Ketokonazol, Pregnane X Reseptörü (PXR) aktivasyonuna bağlanır ve antagonize eder. PXR mutantlarının maya yüksek verimli ekranları, ketokonazol bağlanması için benzersiz bir bölge tanımlar. Bu maya bazlı genetik yöntem, yüzey bağlanma bölgeleriyle ilişkili ligandlarla yeni nükleer reseptör etkileşimlerini keşfeder.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
İlaç metabolizması ve inflamasyon kritik bir düzenleyicisi olarak, pregnan X Reseptör (PX), metabolizma ve enflamasyon (örneğin, karaciğer yağlanması) 1,2 bağlama hastalığın patofizyolojisinde önemli bir rol oynar. PX için agonist ligandların belirlenmesinde çok ilerleme olmuştur Bununla birlikte, ilaç-benzeri antagonistler ve PX 3,4,5 üzerindeki bağlanma siteleri sınırlı açıklamaları vardır. Kritik bir bariyer verimli PX 1998 klonlandı ve karakterize edildi rağmen antagonistleri ile yapı çalışmaları için de tam uzunluktaki proteini saflaştırmak için yetersizlik olmuştur. Bizim laboratuar PX 6 artıkları bağlayıcı, bir antagonist, ketokonazol en tanımlamak için temel alan yeni yüksek kapasiteli maya iki-hibrid tahlili geliştirilmiştir. Bizim yöntem ketokonazol ile etkileşim beklenen pxr ve AF-2 yüzeyinde tek mutasyonların etkisini kurtarırdı mutasyon kütüphanelerini oluşturma içerir. Kurtarma veya "kazanç fonksiyon-" sekond mutasyonlar PX üzerinde ketokonazol genetik etkileşim ve kalıntı yüzey (ler) ile ilgili sonuçlar, uygun olduğu şekilde yapılabilir. Böylece, kendi koaktivatörle, SRC-1 ile etkileşim PX mutantlarının veren yüksek işleme kapasiteli, iki maya hibrid ekran geliştirdi. Maya antifungal ilaç, ketokonazol çalışma karşılamak için modifiye edildiği, bu yaklaşım kullanarak, ketokonazol bağlamak için mümkün klonlarında zenginleştirilmiş PX belirli mutasyon göstermek olabilir. Ters mantıkla, biz orijinal kalıntıları ketokonazol ile doğrudan etkileşim kalıntıları olduğu sonucuna. Bu deney, bir yeni, nükleer reseptör yüzeyler üzerinde antagonist bağlanma bölgeleri için ekrana uysal genetik deneyi temsil etmektedir. Bu deney, maya hem de standart yapısal biyoloji veya proteomik göre yöntemler kullanılarak incelendi edilemez hücresel protein (ler) bağımsız olarak bir sitotoksik potansiyel herhangi bir ilaç için uygulanabilir. Potansiyel tuzaklar verilerin yorumlanmasını (tamamlayıcı yöntemler yararlı), dinleri dahilTek Y2H yöntemi, maya taşıma veya maya iki hibrit deneyleri performans uzmanlık ve tahlil optimizasyonu ance.
Giriş
Maya iki-hibrit (Y2H) testi, protein-protein etkileşimlerini keşfetmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve daha yakın zamanda protein-protein etkileşim kompleksleri 7, 8, 9, 10, 11'i bozan yeni küçük moleküllerin keşfi için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ilaç keşfi veya "isabetler" için kullanılan bu tahlilin geleneksel yaklaşımları, protein-protein yüzeyleri içindeki kimyasal bileşiklerin allosterik etkileşim kalıntılarının tespit edilmesine izin vermez, bunlar değiştirildiğinde hala etkileşime girer ve değiştirilmiş kalıntıların sorgulanmasına izin verir11. Gerçekten de, böyle bir yöntem(ler)in geliştirilmesi mümkünse, protein-protein e....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Maya Vektörlerinde PXR ve SRC-1 Füzyonlarının Oluşturulması
- İnsan PXR LBD (107-434 amino asit) ve İnsan SRC-1 tam uzunluğunun (1-1401 amino asit) PCR amplifikasyonu.
- PXR LBD şablonu olarak pSG5-hPXR plazmid8'i kullanın, SRC-1 şablonları olarak pCMX-SRC1 plazmidini kullanın.
- PCR SuperMix'i, DNA şablonlarını ve primerleri (Malzemelere bakın) çözdürün, buz üzerinde tutun.
- 0.25 μg/μl DNA şablonu 1 μl, 10 mM primer çiftlerinin her biri 2 μl, PCR SuperMix 45 μl ekleyin ve toplam hacmi 50 μl'ye getirmek için H2O ekleyin.
- PCR'yi 2 dakika boyunca 94 °C'lik bir döngüye, 30 saniye boyunca 20 döngü ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
PXR ve steroid reseptör koaktivator-1'in (SRC-1) etkileşiminin kolorimetrik bir okumasını tespit edip edemeyeceğimizi görmek için bir analiz gerçekleştirdik. Mayalar önemli düzeyde sterol üretimi yaptığından, mayalarda lacZ ekspresyonunun ek bir ekzojen ligand gereksinimi olmaksızın indüklenebildiği daha önce gösterilmiştir. PXR ve SRC-1 ile transforme edilen maya suşunda lacZ ekspresyonunun (mavi koloniler) indüklendiğini; ancak boş vektörler, sadece PXR veya sadece SRC-1 ile transforme edilen mayalarda LacZ ekspresyonu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Modifiye Y2H tahlilimizde, PXR6 üzerindeki ketokonazol etkileşimleri için önemli kalıntılar belirledik. SRC-1 bir koaktivatör olduğundan (ve pGADNot vektörüne klonlandığından), SRC-1'in pSH vektör sistemine klonlandığında lacZ ekspresyonunu aktive edip edemeyeceğini ve bunun aktivasyon profilini değiştirip değiştirmeyeceğini ve/veya maya iki hibrit testinin sızıntısını etkileyip etkilemeyeceğini de test ettik. Yeniden tasarlanmış plazmitlerimizi kullanarak erg3Δ/erg11Δ mayasında iki hibrit ta.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibe CA127231 ve Damon Runyon Vakfı Klinik Araştırmacı Ödülü (CI 1502) (S.M.'ye) tarafından desteklenmiştir. Çek Cumhuriyeti, Olomouc, Palacky Üniversitesi'nden Profesör Zdenek Dvorak'a, bu tekniğin kurumlarına taşınabilirliği ve protokolün standardizasyonu konusundaki yararlı görüşleri için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Maya Suşu: CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Laboratuvarımız | CTY10-5d mayası, ERG3 ve ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genleri6 edildi. | |
| YPD Büyüme Ortamı | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Maya Azot Baz (YNB), Amino Asitler ve Amonyum Sülfat olmadan | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-His/-Leu Komple Takviye Karışımı | MP Biyomedikaller | 4250-412 | |
| ONPG (O-Nitrofenil ve Beta;-D-Galaktopiranosid). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Luria Suyu (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| Sonike Somon Sperm DNA'sı haşlanmış (10 mg / ml) | Yaşam Teknolojisi | 156-017 | |
| Ampisilin | Acros Organics | 61177 | |
| Ketokonazol | Sigma-Aldrich | K1003 | |
| N,N-Dimetilformamid | Acros Organics | 326871000 | |
| Lityum Asetat | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| %50 PEG-3350 solüsyonu, filtre ile sterilize edilmiş | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Nitroselüloz Membran | Whatman | 10402091 | |
| 10 cm Petri Kabı | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'pSH2-1 | |||
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'bizim | laboratuvarımız | PXR LBD pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'laboratuvar | SRC-1 pGADNOT | ||
| için ileri astar5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'bizim | laboratuvarımız | SRC-1 pGADNOT | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| BamHI | laboratuvarımız | R0136 | |
| SalI | laboratuvarımız | R0138 | |
| NotI | laboratuvarımız | R0189 |
Kaynaklar
- Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
- Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
