Optimize Negatif Boyama: Elektron Mikroskobu ile Küçük ve Asimetrik Protein Yapısı incelenmesi için Yüksek verim Protokolü

Summary

Daha fazla protein yarısından elektron mikroskobu görüntüleme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon hem de zor küçük proteinler (moleküler kütle <200 kDa) 'dir. Optimize negatif boyama, yüksek kontrast ve nispeten yüksek çözünürlük (~ 1 nm) farklı fizyolojik koşullar altında, küçük, asimetrik proteinlerin ya da komplekslerin görüntüleri elde etmek için güçlü ve yüksek verimli bir protokoldür.

Abstract

200 kDa - proteinlerin yapısal belirlenmesi yerine 40 arasında, molekül kütlesi proteinler için meydan okuyor. Doğal proteinlerin yarıdan fazlası 40 arasında bir moleküler kütleye sahip olduğu göz önüne alındığında - 200 kDa ^1,2, bir nanometre çözünürlük kapasitesi ile sağlam ve yüksek verimli bir yöntem gereklidir. Negatif boyama (NS) elektron mikroskopisi (EM) sık sık protein yapısı ve protein-protein etkileşimlerini incelemek için araştırma laboratuarlarında kullanılan bir, kolay, hızlı ve nicel bir yaklaşımdır. Ne yazık ki, geleneksel NS protokolleri çoğunlukla, özellikle genelde rouleaux eserler sunan oluşturacak lipoproteinler ile, proteinler yapısal eserler üretmek. Bir standart olarak kriyo-elektron mikroskobu (cryo-EM) için lipoprotein görüntüleri kullanarak NS numune hazırlama şartlarında önemli parametreler son tarandı ve optimize NS protokolü (OPN), değiştirilmiş bir protokol ³ NS ​​olarak bildirildi. Ro gibi eserleruleaux ölçüde ek (1 nm yakınında) oldukça yüksek çözünürlük ile birlikte yüksek kontrast küçük ve asimetrik proteinlerin görüntüler sağlayarak, OPN'ler ile sınırlı olabilir. Bu yüksek çözünürlüklü ve yüksek kontrastlı görüntüler elektron tomografisi ^4,5 yöntemi ile, böyle bir 160 kDa antikoru gibi bireysel bir protein (tek bir nesne, hiçbir ortalama) 3 boyutlu rekonstrüksiyon, hatta elverişli. Ayrıca, OPN'ler küçük proteinlerin örnekleri yüzlerce incelemek için yüksek verimli bir araç olabilir. Örneğin, 53 kDa'lık bir kolesteril ester transfer proteini daha önce yayınlanmış mekanizması (CETP) örnekleri ⁶ yüzlerce taranması ve görüntüleme içeriyordu. Düşünüldüğünde cryo-EM nadiren başarıyla görüntüleri proteinler az 200 kDa üzerinde yüz örnek koşullarını eleme ilgili herhangi bir çalışma yayınlamaya henüz, o OPN'ler küçük proteinleri eğitim için yüksek verimli bir yöntemi çağırmak için adil. Umarım burada sunulan OPN'ler protokol E sınırlarını zorlamaya yararlı bir araç olabilirM küçük protein yapısı, dinamikleri ve mekanizmaları içine EM çalışmaları hızlandırmak ve.

Introduction

Protein işlevini anlama protein yapısının bilinmesini gerektirir. 200 kDa - Yapısal tayini, moleküler kütleleri 40 içinde olan proteinler için meydan okuyor. X-ışını kristalografisi, protein kristalleştirme ile sınırlıdır; kriyo-elektron mikroskobu (cryo-EM) molekül kütleleri daha az olan, her ikisi de görüntü elde etme ve küçük proteinlerin üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon, zorluk vardır ise nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, 40 KDa daha az moleküler kitlelere sınırlıdır 200 kDa'dan. Özellikle, en fazla% 50 protein, 40 aralığında bir moleküler kütleye sahiptir - mevcut yöntemler bu boyutta proteinleri meydan okuyan gibi, 200 kDa ^1,2, yeni bir yöntem gereklidir.

En transmisyon elektron mikroskopları (dardı) atomik çözünürlükte, yani daha iyi 3 Å çözünürlük yeteneğine sahip olmasına rağmen, bir biyolojik örneklerden bile yakın bir nanometre çözünürlük yapıya ulaşmak yerine challen olduğunuretlendirici ^7. Radyasyon hasarı, düşük kontrastlı, yapısal sapmalar yanı sıra dehidrasyon gibi eserler tüm yüksek-çözünürlüklü TEM görüntüleme ^3,8 engellemektedir.

Çeşitli TEM yaklaşımlar arasında, cryo-EM yakın fizyolojik koşullar altında ^9-12 derece simetrik büyük moleküllerin atomik çözünürlükte yapıları başarmak için gelişmiş ve kesme kenarı yöntemdir. Krio-EM numune daha sonra, sıvı azot veya helyum sıcaklık ¹³ olarak çok düşük sıcaklık derecelerinde görüntülü camsı buz içinde gömme makromolekülleri, örnek çözeltinin dondurulması flaş hazırlanır. Bu örnekler hiçbir eserler sunmak ve yapıda ^8-12 neredeyse yerli şunlardır cryo-EM avantajlıdır. Ek cihazlar takılı veya cryo-EM yeteneği için bir standart TEM araç yükseltmek için satın gerekmektedir: i) cryo-EM dezavantajları var. Cihazlar şunlardır: Anti-contaminator cryo tutucu, düşük doz şekli yazılım ve düşük doz sensitif CCD kamera, bu cihazların fiyatları TEM enstrümanın kendi fiyat çok daha düşük olmasına rağmen; ii) cryo-EM operasyon NS operasyon daha uzun zamana ihtiyacı var. Cryo-EM örneği incelenirken sık sık NS daha TEM enstrüman örneklerini hazırlamak ve işletmek için daha uzun zaman gerektirir cryo-EM gibi ek zorluklar, adresleme gerektirir çünkü: sıvı azot sıcaklığı çalışma, örnek şarj, görüntüleme sürüklenme, sıcaklık değişimleri, düşük doz Model çalışması, örnek radyasyon duyarlılıkları ve dozaj kısıtlamaları. Birkaç cryo-EM görüntülerin kesinlikle dengeli bir sıcaklık gradyanı ile hazırlanan cihaz ile cryo-EM uzmanları tarafından 1 saat veya daha az elde edilebilir, ancak bu ekstra adımlar, NS veri toplama oranla yararlı verilerin elde hızını yavaşlatacaktır; iii) kullanıcıların görüntüleme proc, cryo-EM ızgaraları, düşük doz operasyon, doz ölçümü dondurma, sıvı azot taşıma şarj taşıma, sürüklenen ve bilgi gibi ek eğitim gerektirmektediressing; Farklı TEM oturumları sırasında aynı cryo-numune için tekrarlanabilir görüntüleme iv) eksikliği. Cryo-EM örnekleri kolayca TEM enstrüman için / örnek yükleme ve boşaltma sırasında buz kirlenme zarar görür. Bu hasar numuneler izole edilmesi zor olan, özellikle bir husustur / ¹⁴ saflaştırılmış; v) küçük proteinler (<200 kDa molekül kütlesi) meydan çünkü kontrast düşük yansıması için; vi) cryo-EM görüntülerin düşük kontrastlı ve yüksek gürültü özellikle yapısal esnek olan proteinler için protein yönelimleri, konformasyonlarına ve sınıflandırılması, belirlenmesi genel doğruluk azalan, bu nedenle, görüntüler arasında çapraz korelasyon değerini azaltır ve doğal çözelti içinde dalgalanma ^4,5.

Negatif boyama (NS), herhangi bir laboratuvar, herhangi bir tür EM ile protein yapısını incelemek için kullanabileceği nispeten "eski" ve tarihsel yöntemdir. Brenner ve Horne birinci kavram o gelişmişf virüsleri ¹⁵ incelenmesi için bir buçuk asır önce negatif boyama. NS şarj ağır metal tuzları ile örnek kaplanması ile gerçekleştirilir. Bu kavram aslında ışık mikroskobu ve olumsuz imajını ¹⁶ görüntülerken daha yüksek görüntü kontrastı sağlayan, örneklerin etrafında karanlığı veren bir leke solüsyonu içine bakterilerin gömme uygulama geliyor. Bahsedilen ağır metal iyonları, proteinlerin ^17-20 daha az yoğun atomuna göre elektron dağıtmak için daha büyük bir yeteneğe sahip ve kaplama ağır metal lekesi olan gelişmiş kontrast ile daha yüksek bir doz sınırlama olanak tanıdığından. NS örnek kolay parçacık yönelim belirleme ve cryo-EM görüntülerin daha 3 boyutlu rekonstrüksiyon için yüksek kontrastlı görüntüler ⁸ sağlayabilir.

Geleneksel NS, ne yazık ki, düzleştirme ve istifleme ^8,21,22, genel agregasyonu, moleküler ayrılma gibi leke-protein etkileşimleri, neden eserler üretebilir. Lipit ilgili koruma içinlipoproteinler ^16,23-30 gibi ins, yığılmış ve bir Rouleaux bir araya (Şekil 1) ^31-36 paketlenir parçacıkların ortak bir artefakt sonuçları. Bu nondenaturing poliakrilamid gradyan jel elektroforezi gibi birçok lipoprotein çalışmaları, cryo-EM tüm göstermek lipoprotein partikülleri izole edilmiş parçacıklar yerine doğal olarak yığılmış olan kütle spektrometrisi ^39,41 ve küçük açı X-ışını difraksiyon bulguları, ^{42, 13,29,37-40} çalışmaları birlikte bir rulo ^{21,29,30,35,42-45} oluşturulması. Geleneksel NS tarafından bir rulo oluşumunun gözlenmesi muhtemelen standart protokole NS çözeltisi ^{13,29,30,46-49} ve hassasiyet, yapısal olarak esnek apolipoproteinler (APO) ve fosfolipidlerin oluşan lipoproteinler arasında dinamik etkileşimin yol açtığına. Bu objeyi tanımlamak için, apolipoprotein E4 (ApoE4) palmitoil-oleoylphosphatidylcholine (POPC) vb, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) bir numunesi, bir deney numunesinde kriyo olarak kullanılmıştırKoşulları bir dizi altında hazırlanmış NS örneklerin taranması bir artifaktsız standardı ^29, EM görüntüler. NS Krio-EM ile elde edilen parçacık boyut ve şekillerde karşılaştırarak, boyama maddesi ve tuz konsantrasyonunun spesifik bir tipi, iyi bilinen bir rulo durumu meydana iki temel parametre olduğu bulunmuştur. Bu durumda, optimize edilmiş bir negatif boyama (OPN) protokolü bildirilmiştir.

OPN'ler tarafından, ApoE4 HDL iyi bilinen bir olgudur OPN'ler bir rulo (Şekil 2A) ile ayırt edildi. İstatistiksel analiz cryo-EM gelenler karşılaştırıldığında OPN'ler verimlerle boyutu ve şekli çok benzer görüntüleri az (% 5 sapma) gösterdi, ancak kontrast elendi. OPN'ler arasında doğrulamaları neredeyse tüm sınıfları ya da apoA-I 7,8 nm (Şekil 2B), 8.4 nm gibi lipoprotein örneklerinin ^{6,29,30,50,51,} alt-sınıfı bir rulo artefaktının ortadan kaldırılması incelenerek yapılmıştır (Şekil 2C) , 9.6 nm discoidal HDL (rHDL) (Şekil 2B), 9.3 nm küresel rHDL (Şekil 2E), insan plazma HDL (Şekil 2F), lipit serbest apoA-I (Şekil 2G), plazma HDL (Şekil 2H), düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL yeniden ) (Şekil 2I), orta yoğunluklu lipoproteinler (IDL) (Şekil 2J), çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL) (Şekil 2K) ve POPC lipozom (Şekil 2 L) ^30. (Şekil 4A ve B) ^{4,5,29 6,29} ve oldukça esnek 160 kDa'lık bir IgG antikorunu - İlave doğrulamaları küçük ve asimetrik proteinleri görüntüleme 53 kDa, kolesteril ester transfer protein (CETP) (Cı Şekil 3A) verilen gerçekleştirildi ^{, 52,} ve iki yapısal olarak iyi bilinen proteinler, GroEL ve proteazom (Şekil 2 M ve N). C herhangi bir ek doğrulama gerektirenolleagues, bu OPN'ler yöntem herhangi bir kör test açıktır.

OPN'ler yüksek verimli bir protokol, CETP, lipoproteinlerin 4 sınıflarına yeniden birleştirildi HDL etkileşim de dahil olmak üzere, bir dizi şartlar altında değişik proteinlerin (örneğin bağlanma edildi CETP gibi küçük proteinlerin örnekleri, yüzlerce incelenmesi ile, protein mekanizma üzerinde çalışmak için kullanılan gibi, HDL, LDL ve VLDL, / 3 dakika, 20 dakika, 1 saat, 2 saat, 4 saat, 8 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saat dahil olmak üzere 9 inkübasyon süreleri altında 2 antikorları, H300 ve N13, olmadan dahil olmak üzere, 4 ve 3 dilüsyonlar, yani 0.1 mg / ml, 0.01 mg / ml ve 0.001 mg / ml, ve ek kontrol örnekleri, 4 altındaki mol oranları, yani, 1: 0.5, 1: 1: 1, 2, 1 farklı kişiler tarafından Yukarıdaki deneylerin) ^6,29 üçlü testleri ile, tek başına, CETP, tek başına, LDL ve VLDL,. OPN'ler CETP'nin görüntüleri makul ince yapı detayları ile yüksek kontrastlı görüntüler sağlanan; bize izin başarıyla 53 kDa sma bir 3D yoğunluk haritası yenidenll protein CETP (Şekil 3D - F) tek parçacık yeniden tarafından. Bize ara madde çözünürlüğü tek bir (± 1.5 mil) (bir nesne, bir ortalama) IgG antikoru 3D yapısı elde etmek için izin - Ayrıca, yüksek kontrastlı OPN'ler görsel bize bağımsız bir protein (C Şekil 4A) için yeterli bir sinyal sağlamak ⁵ - bireysel parçacık elektron tomografi (Ipet) yöntemi (J Şekil 4E) aracılığıyla. Ipet yeniden strateji, yöntem, adım adım süreçleri ve yapısal varyasyon analizi ayrıntılı bir açıklama, daha önce ⁴ bildirilmiştir. YouTube'a ⁵ yüklenen tarafından ham görüntüleri ve ara sonuçları, 3D yoğunluk haritası ve yapısal yerleştirme dahil Ipet antikor rekonstrüksiyon prosedürleri hakkında bir film halka da kullanılabilir. Farklı bireysel antikor parçacıklardan 3D rekonstrüksiyon karşılaştırılması protein dinamikleri ve c ortaya olabilirkimyasal reaksiyonlar sırasında ^4,5 onformational değişir.

KDa ^1,2 200, bu küçük proteinlerin görüntülenmesinde başarı OPN'ler yöntem, küçük ve asimetrik yapısal belirlemeler ve mekanizma keşifler doğru geleneksel EM sınırı itmek için yararlı bir araç olduğunu kanıtladığı - proteinlerin% 50 üzerinde 40 arasında değişen moleküler kütleye sahip olduğunu düşünüyor . Bu nedenle, ayrıntılı bir protokol aşağıda verilmiştir.

Protocol

% 1 Taze negatif boyama solüsyonu 1. Hazırlama (a / h)

1. Karanlık bir odada ya da kutu içinde 100 ml deiyonize su ihtiva eden bir cam şişeye, 1 mg Uranil format (UF) toz koyun.
2. Bir karanlık oda / kutu içinde oda sıcaklığında çözelti O / N karıştırın. Çözelti isabet ışığı engellemek için alüminyum folyo ile çözelti şişe sarın.
3. Yavaşça 0.2 mikron ile (gözenek büyüklüğü) filtre, bir 5 ml şırıngaya monte solüsyonu filtre. Filtrelenen solüsyon birkaç alüminyum folyo kaplı Falcon tüpleri içine toplandı. Filtre şırınga, aynı zamanda ışığa maruz engellenmesi için alüminyum folyo ile sarılmış olması gerekir.
4. 1 ml şırınga üzerine monte 0.02 um (gözenek büyüklüğü) üzerinden tekrar filtre solüsyonu filtre. Süzülen çözelti 2 ml'lik viyallere toplandı ve kısım edilmiştir. Şırıngalar ve flakonlar kullanımdan önce alüminyum folyo ile örtülmüştür.
5. Hemen bir sıvı nitrojen dolu kabın içine şişeleri daldırarak uzun saplı forseps kullanarak tümbölen şişeleri Freezesonra, çözelti süzülmüştür.
6. Depolama ve gelecekteki kullanım için -80 ° C derin dondurucu içine dondurulmuş şişeleri aktarın.

Negatif Boyama Workstation ve Kuluçka Workstation 2. Hazırlık

1. Oda sıcaklığında ayarlanmış bir su banyosu içinde,% 1 UF çözeltisinin bir şişesinin çözülme. Alüminyum folyo ışık maruz kalmasını önlemek için şişenin etrafına sarılı kalır emin olun.
2. Tamamen 1 ml'lik bir enjektör 0.02 um filtre ile monte sarılmış bir alüminyum folyo ile çözülmüş sonra ne solüsyonu filtre. Şişeyi sarılmış yeni bir alüminyum folyo içine süzüldü çözüm toplamak ve kullanım için bekleyen bir kap kaplı buz kutusunun içine buz üzerine yerleştirdi.
3. Boş bir protein kristalleşme plaka yüzeyine bir ~ 8 inç uzunluğunda Parafilm Ön iterek parmağı ile çözüm plakaları olun. Bu ~ 5 mm çapında bir dairesel levha satır üretecektir. Bir buz içinde buz yassı bir yüzeyi üzerinde Parafilm ™ levhalar içeren, her satır yerine 6 plakaları yapmaker bir kapak, boyama iş istasyonu olarak.
4. Pipet ~ 35 ul her satırda kalan üç plakaların her üzerine deiyonize su ve pipet ~ 35 ul her satırda sağ üç tabak için UF çözüm süzülür. Proteinler boyamadan önce ışığa maruz kalmasını önlemek için bir kapak ile boyama iş istasyonu örtün.
5. Buz ile boş bir kutu yarım doldurarak bir EM ızgara inkübasyon istasyonu hazırlayın ve bir destek tabanı üzerine monte edilebilir bir askı yanına yapıştırılır. Cımbız 'ipuçları yakındaki buz yüzeyi olduğu askı örnek cımbız, yerleştirin. Yarım kutu dudak yüksekliği ile cımbız 'ipuçlarını kapsayacaktır. Bir kuluçka istasyonu yapmak için ideal bir buz kutusu boş bir pipet uçları kabı kullanıyor.

3. OPN'ler Operasyon

1. Ince karbon film 10 sn için 300 örgü bakır EM ızgaraları kaplı Glow-deşarj.
2. Cımbız ile bir ızgara Pick up ve buz üzerinde 45 ° eğim ve 1 inç ızgara tutarak askının içine cımbız kancaKuluçka istasyon iç yüzeyi.
3. ~ Nihai protein konsantrasyonunda tekrar ~ 0.01 ila 0.005 mg / ml Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu çözeltisi (DBP) ile, protein örnek seyreltilir. Depozit ~ 4 ul hemen EM ızgara karbon tarafındaki seyreltildikten sonra numunenin seyreltilmiştir. (Protein DPBS hassas ise, DPBS bir tampona değiştirilebilir)
4. Kuluçka istasyonu içinde ~ 1 dakika için EM ızgaraların üzerine örnek inkübe.
5. Hızlı bir şekilde filtre kağıdı ile ızgara kenarına temas yoluyla fazla çözeltiyi çıkarınız.
6. Fazla çözelti EM gridine çıkarıldı hemen sonra Parafilm tabakanın üzerine saf su yüzeyinin yaklaşık ilk damla (~ 35 ul) hızlı bir şekilde ızgara dokunun. Sonra filtre kağıdı ile derhal fazla suyu almak.
7. Parafilm kalan iki su damlacıklarının EM ızgara yıkayarak iki kez başka adımı tekrarlayın 3.6 (3.6 Adım ve numune suyun çok hassas ise 3.7 atlanabilir).
8. EM GRI Floathemen EM gridine fazla suyun sonra UF çözeltisi sağ ilk damla yüzeyi üzerinde uzaklaştırılmıştır d. Ve daha sonra 10 saniye boyunca inkübe edilir. UF çözeltinin yüzeyinde yüzen kılavuz önce 3 saniye içinde su ile yıkama işlemlerini tamamlamak için emin olun. Yıkama süresi daha kısa, daha kaliteli olacak.
9. - 3 kez ~ 2 için bir filtre kağıdının içine ipuçlarını nüfuz ederek cımbız temizleyin.
10. Filtre kağıdı ile ızgara kenarına temas yoluyla ızgara üzerinde aşırı çözüm çıkarın ve sonra UF ikinci damla ızgara yüzer.
11. İkinci damlacık adım 3.10 yukarıda devam edin.
12. UF çözeltisi damla üstünde üçüncü ızgara Float ve yaklaşık 1 dakika boyunca boyama istasyonu kapsamaktadır.
13. İsteğe bağlı adım: 3.6 de tarif edildiği gibi bir su üzerine hızlı bir şekilde ızgara yıkayın. Bu ek bir adım yüklenen ücretsiz altın parçacıkları veya leke arka plan üzerinde içeren örnekleri yararlanacaktır.
14. Inci filtre kağıdı dokunarak fazla çözeltiyi almak(karbon tarafının aksi) E tüm kılavuz arka. Sağ filtre kağıdına bir emici çözelti gözlemleyerek, oda sıcaklığında bir azot gazı akışı altında hafif bir ızgara kurutun.
15. Bir petri çanağı içine bir filtre kağıdı tabakası üzerine ızgara yerleştirin ve oda sıcaklığına altında en az 30 dakika süre ile kurumaya bir kapakla kısmen çanak kapsamaktadır. Bazı örneklerde, bir saat süre ile pişirme, 40 ° C inkübatör kılavuz getirin.
16. Inceleyerek gelecekteki EM için bir EM ızgara kutusu içine ızgara saklayın.

Incelenmesi 4. EM

1. Düzgün ızgara üzerinde küçük proteinlerin EM sınavdan önce TEM hizalayın.
   1. TEM düzgün hizalanmış olup olmadığını belirlemek için bir amorf karbon film güç spektrumu en yüksek görünür Thon-halkasının çözünürlüğünü kontrol edin. TEM birçok farklı kullanıcılar tarafından paylaşılan olduğundan, TEM genellikle düzgün hizalanmış değildi.
   2. Dikkatli bir şekilde hizalama conditio ayarlamak için numunenin karbon film alanı güç spektrumunun kontrolMakinenin: n. Yüksek görünür Rica-halkaları hedeflenen çözünürlükten daha iyidir.
      Not: 120 kV yüksek gerilim altında işletilen bir LaB6 filaman TEM uygun bir uyum bir örnek olarak, en fazla 20 Rica-ring, görselleştirilebilir eder, karşılık gelen 5,0 Â çözünürlük daha iyi olabilir. Bu Rica halkası 1.6 um'lik bir defokusta ~ 20,4 e / A2 (Şekil 5) bir dozun altında görüntülenmiştir şekilsiz karbon film Fourier transferi ile elde edilmiştir.
      NOT: Yüksek çözünürlüklü Thon-halkasının Gözlem gerekli bir şart değil, düzgün hizalama için yeterli bir durumdur. Aslında, yüksek çözünürlükte resimler elde etmek için, pek çok diğer parametreleri, örnek kalite, radyasyonun yol açtığı zarar ve şarj sürüklenen hem de aydınlatma doz oranı olarak da önemlidir.
2. Bir ideal lekeli alana küçük proteinlerin görüntülenmesi için yakın Scherzer'in odak geri bulanıklaştırma getirin.
3. Imag için "clear" alanında araör. Bir ideal lekeli alanı genellikle leke kalınlığı normal eşit karbon kaplı ızgara (Şekil 6) üzerine dağıtılmış olmadığından ızgara üzerinde bir "clear" alanı gibi görünen bir kalın leke alanının kenarına yakın yer almaktadır. Genellikle düşük bir büyütme (<100x) ilk görüntüleme için yakınlaştırma önce bu bulutlu alanları bulmak için yardımcı oldu.

Results

OPN'ler ait uygulamalar gibi çeşitli lipoprotein türlerinin yapısal ve morfolojik inceleme,: oluşmakta olan yeniden birleştirici HDL (rHDL), küresel HDL yeniden birleştirici, plazma HDL, LDL ve VLDL IDL (Şekil 2) ^30; Bu 53 kDa'lık CETP (EM ile başarılı bir şekilde görüntülenmiş olan en küçük proteinler arasında) (Şekil 3) ve ⁶ 160kDa IgG antikorlarının yanı sıra küçük proteinler (en dinamik ve heterojen proteinlerden biri) (Şekil 4) ^4,5,29,52 , hatta 28 kDa lipit ücretsiz apolipoprotein A-1 (Şekil 2L) ve GroEL ve protozomları (Şekil 2M ve N).

Yüksek verimli bir yöntem olarak OPN'ler diğer örnekleri, 53 kDa protein olarak, CETP mekanizmaları ortaya çıkardığı için, protein-protein etkileşimleri incelenmektedir. Investıgatıon Giriş kısmında tarif edildiği gibi, ne CETP lipoproteinlerin farklı alt sınıfları ile etkileşim olduğuted Bildiğimiz gibi 400'den fazla EM örneklerini ⁶ inceleniyor, TARAMA yaklaşık yüz farklı koşullar içeren cryo-EM çalışmanın böyle bir durum yoktu.

OPN'ler küçük ve asimetrik protein 3D yapısını incelemek ve hatta 3D yapısı (ortalama olmadan) tek ve bireysel proteini oluşturmak ulaşmak için genişletmek EM sınırlarını genişletebilirsiniz. Örneğin IgG antikor ara çözünürlükte 3D yeniden elde edilmesi zor olduğu son derece esnek bir yapıya sahip olan 160 kDa'lık bir moleküldür. OPN'ler yöntem eğilme açısında (Şekil 4E ve h) bir dizi görüntü için tek bir IgG antikoru kullanılmıştır. ^4,5 - bireysel parçacık elektron tomografisi (Ipet) (J Şekil 4E) tek bir proteinin başarılı inşası için izin OPN'ler gelen makul yüksek çözünürlüklü ve yüksek kontrastlı protein görüntüler. Ipet 3D rekonstrüksiyonu ^{(Şekil 4F ve G) bir 3B yoğunluğu elde etmek için, daha sonra tekrar eden yeniden yoluyla hesaplanan küresel merkezi ile aynı hizada olarak 4. Aynı yolla, bir tek antikor-peptit kompleksi yeniden inşa edildi ve peptit (çözünürlük ~ 16.6 a Şekil 4I ve J) 4,5 keşfedilen bir tek antikor ya da bir parçacığın iç alanı, yapısal bir değişikliğe neden oldu. Farklı bireysel parçacıklardan 3 boyutlu rekonstrüksiyon karşılaştırılması, yapısal analiz, bir kimyasal reaksiyon 4,5,29,53,54 bir ara aşamalar "-shot ek" bile bize protein termodinamik dalgalanmaları ortaya çıkarmak için izin olabilir ve.}

Özetle, 40 kDa arasındaki moleküler kütleye sahip proteinler - 200 kDa standart EM yapısal muayene ve rekonstrüksiyon için zorlu. Düşünülürse% 50 üzerindeproteinler 40 arasında değişen moleküler kütleye sahip E - kDa ^1,2 200, küçük ve asimetrik yapısal belirlemeler ve hatta mekanik çalışmalar doğru geleneksel EM sınırı itmek için sağlam ve yüksek verimli bir araç olarak bir OPN'ler yöntem rapor.

Konvansiyonel negatif boyama (NS) EM ile lipoproteinlerin 1. Rouleau dışlayıcı Şekil. (Panel aşağıda) Elektron (panel ile elde edilmiş) ve mikrograflan seçilen parçacıklar standart karışımı prosedürü altında fosfotungstik asit (PTA) sonra bir rulo ile NS çeşitli lipoproteinler göstermektedir. ApoE4 (A) yeniden oluşturulmuş HDL'nin, (rHDL), (B) apoA-l-ihtiva eden 9.6 mil diskoidal rHDL, (C), plazma LDL (D)-olmayan apolipoprotein içeren lipozomlar ihtiva eden POPC apo. Barlar: 50 nm. Pencere boyutu: A ve C, 20 Km; B, 30 nm. Lipid Research Dergisi başlangıçta bu işi ^29,30 yayınladı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

. (OPN) üzerinde EM elektron mikroskobu OPN'ler göre bir rulo artefaktsız farklı lipoproteinleri ve lipozomlar göstermektedir optimum negatif lekeleme ile Şekil 2. Protein yapı (A) 'rHDL ApoE4 içeren;. (B), 7.8 nm rHDL, (C) 8,4 nm rHDL ( D) 9,6 nm rHDL, (E) 9,3 nm küresel rHDL, (F), insan plazma HDL-α, (G), plazma HDL (H) İnsan plazma LDL (I) insan plazma IDL, (J), insan plazma VLDL; (L) lipit serbest apoA-I. Ek doğrulama (M) Groel ve (N) Proteazom örnekleri kullanılarak yapıldı. Mikrograflan (yukarıda paneller) ve (panel aşağıda) seçilen parçacıklar. Barlar: 50 nm. Pencere büyüklüğü: A - D, 20 nm; E ve F, 25 nm; G, 20 nm; H, 25 nm; I, 50 nm; J ve K, 100 nm; L, 80 nm., Lipit serbest apoA-I, GroEL ve proteasome dışında, Bu araştırma aslında Lipid Research ^29,30 Dergisi'nde yayınlandı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil CETP 3. OPN'ler elektron mikroskop. (A) CETP (kesik daireler) ile Genel Bakış mikrografıdır muz şekilli parçacıklar. (B) Windoweham partikülleri seçmek d. (C) Üç tek ham CETP parçacık görüntüleri net diğer küçük, hafif ve dar ucu (sol panel) de dahil olmak üzere bir büyük, daha ağır ve daha büyük küresel ucu gösteren, üst görünüşünü daha az genel eğrilik benzer terminal bölgelerini gösteren (orta CETP (sağ panel) uzun ekseni aşağı panel) ve bir uç görünüşüdür (D) kristal yapısına (PDB üst üste konması,:. bu ham KETP parçacık görüntü üzerine 2OBD) olabilir oryantasyonunu gösteren, hem yapısal etki şekli ve boyutu iyi bir uyum sağlar yaklaşık olarak doğru da bilgisayar ((C) karşılık gelen paneller) ile yardım almadan tanımlanabilir. (E), bu rasgele bir şekilde yerleştirilen parçacıkların benzerlik (çapraz-korelasyon hesaplama) hesaplamak için serbest 2B sınıf ortalamaları (ab initio bir süreç, bir referans olan parçacıklar birbirine yüksek benzerlik, gruplandırılmış hizalanmış ve sonra arka plan gürültüsünü azaltmak için ortalama ve partikül görüntü con arttırılmıştırkontrast. Referans ücretsiz 2D sınıfı ortalamalar hangi, hiçbir insan yapımı ilk modeli bu sınıf ortalamasının karıştığı, EMAN pakette refine2D.py yazılım tarafından hesaplanır. Referans sınıf ortalamaları) tek parçacık yeniden gelen 3 boyutlu rekonstrüksiyon doğrulamak için bağımsız bir yöntem olarak kullanılabilir. (F) Seçilen referans ücretsiz 2D sınıfı ortalamaları diğer kıyasla daha büyük bir uzak ucunu göstermektedir. (G) Binen kristal yapısı (PDB :, bindirme görüntüleri yapısı şekil ve alan boyutu (düşük paneli) hem kristal yapısı ve referans ücretsiz sınıf ortalamasının arasındaki yakın mükemmel eşleşmeleri referans serbest ortalamalara 2OBD) karşılaştırma göstermek (F) en CETP'nin 3D yoğunluğu haritası. 13 Å çözünürlük OPN'ler ve tek parçacık rekonstrüksiyon yöntemi (üst panel) ve kristal yapısı (düşük paneli) tarafından bu tek-parçacık yeniden içine yerleştirilmiş çıkıntılı-vücut tarafından görüntülendi 8.879 parçacıklardan yeniden inşa edildi. Detgörüntü ön işleme, başlangıç ​​modeli, arıtma işlemleri, açı dağıtımı ve Fourier Shell Korelasyonu (FSC) içeren tek parçacık rekonstrüksiyon ailed bilgi, yöntem bölümünde yayınlanan edildi ve orijinal kağıdın destekleyici bilgiler (H) tek parçacık yeniden Final karşılaştırılması ( panel) ve ek PDB uygun karşılaştırma (alt panel) üzerinde ^6. Barlar: A, 50 nm; B - D, 10 nm; F, 3 nm. Bu rakamların bazıları daha önce Doğa Kimya Biyoloji ⁶ yayınlandı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. OPN'ler görüntüleri ve İnsan IgG 1 antikor parçacıkların rekonstrüksiyon. (A) fazlainsan IgG1 antikoru OPN'ler görüntülerin görünümü. Beyaz çevrelerinde gösterilen Parçacıklar açıkça 3 subdomainli parçacıkları görüntüler. (B) elle dokunma olmadan herhangi bir (ham parçacık kenarını çevreleyen gürültüyü azaltarak beş ayrı ankonjuge antikor parçacıklar ve (C) karşılık gelen gürültü azaltılmış görüntüleri yüksek çözünürlüklü ham görüntüleri Seçilmiş kolayca görselleştirmek üzere, parçacıklar içindeki yoğunluk). (D) aynı şekilde EM görüntülere bir görüntüleme yönlenmiştir IgG 1 antikor kristal yapısı (PDB girişi 1IGT). Karşılık gelen görüntü karşılaştırması EM görüntü ve etki pozisyonları ve şekilleri de dahil olmak üzere kristal yapısı arasında pek çok ortak özellikleri göstermektedir. (E), bir örneği, tek IgG 1 antikor bir ab initio 3D rekonstrüksiyonu için adım adım prosedürü (bir ortalama, Bir tek nesne) bireysel parçacık elektron tomografi (Ipet) yöntemini kullanarak. (F) si nihai 3D rekonstrüksiyon14.1 çözünürlüğünde ngle antikor parçacık üç halka biçimli alanları bir "Y" şeklinde oluşturulması göstermiştir. (G) alanı yoğunluğu, sırasıyla ilgili haritalar ve manuel olarak etki alanları arasından halkaları tekrar her birine etki kristal yapılarını bir yuva. (Y) Ipet tek bir IgG-peptid kompleksi (hayır ortalama bir birey nesne) 3D rekonstrüksiyon adım için adım prosedürü. (I) bir IgG peptid kompleksi son 3D rekonstrüksiyon 16.6 Å çözünürlükte görüntülenen üç çubuk gösterdi bir "Y" şeklinde oluşturulması şekilli alanları (J), sırasıyla, her bir IgG antikor etki kristal yapısını (PDB girişi: 1IGT) yerleştirme. her bir çubuk şekli yoğunluklarda içine, az bir iç alan, yapısal bir değişikliğe işaret alan kristal yapıları eşleşen gösterdi peptid birleştirmeden sonra. Ayrıntılı prosedür, çözünürlük analizi ve istatistik orijinal yazıda anlatılan edildi 4 yayınlanan ve Bilimsel ⁵ Raporları. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Amorf karbon film Şekil 5. Güç spektrumu bir Zeiss Terazi 120 LaB6 TEM ile 1.6 mikron flulaştırmayla altında görüntülenmiş. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme EM uygun hizalama ve yüksek çözünürlüklü yeteneğine sahip olduğunu göstermek için yeterli kanıt gerektirir. Izgara Yakın karbon alanının güç spektrumunun analizi öncesinde, veri toplama için ışın tutarlılık durumunu kontrol etmek için etkili bir yöntemdir. Amorf karbon alanın görüntüsünün Fourier transferi (C cihazla ilgili kontrast transfer fonksiyonunu göstermek TF), yani Rica-halkaları denir. Uygun bir uyum ve tutarlılık görünür Rica-halkaları sayısı ve nispeten yüksek bir bulanıklaştırma koşul altında görünür Thon halkaların yüksek çözünürlük ile yansıtılabilir. / Å ^{2 -} _LaB6 lif donanımlı TEM yakın bir düzgün hizalama durum bir örnek olarak, 20 Thon halkalar (~ 5 Å) bir karbon film elde edilebilir ~ fazla 20.4 e doz kullanılarak 1.6 mikron defokusta görüntülenmiş. Düşük uç TEM elde Rica Halkalar, uygun bir hizalama koşulları altında işletilen bir alan emisyon gun (FEG) geliştirilmiş TEM gibi yüksek-uç TEM gelenle benzer sahiptir. Başlangıçta Bilimsel yayınlanan bu çalışma ⁵ Reports. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

6highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil OPN'ler görüntüleme için "ideal" bir alanlarında 6 Örnek mikrograflan. Üç protein numuneleri (A) GroEL (B) 'Proteazom (C), küresel HDL, görüntüleme için ideal OPN'ler göstermek için örnek olarak kullanılmıştır. Lekeleri düzensiz dağıtılan örnek olduğundan, numune, düşük büyütme genellikle "bulutlu" (en soldaki paneli) belirir. Görüntüleme için ideal bölgeleri normalde bu "bulutlar" ın sınırları içinde yer almaktadır. Bir örneği adım adım zoom-bir "clear" leke bölge (sol orta panel) parçacıkların yüksek çözünürlüklü ve yüksek kontrastlı görüntüler (sağ orta panel) ile başvuran yüksek büyütme görüntüleri gösterir. Parçacıkların Seçilen görüntüleri proteinlerin yapısı ayrıntıları (sağdaki panel) gösterir. Barlar:. 30nm büyük görüntülemek için tıklayınızBu rakamın r sürümü.

Şekil 7. OPN'ler prosedürlerin şematik bir diyagramıdır. (A) EM ızgara inkübasyon istasyonu, parlayan taburcu ızgara üzerinde örnek çözümü kuluçkaya basit istasyonu. Işığa leke temasını en aza indirerek, bir buz yatağın üzerinde su damlacıkları yıkama ve leke damlacıkları korumak için tasarlanmış (B) Boyama iş istasyonu,. (C), boyama işlemi genel bakış gösteren: kurutma yönü, 3x su ile durulama, 3x UF leke maruz kalma, leke damlacıklarının ters örnek ızgara ile Boyama inkübasyon, ve son arka örnek edilerek kurutulmadan önce örnek boyalı çözeltinin ince bir tabaka sağlamak için lekeleme azot hava. th daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızrakamdır.

Şekil 8. Yüksek - 53kDa küçük protein CETP'nin çözünürlüklü görüntüler değiştirilmiş OPN'ler yöntem, cryo-pozitif-boyama (cryo-PS) gelen ortaya Five yüksek çözünürlük ve dairesel şekli (ters kontrast) CETP parçacıkların yumuşak maskeli ham görüntüleri seçin. ve parçacık şekli kolaylıkla görselleştirmek için (ancak parçacıkların içinde herhangi bir değişiklik yapmadan ham yoğunluğu parçacık görsellerin kenarları çevresinde el ile düşük gürültü) ham parçacıkları maskeli. Tüm atom ve şerit kristal yapısı karşılaştırma EM görüntüleri her parçacığın benzer yönelimleri hizalanmış ham parçacıkları maskeli için. Tüm kristal yapı özellikleri ham veriden çözülebilir ise ham görüntü alanlarının yüksek çözünürlüklü detaylar, kristal yapısı ile bazı benzerlikler göstermektedir. Remarka bly, bu ham görüntüleri Her iki terminalde benzerlik elle azaltılmış gürültü görüntüleri (üçgenler) görülen yakındaki küçük dairesel deliklere sahip bitiyor göstermektedir; Ayrıca, parçacık görüntü içindeki C-terminal bölgelerinde şeritler kristal yapısını tamamlayıcı β-tabakalar (oklar) ve son olarak, CETP C-terminal bölgesinde üzerine çıkıntı yapan döngüler kristal yapısı (karo) olarak benzer olan (A). beş seçim (ters kontrast ile) CETP parçacıkların yüksek çözünürlüklü ve dairesel yumuşak şekil maskeli ham görüntüleri. (B) 10a filtreleme Düşük geçiş. (C) 20a filtreleme Yüksek Düşük geçiş. (D) elle gürültü azaltılmış görüntüleri Maskeli. (E) Şerit yapısı ile kristal yapı karşılaştırması. tüm atom temsilciliği tarafından (F) Kristal yapı karşılaştırması. Bar: 5nm. Bu işin bir parçasıdır Doğa Kimya Biyoloji ⁶ yayımlandı.sıska "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 9. tuzluluk farklı altında klasik NS protokolü (PTA leke) tarafından rouleau oluşumunu gösteren lipozom elektron mikroskobu. (A) Yüksek tuzluluk (~ 0.5 M NaCI). (B) 'Normal tuzluluk (~ 0.25 M NaCI). (C) Düşük tuzluluk (~ 0.1 M NaCI). (D) saf su. Mikrograflan (panelde yukarıda) ve gösterilen (panelinin altında) seçeneğini pencereli parçacıklar. Barlar: 100 nm. Pencere boyutu: 80 nm. Lipid Research Journal aslında bu işi ³⁰ yayınladı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Geleneksel NS teknikleriyle kıyaslandığında OPN'ler rouleaux eserler (Şekil 1 ve 9), güvenilir ve makul yüksek çözünürlük (~ 1 nm) küçük proteinlerin yapısal ayrıntıları veren (Şekil 2) önleyebilir. Krio-EM ile karşılaştırıldığında, yüksek bir verim OPN'ler yöntem sağlar ve protein ve protein-protein etkileşimleri ⁶ çeşitli inceleyebilir. Bununla birlikte, yine de OPN'ler dezavantajları vardır. Geleneksel NS ile karşılaştırıldığında, OPN'ler gerektirir: numune hazırlama i) daha karmaşık adımlar; ii) bir radyoaktif madde, UF kullanarak; iii) nedeniyle nedeniyle ışık duyarlılığı UF leke kısa gücüne taze leke tutmak; iv) çöktürme UF çözelti, -80 ° C'de saklanır ve kullanılmadan önce çözünmesi gerekmektedir gerekir önlemek; v) ve nihayet tüm UF tehlikeli atık olarak ele alınması gerekir. Cryo-EM karşılaştırıldığında, OPN'ler nispeten daha düşük çözünürlüklü görüntüleri ve herhangi henüz keşfedilmiş değil dışlayıcı hiçbir garanti sağlarGelecekte.

Lipoprotein rulo oluşumu NS işlem usul etkisi

Ile damla damla ¹⁶ ve yıkama prosedürlerinde ^{29, 55} karıştırılması için muayene ^16,29-36,55 proteinlerinin hazırlanması için yöntemler ⁵⁰ NS protokoller arasında üç ana grupta sınıflandırılabilir. i) karıştırma protokolü belli bir oranda, leke ve protein örneğinin ön karıştırma gerektirir ve son olarak da EM incelemeleri ⁵⁵ hava kurutma işleminden önce filtre kağıdı ile fazla alınarak, bir ızgara üzerinde kaplı karbon filmi üzerine karışık çözeltinin uygulanması aşamaları ile. ii) açılan-by-damla protokol sonradan leke bir damla (~ 4 ul) uygulamasından önce fazla numune çözüm çıkarmadan, ~ 1 dakika boyunca karbon icar oturup kaplı bir EM ızgara doğrudan (~ 4 ul) örnek damla uygulayarak içerir Izgara aynı tarafında çözeltisi. Inkübasyondan ~ 1 dakika sonra, excès kaldırmatemiz filtre kağıdı ile temas yoluyla s leke, nihayet hava kurutma ^16,56-58 için göndererek. iii) yıkama protokolü (Şekil 7) daha sonra doğru filtre kağıdı ile ^3,29,30 Solüsyonun aşırı olan miktarı her zaman çıkarılmasından sonra, iyonu giderilmiş su ile üç kez yıkanarak, 1 dakika boyunca karbon ile kaplanmış bir EM ızgara numune çözeltisi uygulama gerektirir. OPN'ler protokolü bu yıkama prosedürü modifiye edilmiştir.

NS leke türleri ve lipoprotein rouleaux oluşumu üzerine etkileri

NS nedeniyle ağır metal lekeleri için güçlü elektron saçılması proteinlerden ^17-20,59 gelen kontrast sağlar. NS örnekleri ayrıca daha fazla radyasyon dozları acı ve keskin bir negatif kontrast ^8,9,60 protein özelliklerini artırabilirsiniz. Ağır metallerin lekeleri gibi sınıflandırılabilir: fosfotungstik asit (PTA) ¹⁶ de dahil olmak üzere, anyonik, metilamin tungstat ¹⁴ ve ⁶¹ silikon tungstat; ve katyonBöyle Uranil asetat (UA) ^62, UF ^3,29,30, ve Uranil nitrat (BM) ⁶³ gibi ic. En yaygın olarak kullanılan anyonik NS lekelerin bir PTA ^33,64-67 olduğunu. 7.5 - FTA ise tipik olarak yaklaşık 7.0 bir pH değerine kullanılan bir Hetero-poli asit, bir. PTA da pozitif boyanma ^3,16,68 için kullanılabilir. PTA olumsuz ücretleri hem lipoprotein ve lipozom yüzeylerde olumlu POPC gibi, baş gruplarını ücret doymamış yağların, elektrostatik etkileşimler aracılık edebilir. PTA hatta normal tampon tuzluluk ^29,30 (Şekil 1) altında, bu etkileşimin ^29,30 vasıtasıyla bir rulo oluşumuna neden olabilir. Bu UA, UF ve BM gibi Uranil lekeler, özellikle sık biyolojik örneklerin ^62,69,70 çeşitli NS için kullanılan katyonik ağır metaller lekeleri ve UA alternatif seçenekler vardır. Deneyler, örneğin UF POPC gibi doymamış yağ asidi lipidler içeren lipoproteinlerin hiç bir rulo neden bulunamadı. Bununla birlikte, yine de UF roule indükleyebilirBu dimiristoil fosfatidilkolin (DMPC) ve 1-heksadekanoil-2-oktadekanol-sn-glisero-3-fosfokolin (PSPC) gibi doymuş yağlı asit lipidler içeren lipoprotein aux oluşumu. Bu etkileşimin ayrıntılı mekanizması bilinmemektedir. UA / UF / BM düşük pH değerlerinde tüm iş 3,5-4,6 arasında değişen olabilir. Bu gibi düşük bir pH değeri pH ^14,71 duyarlı olan belirli biyolojik makro moleküller için uygun olmayabilir. İlginçtir, UA / UF bilinmeyen bir mekanizma ⁷² ile birkaç milisaniye içinde protein yapısını çözebilirsiniz. PTA farklı olarak, UA / UF bir asit tuzuna daha fazla benzemektedir.

(: 0.3 nm, BM: ~ 0.5 nm UF) ^3,74 UF bildirildi hangi, UF ve BM lekeleri UA daha küçük tane boyutları var, UA ⁷³ daha iyi sonuçlar sağlayabilir. UF uygulayarak negatif leke reaktifi olarak kullanıldığında ilginç bir örneği, küçük bir proteini (53 kDa KETP) ikincil yapı gibi bilgileri doğrudan ham mikrograflar görselleştirilebilirDaha önce kriyo-pozitif-boyanma (cryo-PS) yöntemi (Şekil 8) ⁶ bildirdi. Kriyo-PS, lekeli örnek l'de ikincil yapısal çöküşüne neden olabilir OPN'ler protokolü olarak kriyo-EM numune hazırlama prosedürü yerine kurutulması prosedürüyle dondurulmuş flaş oldu. Kriyo-PS küçük proteinlerle ⁷⁵ yüksek kontrast ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için bir yöntemdir. Cryo-PS görüntüleri bildirdi cryo-NS protokol ^22'den kıyaslandığında kontrast tersine, fakat geleneksel cryo-EM görüntüleri gelenler için tutarlı görüntü kontrastını sahip olduğundan dolayı, böylece cryo-PS yöntemi seçildi. Cryo-PS görüntüleri boyama reaktif, Uranil format, boyama sadece dış yüzey yapısını görselleştirmek ki geleneksel bakış açısına meydan okuyan, moleküler yüzeye nüfuz olduğunu göstermektedir. Uranil format moleküler yüzeye nüfuz nasıl mekanizması bilinmemektedir. Bir olasılık Uranil katyon mevcut bir protein karboksil gruplarına bağlanır ve böylece olmasıdırcamsı buz çevreleyen ve böylece pozitif bir leke olarak hareket eden protein ve Uranil gruplarının boyama daha düşük bir yoğunluğa sahiptir. Cryo-PS yöntemi X-ışını kristalografisi ^76-78 faz sorunu çözmek için ortak bir yaklaşım oldu birden isomorf yedek (MIR) yöntemine benzer. MIR olarak, kristal gibi, kendisine ait yerel biçimiyle izomorfik bir formunu elde etmek için, uranyum içeren bir ağır atom çözeltisi ile ıslatılır. Ağır atomunun eklenmesinin bazen kristal oluşumu ya da birim hücre boyutları ise fakat kristal yapı tayini ^76-78 arasında ek bilgi sağlar değildir. UF küçük tahıl yararlanarak, cryo-PS özellikle neredeyse tüm proteinler çözümü doğal olarak, dinamik ve heterojen olduğu göz önüne alındığında, protein yapı çalışmaları için önemli olan tek bir proteinin, yüksek kontrast ve yüksek çözünürlüklü görüntü sağlayabilir. Bu cryo-PS yönteminin doğrulanması için, EM alanının herhangi bir kör test için açın.

Lipoproteinlerde rouleaux oluşumu üzerine tuz konsantrasyonu etkiler

PTA negatif boyama geleneksel bir reaktif kullanılarak, gözlenen bir rulo oluşması daha olası yerine protein etkileşiminin lipit etkileşimi ile ilgilidir. Önemli bir tuzluluk (0,5 M NaCl), orta tuzluluk (0.25 M NaCI) nispeten zayıf tuzluluk (0.1 M NaCI) ve saf su (Şekil 9) göre hazırlanmıştır POPC, lipozom keseciklerinin örnekleri görüntüleme, elektron mikroskop rulo oluşumu olmadığını göstermek tuz konsantrasyonu (- D Şekil 9A) korelasyon. UF negatif boyama reaktif kullanılarak, hiç bir rulo hızlı bir şekilde boyanması, gerekli olan hemen önce, tuz konsantrasyonunu azaltmak için yıkama işlemini göstermektedir, POPC lipozom vezikül örnek ³⁰ (Şekil 2 lt) içinde görülebilir, fakat edildi ilgili POPC içinde bir rulo önlemek için yeterli değildir, bağımsız olarak adım örnekler.

TEM görüntüleme küçük protein yakın bir Scherzer'in odak koşul gerektirir.

Yüksek çözünürlükte küçük proteinlerin Başarılı TEM görüntüleme iki kritik durum, uygun bir ışın hizalama ve yakın bir Scherzer'in odak edinim durumunu gerektirir. i) Uygun bir ışın hizalama nispeten yüksek flulaştırmayla kapsamında edinilen bir karbon film görüntünün Fourier transferi görünür Thon halkalar (güç spektrumu) sayısı ile karar olabilir. Kirişin daha iyi hizalama durumu, daha Rica halkalar görülebilir ve yakın-Scherzer odak altında ölçülebilir .. ii) sahip olmak görüntü bir başka önemli bir durumdur. Biyolojik numune görüntü kontrastını ⁷⁹ artırabilir - (2 mikron ve daha 1), biyolojik örneklerin görüntülenmesi için geleneksel bir standart strateji genellikle yüksek bulanıklaştırma kullanır. Bu strateji, hangi sıklıkla, sert malzemelerin atomik çözünürlükte yapısını görüntüleme için tipik stratejisi farklıdır önemliyakın bir Scherzer'in odak (~ 50 nm bulanıklaştırma) kullanır. , Daha yüksek bir bulanıklaştırma biyolojik numune kontrastı güçlendirmek rağmen, yüksek çözünürlüklü sinyalleri kısmen ortadan kaldırılabilir. Bunun bir sonucu olarak, yüksek çözünürlüklü bir sinyalin daha yüksek bir odaksızlık suç görüntüleme durumda daha düşük olacaktır. Bunun nedeni, bir TEM görüntüsü örnek yapının evrişim ve gösterge CTF olduğu yönündedir. CTF eğrisi sık sık yüksek sıklıkta sıfır geçiş salınım amplitüdü, frekans karşı bir salınım eğrisidir. Her zaman CTF sıfıra karşısında, bu özel frekanstaki örnek yapısal sinyal (sıfır kere herhangi bir sayı sıfır olacaktır) ortadan kalkacaktır zaman. Bu frekansta elendiği sinyal herhangi bir CTF düzeltme algoritması (yerine orijinal yapısal sinyalin herhangi rastgele bir sayı olabilir bir sıfır bölü sıfır) tarafından kurtarıldı asla. Daha yüksek bir odaksızlık görüntüleme altında, CTF, daha agresif ve böylece CTF bir sonucu olarak, daha sık olarak sıfır genliği geçer salınmadığıbelirli frekanslarda daha fazla sayıda yapısal sinyalleri ortadan kalkacaktır. Elimine edilir daha sinyaller, daha az suç görüntü olacaktır. Özellikle, görüntünün suç kurtarılan veya herhangi bir CTF düzeltme tarafından düzeltilemez. Bununla birlikte, farklı odak dışı ile elde edilen görüntü tamamlanmamış bir sayısı daha bir atomik çözünürlükte ^9-12 elde edilebildiği bir ortalama alma yöntemi vasıtasıyla, örnek yapının elde tamamlanmış bir yapısal sinyaline birbirlerine boşlukları doldurmak için kullanılabilir.

Ortalama yöntemi, bazı çok simetrik proteinler ve yapısal olarak ilgili sert proteinlerin yapısını elde etmek için güçlü bir yaklaşımdır. Ancak yine de özellikle antikorlar ve HDL gibi yapısal dinamikleri ve esnek proteinler, için, küçük ve asimetrik proteinlerin yapısal çalışmada zorlu kalır. Ortalama protein parçacıklarının yapısı ve biçimi, ancak di özdeş olduğu varsayımına dayanmaktadırfferent yönlerde Ancak birçok protein çözeltisi içinde termodinamik dalgalanma geçtiği bilinmektedir. Daha önce protein termodinamik dalgalanma dalgalanmaları bilmeden ortalama yöntemi uygulayarak, ortalama yapısı genellikle etki ^10,80 veya cryo-EM rekonstrüksiyonlarında çözünürlükte ⁸¹ yerel varyasyon eksik neden olabilir.

Tek bir proteinin, küçük protein 3 boyutlu rekonstrüksiyon ulaşmada başarı gibi 53 kDa CETP ve 3D yapısı gibi 160 kDa lgG1 antikor, uygun bir hizalama koşul altında yakın Scherzer'in odak görüntüleme durumu kullanarak yararlanır. Görüntü kontrastı yakın-Scherzer odak görüntülerde düşük görünse de, kontrast, kolayca arka yüksek frekanslı sesleri azaltmak için bir düşük geçiş filtresi uygulayarak artırılabilir. Biz inanıyoruz, yakın-Scherzer'in görüntüler maksimum yapısal sinyallerini taşıyan odak, ve parçacık uyum doğruluğunu artırmak ve kate artırabilirtek parçacık 3D rekonstrüksiyon ve bireysel parçacık elektron tomografi rekonstrüksiyonu Verimliliği.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leke: Uranil Format	SPI Malzemeleri Bölümü, Yapı Probe, Inc.	02545-AA	http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
Şırınga: 1 ml NORM-JECT	VWR	89174-491	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
Şırınga filtresi: 0.2 μ m	VWR	28145-487	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
Şırınga filtresi: 0.02 μ m filtresi (Anotop 10)	Whatman	6809-1002	http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su	SIGMA-Aldrich	D8537	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en®ion=US
Parafilm: 4 inç x 125 ft.	VWR	470152-246	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
Karbon film kaplı TEM ızgarası: 300 ağ	Pacific Grid-Tech	Cu-300CN	http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
Karbon film kaplı TEM ızgarası: 200 ağ	EMS (Elektro Mikroskopi Bilimleri)	CF200-Cu	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
Cımbız: Dumont Cımbız L5	EMS (Elektro Mikroskopi Bilimleri)	72882-D	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 Ultra Saf Su Arıtma Sistemi	EMD Millipore	Milli-Q Advantage A10	http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
Filtre Kağıdı: 1. sınıf daireler	Whatman	1001-090	http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
Alüminyum Folyo			Her türlü
Filtre Ucu: 10 ve mikro için Düşük Tutmalı Aerosol Filtre Uçları; L Pipetleyiciler	VWR	89174-520	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
[header]
Kızdırma Boşaltma	Ünitesi Ted Pella	91000	http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
Filtre Uçları: 40&Micro için Düşük Tutmalı Aerosol Filtre Uçları; L Pipetleyiciler	VWR	89174-524	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
Filtre Uçları: VWR Signature 200 & mikro; L Pipet Uçları	VWR	37001-528	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
Pipet Pipetman		F161201 ve F167300	http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx