Yöntem makalesi

Çift Renkli Zaman-kapılı Uyarılmış Emisyon tükenmesi (STED) Nanoscopy tarafından İmmünoloji Synapse görselleştirme

DOI:

10.3791/51100

⸱

24 Mart 2014

 , 
1Center for Human Immunobiology, Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, cam üzerinde özetlenen NK hücrelerinin sitotoksik immün sinapsı olan iki renkli STED nanoskobu ile görüntüleme protokolünü gösteriyoruz. Bu yöntemi kullanarak, sinaps proteinlerinin ve hücre iskeletinin 100 nm altında çözünürlüğünü elde ediyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğal katil hücreler veya viral yönden enfekte tümörijenik hücrelerin lize etmek için sıkı bir şekilde düzenlenmiştir, ince ayarlı bir immünolojik sinaps (IS) oluşturur. Dinamik aktin tadilatı NK hücrelerin fonksiyonu ve IS oluşumu için çok önemlidir. Sinaps F-aktin Görüntüleme geleneksel ancak ışık kırılma sınır yaklaşık 200 nm, konfokal de dahil olmak üzere, flüoresan mikroskopi çözünürlüğünü sınırlandırır, konfokal mikroskopi kullanmıştır. Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler subdiffraction sınırlı süper çözünürlük görüntüleme gelişmesini sağlamıştır. IS F-aktin mimarisi görselleştirmek için cam üzerinde reseptörü aktive NK hücreleri kalarak NK hücre sitotoksik sinaps özetlemek. Biz daha sonra iki-renkli uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskobu (STED'in) kullanarak ilgi görüntü proteinleri. Bu, sinaps <80 nm çözünürlükte sonuçlanır. Bu yazıda numune hazırlama ve çift col kullanarak görüntüleri edinimi adımları açıklarveya NK F-aktin görselleştirmek STED'in nanoscopy IS. Biz de Leica SP8 yazılım ve zaman-kapılı STED'in kullanarak örnek edinme optimizasyonu göstermektedir. Son olarak, görüntülerin post-processing deconvolution için Huygens yazılımı kullanmak.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immünolojik sinaps proteinleri ve hücre iskeleti elemanları sinyalizasyon karmaşık bir ortam olduğunu. Sitolitik sinaps aslında merkezi bir salgı etki 1-4 çevreleyen aktin ve yapışma moleküllerinin bir halka ile yapı gibi bir "boğa gözü" sahip olarak nitelendirildi. Ancak, şimdi bu fonksiyonu 5-11 sürekli dinamik sitoskeletal örgütlenmesini gerektirir aktif sinyalizasyon mikroskobik etki oluştuğunu biliyoruz. Sinaps hakkında şu anda sahip bilgilerin çoğu mikroskop elde edilmiştir, ve immunolojistlerden üstün görüntüleme teknolojisi erken benimseyenler olmuştur.

Böyle bir yeni teknoloji süper-çözünürlük mikroskopisidir. Geleneksel uzamsal ışık mikroskobu, yaklaşık 200 nm 'de dahil olmak üzere tüm konfokal floresan mikroskobu için çözünürlük alt sınırı, setleri ışık kırılma bariyer ile sınırlıdır. Son yıllarda, çeşitli teknikler geliştirmek olmuşturçözünürlüğü kırınım bariyerin altında izin d. Bu uyarım emisyon tükenmesi mikroskobu (STED'in), yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), davranışsal çözüldü mikroskobu (FIRTINA) ve fotoaktıfleştırılebılır ışık mikroskobu (PALM) içerir. Bu teknikler yerlerinde detaylı olarak 12-15 gözden geçirilmiş, ancak aşağıda özetlenmiştir. Subdiffraction sınırlı çözünürlük her sistemde benzersiz şekilde oluşturulur. Süper çözünürlük tekniğinin seçimi, bu nedenle, ilgi konusu deney ve deneysel sistem tarafından dikte edilmelidir.

STED süper çözünürlük subdiffraction sınırlı floresan mikroskobu 16-18 sonuçlanan uyarma sonrasında her bir ilgi florofor çevresinde seçici "sessizliği" floresan yüksek yoğunluklu torroidal tükenmesi ışını kullanılarak elde edilir. STED'in bir avantajı görüntü elde etme, hızlı ve nispeten küçük bir post-processing gerektirir. Boya seçimi spec tarafından belirlenir daTicari olarak temin edilebilen sistemde 592 nm 'de yer almaktadır tükenmesi huzmesinin tral konumu, bir çok piyasada mevcut boyalar, iki florofor kombinasyonlar mümkün kılan mevcuttur. Buna ek olarak, GFP gibi yaygın olarak kullanılan floresan haberci 19,20 canlı hücre deneyleri mümkün hale görüntülenebilir.

Daha önce degranülasyon 21,22 için NK hücreleri tarafından kullanılmaktadır F-aktin hipodansitedir bölgelerini belirlemek ve ölçmek için STED'i kullandık. Biz STED'in nedeniyle floroforlar ve xy ekseninde çözünürlükte üstün iyileşme nispeten esnek durumuna bağışıklık sinaps görüntüleme için iyi bir seçim olduğunu düşünmekteyiz. Buna ek olarak, bu deney için kullanılan, ticari olarak temin STED'in sisteminde, yüksek hızlı (12,000 Hz) rezonans tarayıcının kullanılması örnekler en az hasar ile, görüntülerin elde edilmesi için hızlı sağlar. Boya seçimi sınırlı esneklik, STED'in 12 bir dezavantaj olarak kabul edilirAncak çift renkli STED'in piyasada bulunan çeşitli floroforlar nispeten basittir. STED iki kanal ile sınırlı iken, ek yapılar, yaklaşık 200 nm (E. Mace, yayınlanmamış gözlemler çözünürlükte konfokal görüntülü böylece bir lazer konfokal tarama mikroskobu ile STED'in entegrasyonu da STED'in ile kombinasyon halinde ilave confocal görüntüleme sağlar: .) Biz bağışıklık hücrelerini görüntülenmesi için STED'in kullanımını tarif ederken, bu teknoloji, sinir hücreleri dahil olmak üzere hücre tipleri, çeşitli hücre ve yapıların çeşitli 23-26 görselleştirme için uygulanır.

SIM subdiffraction sınırlı görüntüler oluşturmak için farklı bir yaklaşım kullanır. Bilinen periyodik uyarım desen ile görselleştirme, bilgi daha sonra, aşağıdaki matematiksel dönüşüm 27 çalışılmaktadır bilinmeyen yapısı elde edilebilir. Bu ~ 100 nm yanal 28,29 çözünürlüğe bir artış verir. SIM avantajı, bu is tüm standart konfokal boyalar ve probları ile uyumlu, ancak dezavantajı görüntüleri elde etmek için çok daha yavaş olduğunu ve bu uzun post-processing 12 ihtiyaç olmasıdır. Bu, aynı zamanda canlı hücre görüntüleme için kullanılmasını sınırlamaktadır.

Son olarak, süper çözünürlüklü görüntüler Flüoroforlann stokastik foto-anahtarlama tarafından oluşturulmuş olabilir. Bu yaklaşım, fotoğraf aktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (FIRTINA) istismar edilmektedir. Birden fazla kamera kare tarama ve zamanla ve "kapalı", "açık" rastgele aktif molekülleri lokalize ederek, 20-30 nm çözünürlükte görüntüler birikmiş çerçeveleri 30-32 üretilir. Bu çözünürlük için trade-off görüntüleri elde etmek için gerekli zamanı.

Burada ayrıntılı olarak göstermek, hazırlama ve STED'in çift renk örnekleri görüntüleme için protokol. Bu sistemde, atımlı bir uyarım, ayarlanabilir, beyaz ışık lazer ile. Doğası gereğidarbeli uyarma demetinin, algılama süresi yolluk mümkün kılan ve daha fazla artış çözünürlük edilir. Buna ek olarak, sistem, bu şekilde daha düşük bir lazer güç gereksinimleri için izin gadolinyum hibrid geleneksel foto-çoğaltıcı tüpler daha duyarlıdır (hyd) dedektörleri ile donatılmıştır. STED'in için tükenmesi ışın sürekli olarak tatbik edilir ve iki renk STED'in için mevcut boyaların seçimi dikte edecek 592 nm, ayarlanmıştır. Yaygın olarak kullanılan boya kombinasyonları genellikle (örneğin Alexa Fluor 488, Oregon Yeşil, yeşil DyLights veya Chromeo 488 gibi) 488 nm ile heyecanlı bir ve (örneğin Pasifik Turuncu veya Horizon V500 gibi) 458 nm ile heyecanlanan birini içerir. İki boyaların algılama benzer bir aralık içinde olacaktır (ve her ikisi de tükenme lazer tarafından erişilebilir) iken Böylece, farklı dalga boylarında uyarım ile ortaya çıkar. Bir ayarlanabilir beyaz ışık lazer ve ayarlanabilir dedektörleri ile, spektral örtüşme yok ederken sinyali maksimize oldukça kolay yapılır. Gibi, biz combinat ile iyi bir başarı olduBu tür Pacific Orange (burada kullanılan) Alexa Fluor 488 olarak ticari olarak temin edilebilen boya iyonları. Bizim protokol yönelik hazırlanmıştır ve bu bizim laboratuvar tarihsel odak temsil eder gibi insan NK hücrelerinin değerlendirilmesini açıklar. Biz düzenli olarak deneysel çalışmalar 21,33 olarak uygulamış biri olarak biz özellikle bu örnekte NK92 hücre hattını kullanıyor.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Antikorlu Lameller

  1. Ön ısıtma (37 °C'de) 30 ml RPMI, %10 FCS ortamı ve 1 ml BD Cytofix/Cytoperm.
  2. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 5 μg / ml saflaştırılmış antikor çözeltisi hazırlayın. NK92 hücre hattının aktivasyonu için anti-CD18 ve anti-NKp30 kullanılması önerilir.
    1. Bir PAP kalemi kullanarak # 1.5 lamel üzerinde her koşul için yaklaşık kuruş büyüklüğünde bir daire işaretleyin. Çift renkli bir deney için dört koşul olmalıdır: lekesiz, çift lekeli ve iki tek lekeli koşul. Her bölgeye 200 μl antikor çözeltisi dağıtın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    2. Lamelleri, oda sıcaklığında 50 ml'lik konik bir tüpte her birini 50 ml PBS'ye hafifçe daldırarak yıkayın. Yıkama, hücrelerin eklenmesinden hemen önce yapılmalı ve lamel üzerinde antikor kurumasını önlemek için özen gösterilmelidir.

2. Lameller üzerindeki NK hücrelerini etkinleştirin; Düzeltin ve Geçirgen Hale Getirin

  1. Koşul başına 5 x 105 NK92 hücreyi izole edin. Santrifüj ve dekant süpernatan. Adım 1.1'den itibaren 10 ml önceden ısıtılmış ortamla bir kez yıkayın. Santrifüj ve dekant süpernatan.
    1. Önceden ısıtılmış ortamdaki hücreleri, 2.5 x 106 / ml'lik bir konsantrasyonda adım 1.1'den itibaren yeniden süspanse edin.
    2. Bölüm 1.2.1'de oluşturulan bölgenin merkezine 200 μl'yi yavaşça boşaltın. 37 ° C'de% 5 CO2'de 20 dakika inkübe edin. (Not: İlgilenilen biyolojik fonksiyona bağlı olarak bu süre uzatılabilir veya azaltılabilir. NK hücre granül polarizasyonu için 20 dakika yeterlidir).
  2. Hücrelerin inkübe edilmesinin ardından, lamelleri 50 ml'lik konik bir tüpte her birini 50 ml oda sıcaklığında PBS'ye daldırarak nazikçe yıkayın.
  3. Adım 1.1'den itibaren 1 ml önceden ısıtılmış Fix/Perm solüsyonuna 1 μl Triton X-100 ekleyin ve iyice girdaplayın. Hücrelere 200 μl Fix / Perm tamponu (adım 2.3) ekleyerek sabitleyin ve geçirgenleştirin. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

3. Leke Hücreleri

  1. Boyama tamponu hazırlayın: Fosfat tamponlu salin (PBS),% 1 BSA,% 0.1 Saponin.
    1. Primer antikor çözeltisini 200 μl boyama tamponunda hazırlayın (bkz. adım 3.1). (Not: antikor kullanımdan önce titre edilmelidir). Lameli kaplamak için kullanılan aynı türde ortaya çıkan birincil antikorun kullanılmasından kaçının (adım 1.2). Ayrıca STED görüntüleme için Strepatividin-biotin bağlantılarından kaçının.
    2. Bölüm 2.3.1'i takiben, lamelleri 50 ml boyama tamponunda nazikçe yıkayın. Fazla tamponu çıkarmak için PAP kalem bölgesinin kenarlarını pamuklu çubukla kurulayın. Bölüm 3.1.1'de oluşturulan antikor solüsyonunu uygulayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. (Önerilen: nemi korumak için lamelleri nemli bir kağıt havluyla sürgülü kutuda inkübe edin).
  2. 200 μl boyama tamponunda ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. Önerilen floroforlar Alexa Fluor 488, Pacific Orange ve V500'dür. Genel olarak, STED görüntüleme için 1:200 seyreltme uygundur.
    1. Lamelleri 50 ml boyama tamponunda nazikçe yıkayın. Fazla tamponu çıkarmak için PAP kalem bölgesinin kenarlarını pamuklu çubukla kurulayın. İkincil antikor çözeltisi uygulayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  3. İlgilenilen ek proteinler için yıkama ve boyamayı tekrarlayın. Phalloidin ile F-aktin tespit edilirse, bu genellikle 1:200 seyreltmede ikincil antikor ile dahil edilebilir.

4. Lamelleri slaytlara monte edin

  1. Montaj ortamını hazırlayın. Not: Prolong veya Prolong Gold tercih edilir. STED ile uyumlu olmadığı için VECTASHIELD'den kaçınılmalıdır. Phalloidin kullanılıyorsa 2,2-tiyodioetanolden kaçınılmalıdır. Mowiol kabul edilebilir.
  2. Bir kızak üzerine yaklaşık 10-20 μl montaj ortamı yerleştirin. Lameli ters çevirin (hücre tarafı aşağı) ve lameli nazikçe monte edin, hava kabarcıklarının girmesini önlemek için dikkatli olun. Görüntülemeden önce slaytları 24 saat inkübe edin (lamel yukarı).
  3. Lamelin kenarlarını oje ile kapatın.

5. Deney Düzeneği

  1. Gerekli lazerleri ve yazılımı başlatın. STED tükenme lazerini %100 güçte başlatın. Ticari sistemler söz konusu olduğunda genellikle otomatik bir prosedür olan STED lazeri hizalayın.
  2. Numuneyi, tek lekeli kontrolden başlayarak, göz mercekleri kullanarak mikroskop üzerinde odaklayın.

6. Ayarların Optimizasyonu

  1. İlk kanalı tarayın ve lazer gücünü, uyarma ışını konumunu ve dedektör aralığını optimize edin. Mümkünse, 100 >'luk bir kazançtan kaçının. Ayarları optimize etmek için görüntüyü konfokal olarak yakalayın. Satır ve/veya kare ortalaması çözünürlüğü artıracaktır. Piksel doygunluğunu kontrol edin. Not: STED uygulaması emisyon yoğunluğunu azaltacağından konfokal olarak bir miktar doygunluk kabul edilebilir. STED için en uygun piksel boyutu 30 nm'nin altında olacaktır, ancak daha küçük piksel boyutlarıyla daha iyi çözünürlük elde edilecektir. Görüntülenmekte olan ilgilenilen bölgenin boyutu, piksel boyutunun alt sınırını belirleyecektir. Daha küçük piksel boyutları foto ağartmayı artırabilir.
    1. STED tükenme ışını uygulayın ve% 50 tükenme lazer gücünden başlayarak görüntü yakalayın. Çözünürlükte bir iyileşme görülürse, daha fazla tükenme lazer gücü uygulanabilir. Bu aşamada, uyarma lazer gücünü, hat ortalamasını ve/veya kazancını ayarlamak gerekebilir.
    2. Arka planı azaltmak için zaman geçişi uygulayın (en az 0,3 nsn). Konfokal üzerinde çözünürlükte bir iyileşme görülene kadar ayarları yapın. Çözünürlük, tam genişlik yarı maksimum (FWHM) tahmin edilerek yaklaşık olarak tahmin edilebilir. Bu, ilgilenilen yapı boyunca bir çizgi profili çizilerek oluşturulan bir Gauss zirvesinin yarı maksimum yoğunluğundaki mesafeyi temsil eder ve çözünürlüğü tahmin etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
    3. İlk kanal tatmin edici olduğunda, sıralı tarama için ikinci bir dizi başlatın. Genel olarak, önce daha uzun dalga boylu floroforu taramak en iyisidir. İkinci kanalda adım 6.1'i tekrarlayın.
  2. Her iki tarama dizisiyle tek lekeli kontrolleri görüntüleyerek spektral örtüşme eksikliğini onaylayın. Hafif spektral örtüşme, yazılımdaki spektral karıştırma önleme özellikleri kullanılarak düzeltilebilir, ancak mümkün olan her yerde kaçınılmalıdır.

7. Görüntü Edinme

  1. Görüntüleri elde edin. Kantitatif görüntüleme için en az 20 görüntü/koşul elde edilmesi önerilir. Bununla birlikte, kesin sayı, örneklem büyüklüğü hesaplaması gibi istatistiksel bir yaklaşımla uyumlu olarak deneysel soruya göre tanımlanmalıdır. Denemeyi kaydet'i tıklayın.

8. Evrişim

  1. Dekonvolüsyon yazılımı veya toplu işlemci ile dosyayı açın. Yazılımı kullanarak her kanal için parametreleri kontrol edin. Özellikle her kanalın uyarma ve emisyon spektrumlarını, STED tükenme emisyonunu ve görüntüleme yönünü (görüntü 3 boyutluysa yukarı veya aşağı) onaylayın.
  2. Evrişim çözme sihirbazını kullanarak deconvove. Varsayılan ayarlar genellikle yeterlidir, ancak sinyal-gürültü oranı (SNTR) florofordan florofora değişir ve her kanal ve her deney için ayrı ayrı belirlenmesi gerekir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıkçası, süper çözünürlüklü görüntülemenin birincil hedefi, geleneksel konfokal mikroskopiye göre bir gelişme olacaktır. Bununla birlikte, optimal olmayan çözünürlüğe yol açabilecek bazı yaygın tuzaklar vardır. Bunlar, her deneyin ayrı ayrı optimize edilmesini gerektirir. Temsili deneyimizde, cama bağlı antikor tarafından aktive edilen bir NK hücresinde F-aktin ağını görüntülüyoruz. Konfokal üzerinde STED'in gelişmiş çözünürlüğünün olmamasının yaygın nedenleri (ve düzeltmeleri) aşağıdaki gibidir:

  1. Yetersiz örnekleme (Şekil 1a). Bu, F-aktin filamentlerinin zayıf çözünürlüğü ile gösterildiği gibi, grenliliğe ve piksel bilgisi kaybına neden olabilir. Artan satır veya kare ortalaması genellikle bunu düzeltebilir.
  2. Ağartma ve/veya aşırı örnekleme (Şekil 1b). Bu, aşırı satır ortalamasının bir sonucu olarak uzun piksel bekleme süresinden kaynaklanabilir. Alternatif olarak, tükenme lazerinin aşırı kullanımı da dahil olmak üzere, elde edilmeden önce görüntünün aşırı taranmasının bir sonucu olabilir. Bu genellikle puslu veya bulanık görüntülere neden olur. Bu, elde etmeden önce ilgilenilen alanı yalnızca minimum düzeyde tarayarak veya mümkünse lazer tarama hızını artırarak düzeltilebilir. Sorun devam ederse, tükenme lazer gücü azaltılabilir.

Piksel bekleme süresi, uyarma lazer gücü ve tükenme lazer gücü arasında doğru dengeyi elde ederek, gelişmiş çözünürlüğe ve yeterli bilgiye sahip bir görüntü oluşturulabilir (Şekil 1c). Çözünürlük, dekonvolüsyon kullanılarak daha da geliştirilebilir (Şekil 1d). Satın alma optimize edildiğinde, evrişim hem niteliksel hem de niceliksel olarak çözünürlüğü artıracaktır ve 100 nm altı çözünürlük rutin olarak elde edilebilir olmalıdır.

figure-results-1
Şekil 1. Edinimin optimizasyonu ve STED görüntülemenin yaygın tuzakları. NK92 hücreleri, anti-CD18 ve -NKp30 kaplı cam üzerinde 20 dakika süreyle aktive edildi, daha sonra Phalloidin Alexa Fluor 488 ile F-aktin için sabitlendi, geçirgen hale getirildi ve boyandı. a) Yetersiz örnekleme nedeniyle görüntü bilgisi kaybına bir örnek. b) Ağartma/aşırı örnekleme nedeniyle çözünürlük kaybına bir örnek c) optimize edilmiş koşullar d) optimize edilmiş koşullar, dekonvolüsyon ile çözünürlükte daha fazla iyileşmeye yol açar. Ölçek çubuğu = 5 μm.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konfokal üzerinde çözünürlükteki iyileşme, bir şekilde kontrol edilemeyen faktörlere bağlı olacaktır. Bu faktörler arasında lamel kalınlığındaki küçük sapmalar ve montaj ortamındaki tutarsızlıklar yer alır. Görüntüleme odasındaki sıcaklık ve nemin mümkün olduğunca tutarlı tutulması önemlidir ve STED ışını yaklaşık her 60 dakikada bir yeniden hizalanmalıdır. Prosedürlerde belirtildiği gibi, STED ile uyumlu olmadığı için VECTASHIELD montaj ortamının kullanımından kaçınılmalıdır. Buna ek olarak, her zaman #1.5 lameller kullanılmalı ve varsa belirli bir kalınlığa göre doğrulanmış olanlar kullanılmalıdır.

Burada açıklanan yaklaşımın bir modifikasyonu, STED ışınından daha uzun bir dalga boyunda yayılan floroforlar kullanarak ek kanalları konfokalde görüntülemektir. Bu şekilde, dört kanala kadar (ikisi konfokalde, ikisi STED'de) görüntülenebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımı benimserseniz, STED ışınının uygulanması bu kanallardaki fotonları tüketeceğinden, önce STED tükenme lazerinin üzerinde yayılan floroforlara sahip kanalların görüntülenmesi gerekecektir. Bu tekniğin bir avantaji, kisa ömürleri34 olan fotonlardan emisyonu ortadan kaldirarak konfokalde çözünürlüğü artiracak olan zaman geçitlemesinin uygulanmasidir. Özellikle, emisyon dedektörlerinin darbeli uyarma STED'ine karşılık gelecek zamanlaması olan zaman geçidinin kullanılması, yakın görüntüleme sırasında lamel camından yansımadan kaynaklanan arka plan floresansını azaltacaktır. STED için uygun olmayan bir deneyde bile, darbeli bir uyarma kaynağı kullanılıyorsa, zaman geçitleme, konfokalde çözünürlüğü iyileştirmek için yararlı bir araç olabilir.

STED'de çözünürlüğü artırmak için kullanılabilecek çeşitli değişiklikler vardır. Birincisi, iğne deliğinin boyutunu standart 1 Airy ünitesinden azaltmaktır, ancak bu aynı zamanda numuneye ulaşan ışık miktarını da azaltacaktır. Bu, lazer gücünü veya kazancını artırarak telafi edilebilir. Bir diğeri, her foton için toplanan bilgi miktarını artıracak ve çözünürlüğü iyileştirecek olan çizgi ortalamasını artırmaktır. Ancak yine de bu, numunenin ışıkla ağartılması pahasına olabilir, bu nedenle çözünürlük ve ağartma arasında bir denge kurulması gerekecektir. Benzer şekilde, GFP gibi floresan proteinlerin kullanımı, ağartmayı önlemek için dikkatli bir optimizasyon gerektirecektir. Bu, gerekirse STED lazer gücünü azaltarak gerçekleştirilebilir. Daha uzun zaman noktaları ayrıca daha fazla foton geri kazanımına izin verecek ve ağartmayı azaltacaktır. Canlı STED analiz edilirken ışıkla ağartma düzeltmesi hesaba katılmalıdır.

Elbette STED'de 3 boyutlu görüntüleme de mümkündür ve geleneksel konfokal görüntülemeye göre bir gelişme sağlayacaktır. Bu, özellikle ters evrişim ile birlikte yapılırsa doğrudur, ancak z ekseninde birden fazla düzlemin görüntülenmesi sırasında meydana gelen kaymayı düzeltmek için özen gösterilmelidir. Ayrıştırmak için Huygens yazılımı kullanılıyorsa, bu düzeltme "görüntüyü sabitle" özelliği kullanılarak elde edilir. Bu yaklaşımı kullanarak, z eksenindeki çözünürlük iyileştirilecektir. Bu, zayıf eksenel çözünürlüğe sahip geleneksel konfokal görüntülemeye ve hatta nispeten zayıf z ekseni çözünürlüğüne sahip olan STED'in kendisine göre büyük bir gelişmedir. STED'de birden fazla yığın elde edilirken, numunenin ağartılmasını önlemek için özen gösterilmelidir ve gerekirse bunu yapmak için çizgi ortalaması veya lazer gücü yoğunluğu azaltılabilir. Yine, STED için uygun olmayan diğer floroforların görüntülenmesi durumunda, ilk ardışık taramada tükenme ışınının uygulanmasının bu kanallardan emisyonu önleyeceği unutulmamalıdır. Bu nedenle, karışık bir STED/konfokal yaklaşım (592 nm'den daha büyük bir dalga boyunda yayılan kanallarda konfokal tarama kullanıldığında) ne yazık ki 3D için uygun olmayacaktır.

Özetlemek gerekirse, standart konfokal görüntülemeye göre göreceli uygulama kolaylığı ve çözünürlükteki iyileşme nedeniyle STED'i bir yaklaşım olarak seçtik. İmmün sinapsı görüntülemek için, 200 nm'nin üzerindeki çözünürlükte mümkün olmayan F-aktin mimarisindeki ayrıntıları görmemizi sağlayan etkili ve değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Bu ayrıntıların çoğu ince görünse de, NK hücre fonksiyonu üzerinde derin bir etkiye sahip olabilirler. Bu nedenle, insan sağlığını korumak için kritik olan bilgileri elde etmek için en son nanoskopik görüntüleme teknolojisini uyguluyoruz.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Bu makalenin kısmi yayın maliyeti Leica Microsystems, Inc. tarafından karşılanmıştır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik yardım için Geoff Daniels'a teşekkür ederiz. Bu çalışma R01 tarafından AI067946 J.S.O. tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
# 1.5 kapak fişleriVWR48393-172
BD Cytofix / CytopermBD Biosciences554722
Sığır serum albüminiSigmaA2153
Pamuk uçlu aplikatörFisher ScientificS450941
Falcon santrifüj tüpleri (50 ml)VWR352070
Fetal buzağı serumu (FCS) (500 ml)Atlantik BiyolojiS11050
Keçi anti-tavşan Pasifik TuruncuYaşam TeknolojileriP31584
Laboratuvar doku silecekleriVWR82003-820
OjeVWR100491-940
NK-92 hücreleriATCCCRL-2407
Phalloidin Alexa Fluor 488Yaşam TeknolojileriA12379
Fosfat tamponlu tuzlusu Life Technologies14190250
Prolong anti-solma reaktifiLife TechnologiesP7481
Saflaştırılmış anti-CD18Biolegend301202
Saflaştırılmış anti-NKp30Biolegend325202
Saflaştırılmış anti-perforinBiolegend308102
RPMI 1640 ortamı ( 500 ml)Yaşam Teknolojileri11875-093
Quillaja kabuğundan saponinSigmaS4521
Süper PAP kalemiYaşam Teknolojileri008899
Triton X-100Elektron Mikroskobu Bilimleri22142
Huygens evrişim çözme yazılımıSVIİletişim şirketi
Leica SP8 TCS STED mikroskopLeica Microsystemsiletişim şirketi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).
  2. Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  3. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  4. Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).
  5. Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses. J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).
  6. Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).
  7. Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses. Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).
  8. Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
  9. Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses. Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).
  10. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
  11. Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  12. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).
  13. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  14. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  15. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front. Immunol. 3, 421 (2012).
  16. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  17. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  18. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  19. Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP. Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).
  20. Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy. Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).
  21. Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
  22. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  23. Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy. Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).
  24. Tonnesen, J., Nagerl UV, Superresolution imaging for neuroscience. Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).
  25. Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held. PLoS One. 8 (4), (2013).
  26. Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).
  27. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
  28. Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination). Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  29. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  30. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).
  31. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  32. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  33. Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. J. Exp. Med. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski,, Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. 204 (10), 2305-2320 (2007).
  34. Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Do al Katil H crelerF aktin G rselle tirmeift Renkli STEDZaman Kap l STEDKonfokal MikroskopiG r nt Dekonvol syonuLeica SP8 Yaz l mHuygens Yaz l mDifraksiyon Alt G r nt leme

İlgili makaleler