Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Summary

Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir.

Abstract

Kültüre edilmiş nöronlarda bir farazi transmembran reseptörünün hücre yüzeyi yerini göstermek amacıyla, protein, bir hücre dışı bölümüne karşı ortaya çıkartılan bir antikor ile belirli bir primer, canlı nöronların yüzeyi üzerinde protein etiketli. Hücreler daha sonra tespit sonrası hücre yüzeyi ve iç protein her ikisi de aynı etiketli ikincil antikor ile tespit edilecek ise geçirgen reseptör olarak, yüzeye ve kaçırılan olduğu göz önüne alındığında. Burada, ya da hücre yüzeyi üzerinde kalmış veya bu süre esnasında yüzeye ticareti yapılan edilmiş antikor, inkübasyon kademesi sırasında ve protein endositoz tarafından internalize edilmiş etiket protein diferansiyel protein kaçakçılığı ("antikor besleme") çalışma için kullanılan bir yöntem adapte . Bu iki protein havuzları ayırt etmek yeteneği bir ilk Kuluçka sonra yüksek derecede konsantre edilmiş, etiketlenmemiş ikincil antikor ile bir gece boyunca bloke aşamasının dahil edilmesi sayesinde mümkün olmuştur, flüoresan-işaretli sekonder antikor ile unpermeabilized nöronların n. Farklı bir florofor ile işaretlenmiş bir fluorescent sekonder antikor ile içsel havuz tespit izin nöron bloke edici aşama, sonra, nüfuziyet. Biz ne olduğunu ortaya koyan, bu farazi reseptörün hücre içi konumu hakkında önemli bilgiler elde başardık bu tekniği kullanarak, gerçekten, nöronlarda hücre yüzeyine ticaretine. Bu teknik, bir hücre-dışı epitopuna uygun bir antikorun sağlanması ve kullanılması, hücre tipleri ve hücre yüzey proteinleri bir dizi geniş çapta uygulanabilir kullanılabilir.

Introduction

Yeni tanımlanan proteinin işlevini kurulması, söz konusu proteinin hücre içi lokalizasyonu ve ticareti araştırılması protein ^1,2 olası rolü / s ile ilgili önemli ipuçları sağlayabilir. Gelişmekte neokorteks ³ transcriptome biyoinformatik analizi fare beyin Kortikogenezin sırasında değişmiş ifadesini sergileyen genlerin bir listesini bize sağladı. Daha sonra, bu genlerin, sez6 tarafından kodlanan protein, nöron gelişmesinde önemli bir role sahip olduğunu tespit etmek için bir gen nakavt bir yaklaşım kabul etmiştir. Biz Nöbet-ilişkili gen 6 veya Sez6, protein gelişmekte dendritler bulunan ve aynı zamanda dendritik dikenler, almak ve uyarıcı sinyalleri entegre dendritler özelleşmiş yapılar mevcut olduğu görülmektedir. Bu proteinin eksik olduğunda Dahası, dendritler ve uyarıcı sinapsların doğru ⁴ oluşturmak için başarısız. Proteinin olası hakim izoformu transmembran bölgesinin özelliklere sahiptire imüno-reseptör proteininin hücre içi dağılımı konfokal mikroskopi ile ya da imünoelektron mikroskopla incelenmiş zaman, her ne kadar çoğu, hepsi değilse de, sinyalin plazma zarının etiketli çok az ya da hiç protein ile somatodendritik bölmesindeki küçük veziküller ile ilişkili ortaya Hücre yüzeyinde.

Kesin bir tahmin büyük bir hücre-dışı etki alanı ile farazi reseptör plazma zarına kaçırılan olduğunu göstermek için, biz, hücre yüzeyinde proteini etiketlemek için proteinin bir hücre dışı kısmına oluşturulan olan antiserum kullanarak canlı hücre bir yaklaşım kabul etmiştir. Geniş bir bloke etme ve bir permeabilizasyon adım ayrılmış diferansiyel etiketli ikincil antikor, iki uygulama ile, bu "antikor besleme" yaklaşımı birleştirerek, floresan-etiketli sekonder antikorları farklı fluoresc taşıyan bağlanarak ayırt proteininin iki farklı havuzları tespit etmişlerdirKBB etiketleri. Böylece, ya da hücre yüzeyi üzerinde kalmış veya bu süre esnasında yüzeye ticareti yapılan edilmiş proteinden antikor inkübasyon aşaması esnasında endositoz tarafından internalize edilmiş bir protein ayırt etmek mümkün oldu. Bu yöntemi kullanarak, ilgi konusu olan protein nöronlarda hücre yüzeyine ve kaçırılan olduğunu kurulmuştur. Bu nedenle, bu nispeten hızlı ve basit bir teknik tüm bu teknikler için aynı tavşan poliklonal antiserumu kullanılan gerçeğine rağmen, geleneksel yöntemlerle immünositokimya ya da önceden gömme immünolojik elektron mikroskobu daha fazla bilgi kanıtladı. Bu teknik, hücre dışı alanı epitopları tanıyan iyi bir antikor kullanılabilir verilen herhangi bir transmembran proteinin genel olarak uygulanabilir. Bu teknik, glutamat reseptör alt-biriminin GluR1 ⁵ reseptör kaçakçılığı incelemek için daha önce kullanılmıştır.

Protocol

1.. Disosiye Hipokampal Nöron Kültürü

1. Lamelleri (borosilikat cam) hazırlayın:
   1. % 100 etanol içinde yıkayın.
   2. UV ışınlaması altında hava kuru.
   3. Poly-D-lisin (gece boyunca 4 ° C 'de, 0.15 M borat tamponu içinde 0.5 mg / ml) ile kaplayın.
   4. Bir sonraki gün (kültürün gün) laminin ile daha sonra kat PBS içinde 3 kez yıkayın üzerinde (2.5 ug / ml, doğal fare laminin) +% 5 v / v ısı ile inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 2 saat de PBS içinde seyreltilmiş 37 ° C.
2. Embriyonik 18 günlük (E18) sıçan hipokampları inceleyin ve kalsiyum ve magnezyum, buz üzerinde soğutulmuş içeren PBS içine toplar. NOT: hayvanları ile ilgili tüm deneysel protokolleri Melbourne Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı.
3. Üreticinin talimatlarına göre Papain'in Ayrılma Kit gelen papain ve Dnaz ben çözümler hazırlayın.
   1. 1 ml papain çözeltisine 50 ul DNase I solüsyonu ekleyin.
   2. NOT: Onceilk önce, hazırlanabilmekte papain çözeltisi ve DNase I çözeltiler ayrı ayrı (sırasıyla papain ve DNase I 0.5 ml ve 25 ul numuneler) alikotları dağıtılmış ve ihtiyaç duyulacak zamana kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
4. Mümkün olduğu kadar PBS çıkarın ve 15-20 dakika boyunca 37 ° C 'de 1 ml papain / DNase I çözeltisi ile (embriyoların bir çöp itibaren) hipokampları inkübe edin. Yavaşça kuluçka dönemi sırasında iki kez içerikleri karıştırmak için tüp hafifçe vurun.
5. Hücre dispersiyon elde edilir ve eğer varsa, çok az kadar alevle parlatılmış Pasteur pipet silikonlu 10-15x hafifçe hipokampal doku (kabarcıkların oluşumunu önlemek) toz haline getirin, ayrışmamış doku parçaları kalır.
6. Dikkatle Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi artı katkı v sığır serum albümini (BSA) / w% 4, 3 ml yastığı üzerinde ayrışan hücre süspansiyonu katman (HBSS ^+; Bölüm 1.6.1 bakın).
   1. Rıştırılmalıdır oda sıcaklığında BSA eritilerek bu aşama gradyan çözeltisi hazırlayın2 mM _CaCl2, 1 mM MgSO _4, 4 mM NaHCO ₃ ve 40 mM glukoz (HBSS ^+), 4 ° C'de daha sonra steril filtre ve mağaza ihtiva eden HBSS içinde bir halka
7. Santrifüj, 100 xg, dışarı salınan bir rotor ile bir tezgah üstü santrifüj 7 dk.
8. Süpernatan hücre pelletini aspire için dikkatli olmak çıkarın.
9. 1 ml alevle parlatılmış (silikonlanmış) Pasteur pipeti (ya da 1 mi mavi pipet) ile yavaşça pelet hücreleri yeniden süspanse tam Neurobasal ortamı (% 2 B27 ile, 0.5 mM L-glutamin,% 1 FCS ile takviye edilmiştir).
10. (Sadece "canlı" hücreler olarak faz-parlak hücreleri saymak NB) Hemasitometre kullanarak iki 10 ul hacimde saymak.
11. Önceden hazırlanmış kaplı cam kapak slipleri (12 oyuklu bir plaka içerisinde 0.75-1 10 x ^5/18 mm lamel) üzerinde birincil nöronlar Plate. (Aşağıya bakınız) hemen önce kaplama için, kapak slipleri fazla olan laminin / serum çözeltisi aspire ve primer nöron kültür ortamı ile değiştirin. NB Gerekli nlamelleri koyu kahverengi bir örtücü cam, hazırlama önce kültüre gün başlamış olduğu gibi (adım 1.1) önceden tespit edilmesi gerekmektedir.
12. Kültür sıçan primer E18 Neurobasal ortamı içinde in vitro (DIV),% 2 B27,% 1 FCS (ısı ile inaktive edilmiş) ile desteklenmiş 0.5 mM L-glutamin en fazla 21 gün boyunca hipokampal nöronlar. Bundan sonra haftada 7 DIV ve bir buçuk orta değişikliği gerçekleştirin. Anti-mitotik florodeoksiüridin / üridin 7 DIV ilave edilir, her nükleositin 10 mM stok) içinde 1/1, 000 seyreltme glial büyümeyi engellemek için.

2. Canlı Nöronlar ile antikor inkübasyon

1. Kültüründe ilk haftasında, nöronlar dendritik milleri gelişmekte olan ve haftada 2-3, nöronlar sinaptogenez ^6,7 geçiyor olması için yeterince olgunlaşmıştır.
   1. Seçilen deneme zaman noktası / s'de, lamelleri birincil embriyonik nöron içeren üçlü çukurlara için birincil antikor uygulayın. Doğrudan bir kültür ortamı içine antikorun bir kısım eklemeistenen son seyreltme Not birincil nöronlar: Örneğimizde, proteinin rekombinant salgılanmış formu karşı ortaya çıkartılan bir tavşan poliklonal antiserumu de kültür ortamı içinde, 1 ml için 2 ul ekleyerek 1/500 seyreltilmiş, 10 dakika boyunca santrifüj , 13.000 xg, RT öncesinde bu gibi antikorun bir kısım alarak dahil edilebilir herhangi bir partikül madde kaldırır ve arka azaltmaya yardımcı olabilir.
   2. Ön-bağışık serum kontrol için, (aynı nihai seyreltme) ön-bağışık serum eşdeğer bir miktar ekleyin. Herhangi bir ön-bağışık serum mevcut değilse, Neurobasal orta ya da PBS eşdeğer hacmi (birincil antikor kontrol) ekleyin. Uygun bir birincil antikor, proteinin hücre içi bölgesi / s tanıdığını kullanılabilir Alternatif olarak, bu antikor da, yüzey boyama spesifikliği test etmek amacıyla, bir kontrol eklenebilir.
   3. 1-4 saat için kültür inkübatör hücreleri dön (bu kuluçka süresi deneysel olarak tespit edilebilir.) Bizim experime yılındaDeneysel tasarım içselleştirme zaman sürecini değerlendirmek için Yıkanmadan sonra başka bir inkübasyon süresi (darbe kovalayıcı deneyi), ardından bir antikorun bir darbe dahil olabilir, ancak nts, antikor, tüm süresi için de geçerlidir.
      Isteğe bağlı aşama: Bu inkübasyon gerektiğinde, bazal protein içselleştirme hızını yavaşlatmak için, oda sıcaklığında ya da buz üzerinde gerçekleştirilebilir. Olmayan bir _CO2 kontrollü bir ortamda gerçekleştirilir ise, ortam bikarbonat antikor / antiserumu ilave edilmeden önce tamponlanmamış bir değiştirilmelidir. DİKKAT: Olgun nöron kültürleri (> 14 gün, ve özellikle kültürlü fare embriyonik nöronlar) tam iyi orta değişiklik tahammül yok.
2. Uygun zaman ilgilenilen protein bolluğu bağlı olarak rağmen biz iyi sonuçlar ile, 1 saat, 2 saat ve 4 saat içinde, bu primer antikor, geliştirilmiş içselleştirme aşama için inkübasyon sürelerini kullandık cel protein ticaretinin dinamikleriÇalışmanın altında ls.
   Not: Örnek Sonuçlar gösterilen çift-renkli görüntüler, bir doku kültürü inkübatörü içinde, 37 ° C'de 1 saat bir kuluçkalama ile elde edilmiştir.
3. İstenen süre için inkübe edildikten sonra, antikor ihtiva eden bir ortam aspire. , Oda sıcaklığında PBS ile hafifçe fakat hızla bir kez kuyu yıkayın.

3. Sabit, Unpermeabilized hücreler İkincil antikor Application

1. Fosfat tamponu pH 7.2 içinde% 4 paraformaldehit ile nöronlar Fix, oda sıcaklığında, 5 dakika Not: En iyi sonuçlar için, taze hazırlanmış fiksatif kullanımı, herhangi çökelmiş paraformaldehit belirgin olduğunu, alternatif olarak -20 ° C'de saklanır ve tamamen çözülmüş edilmiş düzeltmeyi kullanmak . DİKKAT: paraformaldehid sabitleme maddesi hazırlanır ve bir çeker ocak içinde ele alınmalıdır.
2. Kuyular (davlumbaz sıvı atık kabına transfer) den düzeltme çıkarın ve PBS ile 3 kez yıkayın.
   1. İSTEĞE BAĞLI ADIM: İstenirse, antikor reaktifler kaydetmek için, lamelleri candikkatli bir forseps ile 12 oyuklu plakadan çıkarıldı ve tek bir kültür plakasının bazında koydu Parafilm bir tabaka üzerine, hücre tarafı yukarıya bakacak şekilde yerleştirilebilir.
   2. Tamamen Parafilm üzerine lamel kenarına çözelti, sel olmadan sahiptir, böylece Solutions sonra, kapak slipleri üzerine pipetlendi yavaşça edilebilir.
   3. Bu teknik, (örneğin, gece boyunca) nemlendirilmiş bir odada gerçekleştirilmelidir ancak uzun inkubasyon kısa süreli inkubasyon (1-2 saat) için uygundur. Seçenek olarak ise, lamelleri geri gece boyunca inkübasyon ve yeterli hacim için 12 oyuklu bir plakanın oyuklarına yerleştirilebilir lamelleri kurumaz emin olmak için ilave edilmelidir.
3. PBS içinde% 5 BSA (: bu hücrelerin geçirgen olmadığı önemli olduğu gibi, bu aşamada bloke çözeltisine deterjanı Not) ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Blok.
4. Alt kanalların ile devam etmeden önce yüzey proteini etiketlemek amacıylaiçselleştirilmiş protein tion, seçimi ilk floresan etiketli 2 ° antikor uygulanır.
   Not: Burada tarif edilen örnekte, primer antiserumun bir rekombinant salgılanmış izoform ⁴ tavşan (in-house antikor) içinde büyüdü. Bu nedenle, unpermeabilized nöronların yüzeyinde zar izoformunun hücre dışı bölgesini tespit etmek için ilk sekonder antikor için, eşek anti-tavşan DyLight 649 (% 5 BSA ihtiva eden PBS içerisinde seyreltilmiş 1/200) kullanılır. Bu kullanılmadan önce seyreltilmiş sekonder antikor çözeltileri (10 dakika, 13,000 xg, RT) santrifüje önerilir.
5. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca lamelleri inkübe edin.
6. PBS ile (kuyu) lamelleri yıkayın, 2x 5 dk.

4. Fazla Etiketsiz 2 ° Antikorla engelleme

1. Etiketlenmemiş 2 ° antikoru, yüksek konsantrasyonda (> 0.1 mg / ml) ile bloke unpermeabilized nöronlar.
   1. Etiketlenmemiş 2 ° antikoru türlerine karşı yükseltilmiş olmalıdır kiBirincil antikor, oda sıcaklığında gece boyunca inkübasyon ile (bu durumda tavşanda) yükseltilmiştir.
   2. Bu protokol için, AffiniPure F _ab fragmanı, keçi anti-tavşan IgG (H + L) 0.13 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda kullanılmıştır.
      Not: gece boyunca inkübasyon daha kısa bir kuluçka dönemi (2 saat) kadar önemli olduğu bulunmuştur tam olarak etiketlenmiş ikincil antikor ile bağlı değildi birincil antikor tam bloke etmek için yetersizdi.
2. PBS ile (kuyu) lamelleri yıkayın, 2x 5 dk.
3. Bu Bloke etme kademesinden sonra, fosfat tamponu pH 7.2, oda sıcaklığında, 5 dakika içinde% 4 paraformaldehit ile hücrelerin post-düzeltin. (Çeker ocak içinde sıvı atık konteynerine transfer sabitleyici) sabitleyici ayrılmasından sonra, PBS (2x) ile durulayın.

5. İkinci Floresan Konjuge 2 ° Antikor Permeabilization ve Uygulama

1. Permeabilize ve oda Tempe de% 0.1 Triton-X-100 içeren PBS içinde% 5 BSA ile bloke hücrelerin30 dakika boyunca hava sıcaklığı.
2. Engelleme çözüm (lamelleri kurumasına kalmamasıdır dikkat çekici) sökün. Farklı bir florofor ile etiketlenmiş ikinci floresan konjuge edilmiş 2 ° antikoru ilave edin.
   1. NOT: (aşağıya bakınız) konfokal mikroskop kullanılabilir uyarma / emisyon filtreleri bağlı olarak, önceden kullanılan birinden bu fluoroforun etiketi ayırt etmek mümkün olmalıdır.
   2. Bu protokolde yer alan, örneğin, bir Alexa Fluor 488-konjüge edilmiş eşek anti-tavşan 2 ° antikoru (1 / PBS içinde 200,% 5 BSA ve% 0.1 Triton-X-100) kullanılmıştır. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe sonra 2 ° antikoru uzaklaştırın.
3. Yıkama 3x PBS ile 5 dakika lamelleri ve son olarak, deiyonize su ile kısaca yıkayın.

6. Montaj ve Görüntüleme

1. Dağı sulu montaj orta içeren antifade (örn. Vectashield) ile cam slaytlar lamelleri ve kurumasını bekleyin. Op boyunca 4 ° C'de karanlıkta deposuflüoresan sinyal yoğunluğunun timal korunması.
2. Görüntü bir konfokal mikroskop hücreleri immunohistokimyasal.
   1. İki florofor sinyallerin tespiti için uygun uyarma ve emisyon filtreleri mevcut olmalıdır.
   2. Farklı deney koşulları (depolarize ^8,9 veya kontrol koşullarında, örneğin içselleştirme hızları) karşılaştırılabilir için ise, aynı görüntü tedarik parametreleri ile görüntülenmiş olan çeşitli koşullarından lamelleri çoğaltmak emin olun. Standart ilgi alanlarının ya da elde edilen görüntülerden puncta özelliklere (örneğin sayısı, boyutu) 'in yoğunluğu, daha sonra standart entegre görüntü analizi yazılımı (ör. Fiji / ImageJ, Metamorph) kullanılarak ölçülebilir.

Results

Burada sunulan iki renkli floresan immüno-lekeleme tekniği (Şekil 1 'de şematik olarak gösterildiği gibi) canlı hücrelerde transmembran proteinlerin hücre dışı etki etiketleme için yararlıdır. Kuluçka süresi boyunca, immünoglobulinler, erişilebilir epitopları bağlanan ve birlikte bağlı antikor ile protein moleküllerinin popülasyonunun bir kısmı, endocytosed edilir. Buna ek olarak, yeni sentezlenen protein ileri ticareti vasıtasıyla hücre yüzeyine ulaşabilir ve geri kazanılmış protein molekülleri, plazma...

Discussion

Burada anlatılan teknik, (by-Cárcamo Arancibia et al. Yorumlanan), hücre-yüzeyi biyotinilasyon ¹² ile tamamlayıcı olan ve bu içsel proteininin hücre-altı lokalizasyonu hakkında bilgi muhafaza etmek için tercih edilen bir yöntem, uygun bir birincil antikor bir sağlanan hücre epitopu kullanılabilir. Buna ek olarak, zaman içinde protein ticareti / içselleştirme kantitasyonu protein özleri hazırlamak üzere gerek kalmadan (birincil antikor ile canlı hücre inkübasyonu boyunca farklı zamanlarda lamelleri sa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ca ve Mg ile PBS	İnvitrojen	14040182
Nörobazal ortam	Invitrogen	21103-049
B27 takviyesi	Invitrogen	17504-044
L-Glutamin	Invitrogen	25030-081
Papain Ayrışma Sistemi	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Sığır Serumu Albümin	Sigma Aldrich Avustralya	A9418
Hank' Kalsiyum, magnezyum, fenol kırmızısı içermeyen dengeli tuz çözeltisi	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poli-D-Lizin	Sigma Aldrich Avustralya	P0899
Doğal fare laminin	Invitrogen	23017-015	Alikot yapmadan önce buz üzerinde çözdürün
Fetal sığır serumu HyClone	Thermo Fisher
Florodeoksiüridin	Sigma Aldrich Avustralya	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Avustralya	U3003
18 mm Yuvarlak cam lameller	Menzel Glä ser	CB00180RA1
VECTASHIELD sulu montaj ortamı	Vektör Laboratuvarları	H1400
Eşek anti-tavşan Dylight 649	Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları	711-495-152
AffiniPure Fab fragmanı Keçi anti-Tavşan 1gG (H + L)	Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları	111-007-003
Paraformaldehit	Sigma Aldrich Avustralya	P6148	TOKSİK - çeker ocakta tutamak
Triton-X-100	Sigma Aldrich Avustralya	T8787
Alexa Fluor 488-konjuge eşek anti-tavşan 2 ve deg antikoru	Invitrogen - Moleküler Problar	A21206