyonu) içerecektir. Bu yöntemler hantaldır, ayrıntılı kaynaklar kullanır ve her protein üzerinde yapısal çalışmalar yapmak teknik olarak mümkün değildir.

Bakteri1, 2 ve memeli iki-melez gibi diğer model sistemlerde izlenebilir genetik ilaç tarama sistemleri kurulmuştur. Bununla birlikte, bu sistemlerin optimizasyona ihtiyacı vardır ve Y2H gibi alternatif sistemler hala ilaç keşfinde en çok test edilenlerdir. Tekil yöntemler13 kullanılarak etkileşimlerin zayıf duyarlılığını ve güvenilirliğini içeren sınırlamalar vardır, ancak etkileşim kalıntılarıyla ilgili belirli soruları yanıtlamak için tek bir Y2H testi değiştirilebilir. Nükleer reseptör araştırması alanında, Y2H, etkileşen proteinleri14 tanımlamak için kullanılmıştır, ancak bu protein etkileşimleri, ligandların/antagonistlerin nükleer reseptör-protein kompleksleri ile etkileşime girdiği doğayı tanımlamak için nadiren kullanılmıştır. Bu nedenle, laboratuvarımız, özellikle proteomik tabanlı yöntemlere kolayca uygun olmayan reseptör proteinleri için, ters Y2H tabanlı bir keşif platformu kullanarak yeni ligand/antagonist etkileşimli kalıntıları ortaya çıkaracak bir yöntem tanımlama çabalarına odaklanmıştır.

Ketokonazolün PXR'yi ve aktivatörü SRC-1'i bozduğuna dair önceki bulgumuza dayanarak, PXR6 üzerindeki ketokonazol etkileşimli kalıntıları tanımlamamızı ve sorgulamamızı sağlayan yeni bir ters Y2H sistemi geliştirdik. Yöntemimiz, DNA bağlanması ve transkripsiyonel aktivasyondan sorumlu ayrılabilir alanlardan oluşan maya GAL4 proteininin özelliklerine dayanmaktadır. PXR LBD proteini, LexA DNA bağlama alanına (DNA-BD) bir füzyon olarak eksprese edilirken, tam uzunlukta ko-aktivatörler SRC-1 (steroid reseptör koaktivatörü 1) proteinleri, GAL4 aktivasyon alanına (AD) füzyonlar olarak ifade edilir. PXR ve SRC-1 füzyon proteinleri arasındaki etkileşim, maya genomuna entegre edilmiş raportör gen β-LacZ içeren GAL4 bağlanma bölgelerinin transkripsiyonel aktivasyonuna yol açar. Bir PXR antagonisti olan ketokonazol, PXR ve SRC-1 etkileşimini bozar 15, 16, 17 ve X-gal aktivitesi için filtrelerdeki kolonileri boyadıktan sonra ketokonazolün varlığında veya yokluğunda PXR ve SRC-1'in etkileşimini tespit edebiliriz. Y2H prensibi Şekil 1'de gösterilmiştir ve deneysel prosedür Şekil 2'de özetlenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Maya Vektörlerinde PXR ve SRC-1 Füzyonlarının Oluşturulması

  1. İnsan PXR LBD (107-434 amino asit) ve İnsan SRC-1 tam uzunluğunun (1-1401 amino asit) PCR amplifikasyonu.
    1. PXR LBD şablonu olarak pSG5-hPXR plazmid8'i kullanın, SRC-1 şablonları olarak pCMX-SRC1 plazmidini kullanın.
    2. PCR SuperMix'i, DNA şablonlarını ve primerleri (Malzemelere bakın) çözdürün, buz üzerinde tutun.
    3. 0.25 μg/μl DNA şablonu 1 μl, 10 mM primer çiftlerinin her biri 2 μl, PCR SuperMix 45 μl ekleyin ve toplam hacmi 50 μl'ye getirmek için H2O ekleyin.
    4. PCR'yi 2 dakika boyunca 94 °C'lik bir döngüye, 30 saniye boyunca 20 döngü 94 °C'ye, 30 saniye boyunca 55 °C'ye ve 2 dakika boyunca 72 °C'ye, ardından uzatma için 10 dakika boyunca 72 °C'lik bir döngüye ayarlayın. %1 agaroz jel üzerinde çalıştırarak PCR ürünlerini kontrol edin.
  2. Y2H vektörlerine klonlanan PCR ürünleri.
    1. PCR ürünlerini %1 agaroz jelden arındırın. BamHI ve SalI ile PXR, LBD, PCR ve Y2H vektörü pSH2-1'i sindirin; SRC-1 PCR ve Y2H vektör pGADNOT'u NotΙ ve SalΙ ile sindirin. Bunu yapmak için, toplam hacmi 30 μl'ye getirmek için 1 μg DNA, 3 μl 10x reaksiyon tamponu, 1 μl kısıtlama enzimi ve son olarak H2O ekleyin.
    2. Çürütme örneklerini 1 saat boyunca 37 ° C su banyosuna koyun. % 1 agaroz jeli üzerinde çalışarak sindirimi kontrol edin.
    3. Sindirim örneklerini %1 agaroz jelden saflaştırın, sindirilmiş PCR ürünlerini ve Y2H vektörlerini bağlayın ve DH5α yetkin hücrelere dönüştürün.
    4. Kolonileri toplayın ve plazmit DNA'sını izole edin.
  3. pSH2-1-PXR plazmit DNA'sını BamHI/SalI sindirimi ile tanımlayın, pGADNOT-SRC-1 plazmit DNA'sını NotI/SalI sindirimi ile tanımlayın. Dizileme ile tüm pozitif plazmit DNA'yı doğrulayın.

2. Maya İki Hibrit Tahliller

  1. Maya türünü 5 ml YPAD'ye aşılayın ve sürekli çalkalama ile gece boyunca inkübe edin (30 ° C'de 220 rpm). Not: Saccharomyces cerevisiae suşu, lexA operatörü10 ile entegre bir GAL1-lacZ geni içeren CTY10-5d (MATa ade2 trp1-901 leu2-3,112 his3-200 ga l4-gal80- URA3::lexA-lacZ) idi. Ketokonazole dirençli, ancak azol direnci18-20'nin bir nedeni olarak taşıyıcı değişiklikler taşımayan canlı maya hücreleri elde etmek için, önce ERG3'ün (erg3Δ) silinmesi ve ardından homolog rekombinasyon ile ERG11 (erg3Δ / erg11Δ) genlerinde ek delesyon eklenmesiyle yeni CTY10-5d maya suşları elde edildi. İnşaat detayları daha önce yayınlanmış bir el yazmasındaaçıklanmıştır 6 .
  2. Ertesi gün (sabah), mayayı (1:20) 5 ml YAPD içinde aşılayın ve sürekli çalkalama (30 ° C'de 220 rpm) ile bir OD600 ~ 0.2 elde etmek için inkübe edin.
  3. Hücreleri 2.000 rpm'de bir mikrosantrifüjde 2 dakika boyunca peletleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra peleti iki kez otoklavlanmış su ile ve bir kez 0,1 M LiAc ile yıkayın.
  4. Son yıkamadan sonra, süpernatanı atın ve hücre peletine aşağıdaki reaktifleri ekleyin: 240 μl PEG 3500 %50 w/h, 36 μl 1 M LiAc, 50 μl 2 mg/ml haşlanmış somon spermi ssDNA, H2O 34 μl. Karıştırmak için girdap, 1 μg pSH-PXR ve 1 μg pGADNOT-SRC-1 DNA ekleyin ve karıştırın.
  5. Karışımı polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarın, dönüşümü çalkalayın, karıştırın (30 ° C'de 220 rpm) 30 dakika Tüpü 42 ° C su banyosuna getirin ve 30 dakika daha inkübe edin.
  6. Tüpü 2.000 rpm'de 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peletleri bir kez otoklavlanmış su ile yıkayın.
  7. Tüpe 100 μl steril su pipetleyin, hafifçe parmak vurma ve pipetleme ile hücreleri yeniden süspanse edin, ardından -His/- Leu Bırakma Ortamı plakalarına yerleştirin (Bir Litre Başına Formülasyon -His/-Leu Bırakma Ortamı: 20 g dekstroz, 1.7 g YNB, 0.67 g CSM-His/-Leu, 5 g amonyum sülfat, %1.5 agar) ve transformantları izole etmek için 30 ° C'de 3-4 gün inkübe edin.

3. X-gal Filtre Testi

  1. Nitroselüloz membranı bir Petri kabının bir parçası boyutuna kadar kesin. Yönü işaretlemek için nitroselüloz membranı etiketleyin.
  2. Önceden işaretlenmiş nitroselüloz membranı maya kolonilerine yerleştirin, membranın plaka ortamının yüzeyi ile temas halinde olduğundan emin olun.
  3. Membranı çıkarın, koloni tarafı yukarı bakacak şekilde 3 mm'lik bir filtre kağıdına yerleştirin ve membranı ve filtre kağıdını -80 °C'de 15 dakika boyunca yerleştirin.
  4. X-gal çözeltisi yapın. 5 ml Z-tamponuna 50 μl 20 mg / ml X-gal ve 15 μl β-merkaptoetanol ekleyin (1 L tampon 16.1 g Na2HPO47H2O, 5.5 g NaH2PO4 H2O, 0.75 g KCl , 0.25 g MgSO4•7H2O içerir). Z Tamponu 4 °C'de tutulduysa, bu reaktifleri eklemeden önce oda sıcaklığına getirin.
  5. Bir Petri kabına iki daire 3 mm filtre kağıdı yerleştirin ve 5 ml X-gal solüsyonu ile ıslatın. Petri kabındaki fazla tamponu boşaltın ve nitroselüloz zarı koloni tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
  6. Kapağı kapatın, membranın filtre kağıdı ile tam temas ettiğinden ve tamamen ıslak olduğundan emin olun. Petri kabını folyoya sarın ve 37 °C'de 30 dakika ila gece boyunca inkübe edin.

4. Sıvı β-gal Testi

  1. Mayayı -His/-Leu Bırakma sıvı ortamında OD600 0.7'ye kadar büyütün.
  2. 1 ml ortamı 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 3.000 rpm'de 2 dakika santrifüjleyin.
  3. Peleti yeniden süspanse etmek için 1 ml Z Tamponu ekleyin, tekrar 3.000 rpm'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  4. Hücre peletini yeniden süspanse etmek için 2ME ile 150 μl Z Tamponu ekleyin, karıştırın ve ardından 50 μl kloroform ve 20 μl %0.1 SDS ekleyin. Numuneyi 15 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın.
  5. 700 μl ONPG Çözeltisi (Z tamponunda 1 mg / ml) ekleyin. Zamanlayıcıyı ayarlayın, sarı rengin gelişmesine izin verecek kadar uzun süre 30 °C'de inkübe edin ve toplam reaksiyon süresini not edin.
  6. Reaksiyonu durdurmak ve 420 nm'de absorbansı belirlemek için 500 μl 1 M Na2CO3 ekleyin. Boş, 700 μl ONPG çözeltisi artı 500 μl 1 M Na2CO3'tür.

Miller Birimlerini aşağıdaki gibi hesaplayın: Miller Birimleri = (Å420*1,000)/(Å600*min*ml)

Å420: 420 nanometrede absorbans birimleri; Å600: 600 nanometrede absorbans birimleri; min: dakika cinsinden reaksiyon süresi; ml: ml cinsinden reaksiyon hacmi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PXR ve steroid reseptör koaktivator-1'in (SRC-1) etkileşiminin kolorimetrik bir okumasını tespit edip edemeyeceğimizi görmek için bir analiz gerçekleştirdik. Mayalar önemli düzeyde sterol üretimi yaptığından, mayalarda lacZ ekspresyonunun ek bir ekzojen ligand gereksinimi olmaksızın indüklenebildiği daha önce gösterilmiştir. PXR ve SRC-1 ile transforme edilen maya suşunda lacZ ekspresyonunun (mavi koloniler) indüklendiğini; ancak boş vektörler, sadece PXR veya sadece SRC-1 ile transforme edilen mayalarda LacZ ekspresyonu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Modifiye Y2H tahlilimizde, PXR6 üzerindeki ketokonazol etkileşimleri için önemli kalıntılar belirledik. SRC-1 bir koaktivatör olduğundan (ve pGADNot vektörüne klonlandığından), SRC-1'in pSH vektör sistemine klonlandığında lacZ ekspresyonunu aktive edip edemeyeceğini ve bunun aktivasyon profilini değiştirip değiştirmeyeceğini ve/veya maya iki hibrit testinin sızıntısını etkileyip etkilemeyeceğini de test ettik. Yeniden tasarlanmış plazmitlerimizi kullanarak erg3Δ/erg11Δ mayasında iki hibrit ta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibe CA127231 ve Damon Runyon Vakfı Klinik Araştırmacı Ödülü (CI 1502) (S.M.'ye) tarafından desteklenmiştir. Çek Cumhuriyeti, Olomouc, Palacky Üniversitesi'nden Profesör Zdenek Dvorak'a, bu tekniğin kurumlarına taşınabilirliği ve protokolün standardizasyonu konusundaki yararlı görüşleri için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Maya Suşu: CTY10-5d erg3Δ/erg11ΔLaboratuvarımızCTY10-5d mayası, ERG3 ve ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genleri6 edildi.
YPD Büyüme OrtamıBD Biosciences630409
Difco Maya Azot Baz (YNB), Amino Asitler ve Amonyum Sülfat olmadanBD Biosciences233520
Bacto AgarBD Biosciences214010
CSM-His/-Leu Komple Takviye KarışımıMP Biyomedikaller4250-412
ONPG (O-Nitrofenil ve Beta;-D-Galaktopiranosid).Sigma-AldrichN1127
2-MerkaptoetanolSigma-AldrichM6250
Luria Suyu (LB)Sigma-AldrichL3022
X-GalFisherBP-1615
Sonike Somon Sperm DNA'sı haşlanmış (10 mg / ml)Yaşam Teknolojisi156-017
AmpisilinAcros Organics61177
KetokonazolSigma-AldrichK1003
N,N-DimetilformamidAcros Organics326871000
Lityum AsetatSigma-AldrichL4158
%50 PEG-3350 solüsyonu, filtre ile sterilize edilmişSigma-AldrichP-3640
Nitroselüloz MembranWhatman10402091
10 cm Petri KabıFisher875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'bizimlaboratuvarımızPXR LBD pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'laboratuvarSRC-1 pGADNOT
için ileri astar5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'bizimlaboratuvarımızSRC-1 pGADNOT
Platinum PCR SupermixInvitrogen11306-016
BamHIlaboratuvarımızR0136
SalIlaboratuvarımızR0138
NotIlaboratuvarımızR0189
için ters astar

Kaynaklar

  1. Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
  2. Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).
  3. Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists. Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).
  4. Pondugula, S. R., Mani, S. Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response. Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).
  5. Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. PXR antagonists and implications for drug metabolism. Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).
  6. Li, H., et al. Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR. J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).
  7. Hollenberg, S. M., et al. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
  8. Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 74 (1), 205-214 (1993).
  9. Wang, H., et al. The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor. Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).
  10. Kalpana, G. V., Goff, S. P. Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).
  11. Hamdi, A., Colas, P. Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery. TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).
  12. Battesti, A., Bouveret, E. The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli. Methods. 58 (4), 325-334 (2012).
  13. Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems. Methods. 58 (4), 317-324 (2012).
  14. Albers, M., et al. Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins. Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).
  15. Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics. J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).
  16. Huang, H., et al. Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole. Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).
  17. Wang, H., et al. Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs. Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).
  18. Ghannoum, M. A., Rice, L. B. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).
  19. Kaur, R., Bachhawat, A. K. The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology. 145, 809-818 (1999).
  20. White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).
  21. Serebriiskii, I. G., et al. Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets. Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).
  22. Yang, L., et al. Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer. Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).
  23. Zhan, Y. Y., et al. The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK. Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Maya ki Hibrit DeneyiN kleer Resept r Etkile imiPXR Ligand Ba lanmasKetokonazol Ba lanma B lgeleriSRC 1 Koaktivat rMutasyonel K t phane TaramasS v Beta Galaktosidaz DeneyiFiltre Koloni DeneyiAntagonist Ba lanma B lgeleriY ksek Verimli Tarama
Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.