Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Summary

Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir.

Abstract

Kültüre edilmiş nöronlarda bir farazi transmembran reseptörünün hücre yüzeyi yerini göstermek amacıyla, protein, bir hücre dışı bölümüne karşı ortaya çıkartılan bir antikor ile belirli bir primer, canlı nöronların yüzeyi üzerinde protein etiketli. Hücreler daha sonra tespit sonrası hücre yüzeyi ve iç protein her ikisi de aynı etiketli ikincil antikor ile tespit edilecek ise geçirgen reseptör olarak, yüzeye ve kaçırılan olduğu göz önüne alındığında. Burada, ya da hücre yüzeyi üzerinde kalmış veya bu süre esnasında yüzeye ticareti yapılan edilmiş antikor, inkübasyon kademesi sırasında ve protein endositoz tarafından internalize edilmiş etiket protein diferansiyel protein kaçakçılığı ("antikor besleme") çalışma için kullanılan bir yöntem adapte . Bu iki protein havuzları ayırt etmek yeteneği bir ilk Kuluçka sonra yüksek derecede konsantre edilmiş, etiketlenmemiş ikincil antikor ile bir gece boyunca bloke aşamasının dahil edilmesi sayesinde mümkün olmuştur, flüoresan-işaretli sekonder antikor ile unpermeabilized nöronların n. Farklı bir florofor ile işaretlenmiş bir fluorescent sekonder antikor ile içsel havuz tespit izin nöron bloke edici aşama, sonra, nüfuziyet. Biz ne olduğunu ortaya koyan, bu farazi reseptörün hücre içi konumu hakkında önemli bilgiler elde başardık bu tekniği kullanarak, gerçekten, nöronlarda hücre yüzeyine ticaretine. Bu teknik, bir hücre-dışı epitopuna uygun bir antikorun sağlanması ve kullanılması, hücre tipleri ve hücre yüzey proteinleri bir dizi geniş çapta uygulanabilir kullanılabilir.

Introduction

Yeni tanımlanan proteinin işlevini kurulması, söz konusu proteinin hücre içi lokalizasyonu ve ticareti araştırılması protein ^1,2 olası rolü / s ile ilgili önemli ipuçları sağlayabilir. Gelişmekte neokorteks ³ transcriptome biyoinformatik analizi fare beyin Kortikogenezin sırasında değişmiş ifadesini sergileyen genlerin bir listesini bize sağladı. Daha sonra, bu genlerin, sez6 tarafından kodlanan protein, nöron gelişmesinde önemli bir role sahip olduğunu tespit etmek için bir gen nakavt bir yaklaşım kabul etmiştir. Biz Nöbet-ilişkili gen 6 veya Sez6, protein gelişmekte dendritler bulunan ve aynı zamanda dendritik dikenler, almak ve uyarı....

Protocol

1.. Disosiye Hipokampal Nöron Kültürü

1. Lamelleri (borosilikat cam) hazırlayın:
   1. % 100 etanol içinde yıkayın.
   2. UV ışınlaması altında hava kuru.
   3. Poly-D-lisin (gece boyunca 4 ° C 'de, 0.15 M borat tamponu içinde 0.5 mg / ml) ile kaplayın.
   4. Bir sonraki gün (kültürün gün) laminin ile daha sonra kat PBS içinde 3 kez yıkayın üzerinde (2.5 ug / ml, doğal fare laminin) +% 5 v / v ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 2 saat de PBS içinde seyreltilmiş 37 ° C.
2. Embriyonik 18 günlük (E18) sıçan hipokampları inceleyin ve kalsiyum ve magnezyum, buz üzerinde soğutulmuş içeren PBS içine toplar. NOT: h....

Results

Burada sunulan iki renkli floresan immüno-lekeleme tekniği (Şekil 1 'de şematik olarak gösterildiği gibi) canlı hücrelerde transmembran proteinlerin hücre dışı etki etiketleme için yararlıdır. Kuluçka süresi boyunca, immünoglobulinler, erişilebilir epitopları bağlanan ve birlikte bağlı antikor ile protein moleküllerinin popülasyonunun bir kısmı, endocytosed edilir. Buna ek olarak, yeni sentezlenen protein ileri ticareti vasıtasıyla hücre yüzeyine ulaşabilir ve geri kazanılmış protein molekülleri, plazma.......

Discussion

Burada anlatılan teknik, (by-Cárcamo Arancibia et al. Yorumlanan), hücre-yüzeyi biyotinilasyon ¹² ile tamamlayıcı olan ve bu içsel proteininin hücre-altı lokalizasyonu hakkında bilgi muhafaza etmek için tercih edilen bir yöntem, uygun bir birincil antikor bir sağlanan hücre epitopu kullanılabilir. Buna ek olarak, zaman içinde protein ticareti / içselleştirme kantitasyonu protein özleri hazırlamak üzere gerek kalmadan (birincil antikor ile canlı hücre inkübasyonu boyunca farklı zamanlarda lamelleri sa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ca ve Mg ile PBS	İnvitrojen	14040182
Nörobazal ortam	Invitrogen	21103-049
B27 takviyesi	Invitrogen	17504-044
L-Glutamin	Invitrogen	25030-081
Papain Ayrışma Sistemi	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Sığır Serumu Albümin	Sigma Aldrich Avustralya	A9418
Hank' Kalsiyum, magnezyum, fenol kırmızısı içermeyen dengeli tuz çözeltisi	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poli-D-Lizin	Sigma Aldrich Avustralya	P0899
Doğal fare laminin	Invitrogen	23017-015	Alikot yapmadan önce buz üzerinde çözdürün
Fetal sığır serumu HyClone	Thermo Fisher
Florodeoksiüridin	Sigma Aldrich Avustralya	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Avustralya	U3003
18 mm Yuvarlak cam lameller	Menzel Glä ser	CB00180RA1
VECTASHIELD sulu montaj ortamı	Vektör Laboratuvarları	H1400
Eşek anti-tavşan Dylight 649	Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları	711-495-152
AffiniPure Fab fragmanı Keçi anti-Tavşan 1gG (H + L)	Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları	111-007-003
Paraformaldehit	Sigma Aldrich Avustralya	P6148	TOKSİK - çeker ocakta tutamak
Triton-X-100	Sigma Aldrich Avustralya	T8787
Alexa Fluor 488-konjuge eşek anti-tavşan 2 ve deg antikoru	Invitrogen - Moleküler Problar	A21206