Yöntem makalesi

Görselleştirme ve Miktarının Belirlenmesi için floresan proteinleri kullanarak Chlamydia Vakuol Büyüme Dinamikleri Yaşayan Hücrelerde

DOI:

10.3791/51131

⸱

13 Ekim 2015

 ,  , 
1Division of Allergy and Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Washington, 2Program in Infectious Diseases, School of Public Health, University of California at Berkeley

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chlamydia içeren hücresel vakuolleri (inklüzyonlar) aydınlatmak için canlı hücre floresan proteini bazlı bir yöntem tanımlanmıştır. Bu strateji, numunelerde Chlamydia enfektivitesinin hızlı ve otomatik olarak belirlenmesini sağlar ve inklüzyon büyüme dinamiklerini kantitatif olarak araştırmak için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zorunlu hücre içi bakteri Chlamydia, küresel halk sağlığı üzerinde büyük bir yük oluşturmaktadır. C. trachomatis, cinsel yolla bulaşan enfeksiyonun önde gelen bakteriyel nedenidir ve aynı zamanda dünyadaki önlenebilir körlüğün birincil nedenidir. Konakçı hücrelerin Chlamydia tarafından başarılı bir şekilde enfekte edilmesi için önemli bir belirleyici, bakterinin konak hücre sinyalini inklüzyon adı verilen yeni, vakuolar bir bölmeden manipüle etme yeteneğidir. Dahil etme içinden, Chlamydia 2-3 günlük gelişimsel büyümeleri için gerekli besinleri alır ve ayrıca vakuol zarının sitozolik yüzüne ve konakçı sitozole bir efektör protein paneli salgılar. Bununla birlikte, Chlamydia biyolojisi anlayışımızdaki boşluklar, bu hücre içi bölmeyi görselleştirmek ve analiz etmek için önemli zorluklar ortaya koymaktadır. Son zamanlarda, GFP eksprese eden konakçı hücreleri kullanarak inklüzyonu görselleştirmek için bir ters görüntüleme stratejisi tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, inklüzyon membranının GFP gibi büyük moleküllere karşı içsel geçirimsizliğini rasyonel olarak kullanır. Bu çalışmada, klamidyal inklüzyonların daha sonra görselleştirilmesi için GFP veya mCherry eksprese eden konakçı hücrelerin nasıl üretildiğini açıklıyoruz. Ayrıca, bu yöntemin maliyetli antikor bazlı sayım yöntemlerinin etkili bir şekilde yerini aldığı, GFP eksprese eden Chlamydia gibi diğer floresan etiketlerle birlikte kullanılabileceği ve bir dizi Chlamydia türü ve suşundan inklüzyon membranı büyümesi hakkında temel nicel veriler elde etmek için kullanılabileceği gösterilmiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içi bakteri Chlamydia türlerinin neden Bulaşıcı hastalıklar cinsel yolla bulaşan hastalık, pelvik inflamatuar hastalık, körlük, zatürre ve muhtemelen ateroskleroz 1-4 dahil olmak üzere küresel sağlığı üzerinde önemli bir yük, ortaya. Bir vakuol içinden, konakçı hücre ile etkileşime Chlamydia kabiliyeti (dahil olarak adlandırılır), hücre ve ev sahibi başarılı enfeksiyonu için kritik bir belirleyicidir. Içerme chlamydia büyümesini sağlayan ve dinamik Chlamydia 5 tüm 2-3 gün gelişimsel döngüsü boyunca değiştirilmiş yeni bir patojen bölme olduğunu. Klamidyalar ve zorunlu hücre içi doğası doğrudan dahil eşsiz biyoloji eğitimi için özellikle araştırma topluluğuna sayısız zorluklarla, sunar. Büyük bir handikap verimli hücre içi Klamidya veya floresan yaklaşımla kendi eklenmesi ya görselleştirmek için yetersizlik olmuşturcanlı hücrelerde es. Bir son keşif sonunda GFP C ifade oluşturmak için bir araç ortaya çıkarmıştır trachomatis 6; Ancak bu bulgu henüz dahil belirli etiketlenmesine yol açmamıştır. Bazı teknikler bakteri ve inklüzyonlar 7,8 etiketlenmesi için tarif edilmiştir, fakat bu ışıkla ağartma olmayan spesifite, geçicilik ve duyarlılık gibi bazı eksikleri vardır. Grubumuz tarafından anahtar keşif konakçı hücreleri 9 ifade GFP kullanarak içermenin aydınlatılması için yeni bir strateji kurdu. Bu strateji, rasyonel daha büyük 520 Da 10 molekülüne dahil membran iç sızdırmazlık patlatır. Hücreler stabil belirli bir sitozolik floresan proteini (örneğin, GFP veya mCherry) ifade etmek için tasarlanmıştır zaman Chlamydia inklüzyonlar floresan onların tam dışlama yoluyla kayda değer bir açıklıkla görebilir. Bu ters görüntüleme stratejisi, tüm Chl için kapanım derhal görselleştirme sağlaramydia türleri ve havaalanı en konakçı hücreler için adapte edilebilir. Kendi programını bir göstergesi olarak, bu yöntem Chlamydia spp 9 hücresel çıkış yollarını ortaya çıkarmak ve tanımlamak için önceden kullanıldı.

Burada, biz daha fazla bu yöntem gerçekleştirilir ve içerme büyüme dinamikleri hakkında önemli nicel veriler elde etmek için istismar edilebilir gösterilmektedir. Bundan başka, etkili bir şekilde pahalı antikor bazlı sayım yöntemleri yerine kullanılabilir ve bu tür Chlamydia 11 mKate2 ifade eden diğer floresan etiketler, ile birlikte de kullanılabilir. Araçlar Bu güçlü kombinasyon yaşayan konak hücrelerin içinde klamidya içerme zarının fiziksel özelliklerinin araştırılmasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan ana hücre dizilerinin 1. Üretim

  1. / Oyuk 2 x 10 6 hücre, 6-yuvalı plakalar üzerinde gün 1. Plaka 293T hücreleri (ya da daha başka retroviral paketleme çizgisi) ~% 75 konfluent ertesi gün için. Eğer arzu edilirse, her bir retrovirüs için tabak çift kuyu kullanılır.
  2. 2. Gün aspire hücreleri ve 2 ml ilave taze büyüme ortamı (DMEM +% 10 FBS + 2 mM L-glutamin). Lipofectamine 2000 veya benzeri bir reaktif kullanılarak ve imalatçının talimatları takip 5-8 ug retroviral vektör (GFP ihtiva eden) ve paketleme vektörünün her biri için (örn., PVSVg) ile hücrelerin transfekte.
  3. 1 ml büyüme ortamı ile orta yerine, daha sonra 37 ° C CO2 inkübatöründe 4-6 st için DNA ile inkübe hücreleri, vb.
  4. 37 ° C CO2 inkübatöründe 48 saat süreyle inkübe hücreleri.
  5. 3. Gün Plaka hedef hücreler (örn., HeLa) 10 5 hücre yaklaşık yoğunluğunda 6 oyuklu plakalar üzerine / kuyu olmak ~% 50 konfluentertesi gün. Ters bir mikroskop GFP floresan izleyerek 293T hücrelerinde pozitif transfeksiyon doğrulayın.
  6. 4. Gün Collect retrovirüs-ihtiva eden bir 0.45 mikron selüloz asetat şırınga filtre ile süpernatan bir pipet kullanılarak ve filtre 293T hücrelerinde rahatsız süpernatantlar.
  7. HeLa hücreleri Ortamı çıkarın ve 16 ug / ml ihtiva eden 0.5 ml polybrene büyüme ortamı ilave edin. Hücrelere süzüldü retrovirüs ~ 0.5 ml ilave akıllı-damla ve 24 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe inkübe hücreleri. 4 ° C 'de (de yinelenen, örn) kalan herhangi bir retrovirüs saklayın.
  8. Yinelenen kuyuları seri kalan retroviral parçacıklar ile enfekte için ekstra retrovirüs adımı yineleyin 1.7 üretmek için yapılmış ise Günü 5..
  9. (Örneğin, 500 ug / ml neomisin) 10 cm'lik bir çanak içeren seçim antibiyotik olarak 1: Gündüz 6. Geçiş HeLa hücreleri 1 transfekte edildi.
  10. Seçim Antibiyotik varlığında tekrar büyümeye kalıt aktarımlı hücrelerin için yeterli bir süre bekleyinHücreler ayıklama antibiyotiğin daha düşük bir konsantrasyonu ile standart teknikler tarafından yayılan olabilir sonra tlc, (örn., 200 ug / ml neomisin).
    Not: Gerekirse Hücreler de klonal, şu anda ideal bir parlaklık için seçilmiş olabilir.

GFP-ifade Chlamydia trachomatis 'in 2. Üretim

  1. 2x CaCl2 tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM CaCl2) ile 4SP tamponu (0.4 M sukroz, 16 mM Na 2 HPO 4) hazırlayın.
  2. Gün 1. çözülme dondurulmuş C. trachomatis stok buz üzerinde ve hemen 50 ul 2x CaCl2 tampon içine 10 ul bakteri sulandırmak. 3 ug plazmid DNA ekleyin (örn.,, PASK-GFP-mKate2-L2), iyice karıştırın ve 25 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
  3. Bu adım sırasında, bir santrifüj tüpüne McCoy hücreleri, T-75 balon trypsinizing konakçı hücrelerin hazırlanması. 5 dakika boyunca 50 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj ve supernatant atın. Resuspen1x CaCI2 tampon uygun hacimde d hücre topağı 4 x 10 7 hücre / ml bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir.
  4. (Adım 2.2) 30 dakika süreyle inkübe edildikten sonra, transformasyon karışımı borusu (toplam hacim 200 ul) ile McCoy hücreleri hazırlandı 100 ul ve 25 ° C'de ek bir 20 dakika inkübe edilir. 2 ml büyüme ortamı ile bir 6-yuvalı plaka ve kaplama tek bir kuyusuna bu dönüştürülmüş hücre karışımı 100 ul ekle. 2 gün bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
  5. 3. Gün Lyse McCoy hücreleri C ile enfekte bükülmüş 1000 ul pipet ucu ile hücreleri, 1 ml dH 2 O ile orta yerine ve kazıyarak trachomatis. C. verimli hücre erimesi ve serbest bırakılması için 5 kez 1 ml 4SP tamponu ekleyin ve ~ 27.5 G iğne ile süspansiyon geçmektedir trachomatis.
  6. C ihtiva eden hücre lizatı devri 2 mi Taze kaplama MM konfluent tek tabaka ihtiva eden bir T-75 balonuna trachomatisoy hücreleri; (FBS'siz) 8 ml DMEM ekleyebilir ve C izin vermek için 25 ° C'de 2 saat boyunca inkübe trachomatis hücrelerine yapışma.
  7. Aspire hücreler 10 U / ml penisilin G ve 1 ug / ml siklohegzimid ile desteklenmiş taze büyüme ortamı eklemek. 37 ° C CO2 inkübatöründe 48 saat boyunca balon inkübe edin.
  8. 4. Gün hücreleri enfekte ve inklüzyonlar anormal Klamidya ihtiva ışık mikroskobu ile doğrulayın. 2'den büyük mikron çapında olan kapanım içinde halka benzeri nesneler gibi standart ışık mikroskobu üzerinde parlak vakuol ve anormal Chlamydia organları olarak kapanımlar tanımlayın.
  9. Bir süspansiyon içine hücreleri 2 ml dH 2 O ile orta yerine ve kazıma tarafından Gün 5. lizleyin kültürü. 2 ml 4SP tamponu ekleyin ve ~ 27.5 G iğne ile 5 kez süspansiyon geçmektedir.
  10. Bir 6-çukurlu plaka içindeki tek bir kuyuda McCoy hücreleri taze tek tabaka enfekte hücre lizatı 2 ml kullanın. 25 ° C, aspirat 2 saat süreyle lisatı ile inkübe hücreleri ve taze büyüme eklemePenisilin G ve sikloheksimid içeren ortam.
  11. Hücrelerin genel sağlığına bağlı olarak 3-5 gün boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe inkübe hücreleri.
  12. Tekrarlama (anormal cisimlerin yoksun) Normal görünümlü inklüzyonlar ortaya çıkmıştır kadar 6 plaka taze kuyulara 2,9-2,10 bir veya birkaç kez, gerektiğinde, Pasajlanması kültürleri yineleyin. Şu anda kontrol etmek ters bir floresan mikroskop kullanmak C. trachomatis mKate2 (kırmızı) ifade eder.
  13. T-150 şişelerinde yetişen enfekte McCoy veya HeLa hücrelerinden Chlamydia transformantların hasat örneğin yüksek titre klamidyal stoklarının oluşturulması için enfekte kültürler, büyütmek.

3. Chlamydia ile Hücreler bulaşmasını

  1. IFU tespit edilmesi ve çok-yuvalı tarama için, örneğin cam alt yemekler ya da oda slaytlar yüksek çözünürlüklü görüntüleme için, ya da 24 oyuklu plakalar için istenen kültür kabı Plaka GFP-HeLa hücreleri,.
  2. Fro ÇözülmeC içeren zen tüp trachomatis, C. muridarum veya C örnek İçişleri Bakanlığı 1 = buz üzerinde pneumoniae ve enfeksiyon istenen çokluğu (İçişleri Bakanlığı) için HBSS sulandırmak.
  3. Kullanılacak belirli Chlamydia zorlanma dayalı statik veya santrifüj destekli ya enfeksiyonları gerçekleştirin.
    1. C ile enfeksiyonlarında trachomatis LGV serovar L2 veya C muridarum, HBSS GFP-HeLa hücreleri yıkayın ve 25 ° C'de 2 saat süre ile seyreltilmiş bakteri ile inkübe edin. Aspire edin ve HBSS ile yıkama hücreleri ve 37 ° C CO2 inkübatör büyüme ortamında hücrelerin inkübe edin.
    2. C. trachomatis serovar D veya C ile enfeksiyonlarında pneumoniae, HBSS GFP-HeLa hücreleri yıkamak ve hücrelerin seyreltilmiş bakteri ekleyin. Bir tezgah üstü santrifüj içinde sallanan bir kova rotor eki bir multiwell plaka tutucu multiwell plaka ya da (bir multiwell plaka kapağında bant ile güvence altına) cam alt çanak yerleştirin.
    3. 1 saat boyunca 25 ° C'de 900 x g'de santrifüj hücreleri.
    4. 1 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatör santrifüj ve yerine kültür damarları çıkarın.
    5. Aspire hücreleri biyogüvenlik kabini, HBSS ile iki kez hücreleri yıkayın ve taze besi ekleyin. 37 ° C CO2 inkübatör yerleştirin hücreleri.

Chlamydia İçermelerin 4. Canlı Hücre Görüntüleme

  1. CO 2 inkübatör Chlamydia bulaşmış GFP-HeLa hücreleri çıkarın ve fenol + 5 kırmızı% FBS'siz RPMI ile orta yerine.
  2. 20X ya da daha yüksek yağ objektif kullanarak bir ters flüoresan mikroskop (Nikon Eclipse Ti-E veya benzeri) üzerine monte hücreleri.
  3. Büyük kara delikler (Klamidya kapanımlar) içeren yeşil hücreler: görüntüleme yazılımı (Volocity 6 veya benzeri) kullanarak, odaklanmak ve tespit Chlamydia GFP-HeLa hücreleri enfekte.
  4. Mark görüntüleme yazılımı kullanarak ilgi Chlamydia ile enfekte olan hücreleri içeren bölgelerin xyz yerleri (Volocity 6 veya benzeri). El XY Sahne görünüm modunda süre 'Puanları ekleyerek' Bu gerçekleştirin. Bu şekilde, xyz koordinatlar her işaretli yeri için kaydedilir.
  5. Toplama Kurulumu iletişim kutusunda, yeşil (GFP, HeLa sitosol) ve kırmızı (mKate2, C. trachomatis) kanalları ve kanal başına yeni çerçeveler her 5 dk hızında elde etmek yazılımı yapılandırın.
  6. Protokol "Yakalama / Kaydet" butonuna tıklayarak, yukarıda girilen edinimi kullanarak görüntü dizisi edinin.

Canlı hücreler Eklenmesi Büyüme Parametrelerinin 5. kantitasyonu

  1. İstenilen zamanlarda enfeksiyon sonrası (örn., 24, 48 hpi) Chlamydia inkübatör GFP-HeLa hücreleri enfekte kaldırmak ve ters floresan mikroskop monte. Not: Bir yüksek NA ile 20X veya 40X hava hedefi 24-kuyucuğu için en uygun olduğunu ve 40X petrol hedefi haznesi slaytlar için tavsiye edilir. Bu eşek için her iki alt tabaka üzerinde hücreleri büyümekay.
  2. Inklüzyonlar maksimum çapı altındadır hücrelerin Midplanes odaklanın ve net kenarları verim.
  3. Her bir oyuğa (oyuk başına en az 10) birçok alanları için görüntüler elde; kuyular genellikle çoğaltır veya deneysel değişkenleri temsil etmektedir.
  4. Gözle (kapanım GFP-HeLa hücrelerinde siyah bölmeleri olan), elle kapanım sayısını numaralandırmak veya otomatik olarak kapanımlar tanımlamak ve saymak için görüntüleme yazılımı algoritmaları kullanır.
    1. Floresan yoğunluğu ile GFP-HeLa hücreleri bul (komutunu 'Nesneler Bul') ve hücrelerin göreceli yoğunlukları dayalı floresan eşik yoğunluğunu ayarlayın.
    2. Bu sadece 5'inden um 2 tutmanın büyüklüğü yönergeleri kullanarak Filtre, seçilen nesneler. Bu 'nüfus 1 "dir.
    3. Girdi olarak 'nüfusu 1' kullanarak komuta 'Nesneler Holes doldurun' uygulayın. Bu adım 'nüfusu 2' oluşturur.
    4. 'S çıkarınız' nüfus 1 'opulation 2 'nüfusu 3' olumlu olarak belirlenmiş Chlamydia kapanım, işaretli ürün olarak vermek üzere '.
    5. Örnek tutmak nesneler için, 'nüfus 3' ('Filtre Nüfus' komutu) boyut filtre uygulamak 24 saat veya daha uzun süre enfekte hücrelerde kapanım için daha büyük 25 mikron 2. Bu kapanımlar çok daha küçük gibi önce 18 saat gibi erken enfeksiyon süreleri için, set boyut filtresi, 4 mikron 2'den büyük nesneleri tutmak için. 'Kapanım' olarak adlandırılan nesnelere nüfusu Boyut filtreleme sonuçları.
    6. Görüntüleme yazılımı kullanarak, kantitatif örneğin görüntü veri, içerme numarası, inklüzyon boyutunu ve içerme çevresi hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sitosolik floresan proteinleri (örneğin GFP) ifade eden memeli hücrelerinin, canlı, enfeksiyonlu hücre kültürlerinde Chlamydia inklüzyonlar aydınlatma sağlamak için tasarlanabilir. Chlamydia enfeksiyonu üzerine, inklüzyonlar konakçı hücrelerde (Şekil 1) siyah noktalar olarak kolaylıkla görebilir. Floresan eksik kapanım netliği görünümü ve / veya tedaviler (Şekil 1) çok sayıda alanları arasında kapanım otomatik tanımlanması için istismar edilebilir. Floresan ko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada gerçek zamanlı görselleştirme ve Chlamydia kapanım analizi için floresan konakçı hücreleri üretmek için deneysel bir strateji açıklar. Bu vakuol görselleştirme yaklaşımı zamanla tek hücre hücre popülasyonlarında karşısında ya da klamidya kapanım dinamik özellikleri, aydınlatmak izlemek ve kantitatif ölçmek için güçlü yeteneği kazandırır. Klamidya kapanımlar floresan proteini etiketli hücrelerde çarpıcı iyi kolayca tespit edilir, öyle ki tanımlanır Ek immunofluorescent işleme gerek kalmadan. Ayrı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, sırasıyla pGFP-SW2 ve pASK-GFP-mKate2-L2 plazmitleri için Ian Clarke ve P. Scott Hefty'ye teşekkür eder. Teknik yardım için Paul Miller'a ve diğer kaynaklar için Richard Stephens'a teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH hibe AI095603 (KH) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lipofektamin 2000Invitrogen11668
Opti-MemInvitrogen31985
PolibreneSigmaH9268
0.45 & mikro; m filtrelerFisher09-719D
G418Canlandırıcı10131
HBSSCanlandırıcı14025
DMEMCanlandırıcı11995
RPMI 1640Canlandırıcı11875
RPMI 1640 fenolsüz kırmızıCellgro17-105-CV
Penisilin GSigma13752
SikloheksimidSigmaC7698
Cam alt tabaklarMatTekP35G-1.5-14-C
Oda kaydırakları, Lab-Tek IINunc154526, 154534

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
  2. Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).
  3. Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
  4. Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).
  5. Hackstadt, T. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).
  6. Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258(2011).
  7. Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  8. Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
  9. Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
  10. Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
  11. Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
  12. Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949(2012).
  13. Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Chlamydia InclusionFluorescent Host CellsLive Fluorescence MicroscopyInclusion Growth DynamicsReverse Imaging StrategyGFP Hela CellsInclusion QuantitationChlamydia SpeciesInclusion MembraneMicroscope Analysis Software

İlgili makaleler