Sökme Mikrotubul saplı tarafından Driven Hareketleri Eğitim için Segment Mikrotübüller hazırlanması

Özet

Mikrotübüller doğal kararsız polimerler, büyüme ve kısalması arasında kendi anahtarlama stokastik ve kontrol etmek zordur. Burada photoablatable stabilize kapaklar ile segmentli mikrotübülleri kullanarak protokolleri açıklar. Parçalara Mikrotübüllerin depolimerizasyonu böylece sökmeden mikrotübül uçları ile hareketleri analizi yardımcı, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile tetiklenebilir.

Özet

Mikrotübül depolimerizasyonu, in vitro olarak, farklı protein kompleksleri ve protein-kaplanmış boncuklar taşımak için kuvvet sağlayabilir. Altında yatan mekanizmalar, hücre bölünmesi sırasında mikrotübül bağımlı kromozom hareketleri hayati bir rol oynadığı düşünülmektedir, ancak ilgili proteinler ve onların rolleri kötü tanımlanır. Böylece, saflaştırılmış bileşenler ve tanımlanmış biyokimyasal ortamı kullanılarak in vitro bu hareketliliği incelemek için hangi ile analizi geliştirilmesi için, artan bir ihtiyaç vardır. Mikrotubuller Ancak, doğal olarak istikrarsız polimerler, büyüme ve kısalması arasında kendi anahtarlama stokastik ve kontrol etmek zordur. Biz burada açıklamak protokolleri photoablatable kapaklarını stabilize ile yapılır kesimli mikrotübüllerde yararlanmak. Bu tür kesimli Mikrotübüllerin depolimerizasyonu böylece sökmeden mikrotübül ucunda hareketlilik çalışmaları yardımcı olmak, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile tetiklenebilir. Bu teknik, ca için kullanılabilirDinamik mikrotübül uçları processively hareket floresan etiketli protein kompleksleri, moleküllerin sayısının kantitatif analiz iken yapılmalıdır. Bu, bir sinyal-gürültü oranı ve diğer sayısal floresan tahlilleri optimize etmek için, lamelleri çözünür floresan etiketli proteinlerin spesifik olmayan emilmesini azaltmak için tedavi edilmelidir. Ayrıntılı yöntemler, dikkate floresan aydınlatma eşitsizliği almak ve eşit Gauss uyum kullanarak tek bir fluorofor yoğunluğunu belirlemek için sağlanır. Son olarak, ilerleyici yük hareketi etti mikrotübül depolimerizasyonu için farklı motor ve fonksiyonları ilgilendirmeyen proteinlerin yeteneği bakış açıları sağlayan, protein kaplı mikroboncuk mikrotübüle bağlı hareketleri çalışma segmente mikrotübül kullanılmasını tarif eder.

Giriş

Mikrotübüller hücre mimarisi yüksek hücre motilite, hücre bölünmesi ve hücre içi ulaşım ¹ için önemli olan hücre iskeleti yapısını muhafaza edilir. Bu dinamik polimerler GTP varlığında tübülin ikinci montaj ve kendiliğinden büyüme ve ² kısalma arasında geçiş yapma. Mikrotübüller (çapı sadece 25 nm) kontrast ışık mikroskobu ile mikrotübülleri gözlemlemek için kullanılmalıdır geliştirmek için bu nedenle özel optik teknikler çok ince. Bu polimerler ile önceki iş diferansiyel girişim kontrast (DIC) ³ kullanılarak dinamik davranışlarını inceledi. In vitro çalışmalar, bu ve benzeri tipik bir deney koşulları altında, mikrotübüller, sadece nadiren depolimerizasyon için felaket ve geçiş tabi olduğunu ortaya kez her 5-15 dakika (bu frekans 28-32 ° C 'de incelenmiştir 7-15 mM çözünür tubulin konsantrasyonu için ) ^4. Farklı teknikler böylece induc ileri sürülmüştürkontrollü bir şekilde e mikrotübül depolimerizasyonu. Mikrotübül kısalma burada açıklandığı gibi, uzak çözünür tubuline ^5,6 yıkayan bir lazer ışını ⁷ mikrotübülleri kesme veya segmentli mikrotübülleri ⁸ ile tetiklenebilir. Parçalara mikrotübülleri, hem de davranışsal geçiş polimerleri kullanan önceki çalışma, bu kromozom, veziküller ve protein-kaplanmış boncuklar gibi küçük hücre içi yüklerin, katı yağ mikrotübül ^9-13 uçlarında hareket edebilir bulmuştur. Bu olgu mitotik hücrelerde kromozom hareketleri için bir doğrudan etkisi olduğu düşünülen ve altta yatan mekanizmalar etkin soruşturma ^14-16 halen olmasıdır.

Son zamanlarda, toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi dahil floresan-tabanlı teknikler, dinamik mikrotübül ile hareketliliği incelemek için istihdam edilmiştir ^17-24 sona erer. Bu yaklaşımın avantajı sağlar: ki etkileşim incelenmesiFarklı florofor ile etiketlenmiş proteinleri kullanarak gerçek zamanlı olarak mikrotübül ve mikrotübül bağlanma proteinleri arasındaki s. Çeşitli protein kompleksleri mikrotübül uçları uzatma ve / veya katı yağ ile processively hareket bulunmuştur. Bunlar mikrotübüle bağlı proteinler Dam1 ^{10,12,18, 19} Ska1 ve XMAP215 ^20, hem de kinesin motorlar Kif18A ^{21,22, 23} ve MCAK CENP-E ²⁴ içerir. Bu proteinler EB1 ²⁵ gibi klasik uç-izleme proteinlerin bu temelde farklı süreçsel uç-izleme, sergilerler. EB1 ve ilişkili moleküller ortakları kararlı bir şekilde dinamik mikrotübül ayrı moleküller hızla çözünen havuz ²⁶ ile karşılıklı, sadece yaklaşık 0.8 saniye için mikrotübül ucuna bağlı kalır, uçları ile bağlantılı kalmasını görünse de. Mikrotübül birçok mikron için biter aksine, süreçsel ucu izci, Dam1 gibi, seyahat ve mikrotübül ipuçları ile ilişkisi m sürebilirHerhangi bir saniye. Uç birleştirilmesi zaman yanı sıra izleme edilen oranı, ^tip-27, izleme kompleks oluşturan moleküllerin sayısına kuvvetle bağlıdır. Büyük protein toplulukları genellikle çok daha iyi uç-izci vardır. Örneğin, izole edilmiş maya kinetekor gibi kompleks düzenekleri mikrotübül bağlanmış kalabilir ²⁸ saat için sona erer. Bazı mikrotübül bağlayıcı proteinler, örneğin Ndc80 kinetochore protein kompleksi, tek bir molekül düzeyinde biter mikrotübül ile izlemek mümkün bulundu, henüz Ndc80 boncuk kargo ^19,29-31 hareketini bağlanması çok etkili olmuştur. Bu nedenle, farklı protein kompleksleri, hem de kendi biyolojik rolleri ile uç-izleme mekanizmasını anlamak için, bu tip-izleme kompleks moleküllerin sayısının bir fonksiyonu olarak, uç-izleme incelemek için, hem de belirlemek için önemlidir boncuk yük yüzeyinde toplu hareketliliğini sergilediği bu komplekslerin yeteneği.

Biz Parçalara mikrotübüllere (Şekil 1A) ile deneyler hazırlamak ve yürütmek için ayrıntılı protokoller aşağıda sunmaktayız. İlk olarak, ticari olarak temin edilebilen cam slaytlar kısa bir polietilen boru (Protokol 1) bağlamak için modifiye edilir. Yeniden mikroskopi akış odası o zaman böyle bir slayt monte ve kimyasal veya plazma temizlenmiş ve Silanlanmış lamel (protokol 2) ^32-34 edilir. Elde edilen hücre hacmine giriş hortumunun hacmi de dahil olmak üzere 20-25 ul (veya 15 ul kadar küçük, Protokol 1 Not: 3) 'dir. Ticari olarak temin edilebilen akış gözlerinden de kullanılabilir, ancak bunların hacmi proteinlerin gereksiz atık yol açan, genellikle daha büyüktür. Daha büyük bir bölme kullanılması durumunda, aşağıdaki protokol tüm çözümlerin hacim ölçekli orantılı olmalıdır. Mikrotübül tohumlar daha sonra yavaş yavaş hidroliz edilebilir GTP analoğu GMPCPP (Guanozin-5'-[(α, β)-methyleno] trifosfat) (3 protokol kullanılarak, örneğin hazırlanır, Hyman et al. ^35). Tohumlar temizlenmiş bir lamel üzerine immobilize edilir ve yüzey, daha sonra, diğer proteinlerin spesifik olmayan emilmesini önlemek için bloke edilir ³² (protokol 4 digoksigenin ile tohum immobilizasyon açıklanmaktadır). Parçalara mikrotübül Protokol'ü ve sonra 5 kullanılarak hazırlanabilir. Bu yaklaşımın temel mantık GTP varlığında meydana dinamik mikrotübül polimerler GMPCPP içeren kararlı tubulin kesimleri, kısa "kapaklar" eklenerek geçici olarak stabilize edilebilir olmasıdır. Bu kapaklar da Rodamin etiketli tubulin içerir, bu nedenle bir 530-550 nm lazer veya cıva ark lambası (Protokol 6) ³⁶ ile görüş alanını aydınlatarak basitçe kaldırılabilir. Ucu-izleme sinyalinin floresan yoğunluğu daha sonra dikkate mikroskop alan aydınlatma (Protokol 7) ve eşitsizliği alarak sökmeden mikrotübül uçları ile seyahat moleküllerin sayısını tahmin etmek için kullanılabilir. Benzer bir yaklaşım kullanılabilir²⁷ (Protokol 8) 'de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır mikrotübüllerin depolimerizasyon ve protein-kaplanmış boncuklar arasındaki etkileşimi incelemek için. Bazı proteinler kolayca bölümlere mikrotübül duvarlara bağlanırlar, ancak lazer cımbız da böylece onun bağlanmasını destekleyerek, mikrotübül duvarına yakın boncuk tutmak için kullanılabilir.

Protokol

Gerekli ekipman: Aşağıda tarif edilen deneyler, DIC ve floresan görüntüleme (Tablo 1) donatılmış bir ışık mikroskobu gerektirir. Parlak alan LED aydınlatma ölçüde düzenli bir Halojen lamba ile gözlemlemek zor lamel bağlı mikrotübül tohumların ^37, tespiti geliştirmek için kullanılabilir. Mikroskopi odalarında sıvı akışını kontrol etmek için, çözeltiler, 10-100 ml / dak akış hızı kapasitesine sahip bir peristaltik pompa ile değiştirilmelidir. Bir şırınga pompası da kullanılabilir, ancak bakım akış hızı aniden değiştiğinde oluşturabilmektedir hava kabarcıklarını önlemek için önlem alınmalıdır. Protein-kaplanmış boncuklar işleme için, örneğin bölümlere mikrotübül duvara yakın getirmek için, bir 1064 nm aralıksız dalga lazer ışını mikroskop optik eksen sokulur ve üretilmesi için bir yüksek sayısal açıklık objektif (1.3 ya da daha yüksek) ile odaklanabilir bir tuzak. Floresan kantitatif analiz içinikaz ışığı bu ışık kaynağının şiddeti yana lazer temel kaynak tarafından sağlanmalıdır tek moleküllerin yoğunluğu, bir cıva lambası tarafından üretilen daha stabildir. Mekanik titreşimleri en aza indirmek için, bir optik mikroskop masaya yerleştirilmelidir. Daha sofistike ekipmanlar depolimerizasyon mikrotübül sabit bir kuvvet altında uçları boncuk hareketini çalışma ve tek çekim kuvveti sinyalleri ^11,38,39 ölçmek için gereklidir, bu yöntemler, başka bir yerde tarif edilecektir.

1.. İmalat Kullanımlık Akış Chambers

Yeniden akış odaları için cam slaytlar (bizim tedarikçi ile ilgili ayrıntılı bilgi için bakınız Tablo 2) Şekil 1B şema kullanarak bir yerel cam üretim tesisi sipariş edilebilir. Ultrasonik freze normal mikroskop iki oluklar 15 ± 1 mm uzunluğunda yapmak için slaytlar (75 mm x 25 mm, kalın 1,0 mm), 1.0 ± 0.1 mm genişliğinde ve derin 0.8 ± 0.05 mm değiştirin.En yakın ucu arasındaki mesafe 14 ± 1 mm olmalıdır, bu mesafe 22 mm x 22 mm'lik bir örtücü cam, ile birleştirilmiş bir bölme için en uygunudur. Diğer malzemelerin bir listesi için Tablo 2'ye bakınız.

1. Olukların iç uçlarında ~ 5 mm çıkıntıları bırakarak sürgünün her oluk içinde bir 100 mm uzunlukta polietilen tüp (OD 0.61 mm, Tablo 2) yerleştirin. Yivlerin içine tamamen tüpler gömme, siyanoakrilat yapıştırıcı madde ile olukların içine tüpleri düzeltildi.
2. Tüplerin içindeki tutkal dökülüp kaçınarak, epoksi yapıştırıcı ile oluklar doldurun. Tutkal ~ 1 gün boyunca kurumasını bekleyin.
3. Keskin bir tıraş bıçağı ile sürgünün merkezine yakın olan parçaları ortadan kaldıracak, her bir birleşme bölgesi distal ucundan katılaşan yapıştırıcı kütle 3-4 mm kesti. Tüpler oluklar içinde kalmalıdır. Proksimal parçaları Çıkarma da kesilmiş ve iki tüp açıklıklar ile düz bir yüzey oluşturarak, iç çıkıntılar kaldıracaktır.
4. Su ve bir şırınga testi ile dolduruntüpler düzgün çalışıp çalışmadığını. Serbestçe sıvı akımları, 1 gün (Şekil 1D) için kuru bahçeleri dış uçlarında epoksi tutkal bir damla (~ 5 mm çapında) koyarsanız. Bu odalar daha dayanıklı hale getirecek, bu yüzden aylarca tekrar tekrar kullanılabilir.
   Not 1: ters çevrilmiş bir mikroskop için bir bölmeyi yapmak için, slaytlar yivlerin (Şekil 1C) karşıt uçlarında iki küçük delikler yapmak için ilave olarak modifiye edilmelidir. , Slayt deliklerden tüpler yerleştirin tüpleri viraj ve olukların (Şekil 1E) içine sıkıca onları uyar. 1,2-1,4 adımları izleyin, ama bir akış odası yapmak için kullanılacak olan yüzey, gelen epoksi yapıştırıcı çıkarın.
   Not 2:, oda hacmini azaltan iki çentikler 0.050 derin ± 0.005 mm yapmak için freze kullanmak, 5.0 ± 0.5 mm genişliğinde ve hafifçe yükseltilmiş slayt orta kısmını bırakarak (Şekil 1B ve 1C "kazınmış alanlar" bakın) için. Ne zaman t(aşağıda açıklandığı gibi) o akış bölmesi monte edilir, bu girinti içine çift taraflı bant yerleştirin.
   Not 3: Bu modifiye slaytları yeniden kullanmak için, deneyler bir jilet kullanarak lamel ve çift taraflı bantı çıkarın bitirdikten sonra. Soyularak tarafından ve% 70 etanol ile slayt silerek mastik çıkarın. Peristaltik bir pompa ile boru eklemek ve 50-70 ml serpmek, tozsuz bölmesine eşit deiyonize su hacmi, kuru ve mağaza ile takip bir laboratuar bulaşık deterjanının% 1-2 olan bir kap içinde slayt yerleştirin.

2. Lameller hazırlanması

Bu protokol, 6-8 saat sürer ve 12 lamelleri hazırlamak için yardımcı olacaktır. Sen kapaklı bir seramik lamel tutucu ve 3 lamel boyama kavanoz gerekir; kavanoz hacmi 15 ml olmalıdır, böylece her bir araya yığılmış 4 lamelleri yapacak. , Bir kapak (250 mi) ile bir cam kavanoz silan ile lamelleri inkübe etmek için kullanılmalıdır. Düzenli No.1 cam lamelleri kullanın (22 mm x 22 mm veya 2X 30 mm 2 mm) malzeme listesi için masalar 2 ve 3'e bakınız. Eldivenleri giyerek Tüm adımlar, bir çeker ocak içinde yapılmalıdır.

1. Cam lamel boyama kavanoz içine lamelleri koyun ve aseton ile kavanozları doldurun. 1 saat boyunca inkübe edilir, deiyonize su ile 10x yıkayın.
2. Etanol ile lamelleri 10 dakika inkübe edin ve deiyonize su ile tekrar 10x yıkayın.
3. "Piranha" çözüm hazırlayın. Isıya dayanıklı bir cam kap içinde hidrojen peroksit çözeltisi (su içinde% 30) 60 ml koyun ve yavaş yavaş sülfürik asit 100 ml (hidrojen peroksit çözeltisine asit nihai oran 05:03 olduğunu). Çözüm, ısınır bu normaldir ama dikkatli kullanın. Piranha çözümü son derece yıpratıcıdır! Kalın laboratuvar mont, eldiven ve gözlük kullanın!
4. Kapakları kapatmak ve 1 saat boyunca 90 ° C'ye ısıtılmış bir su banyosu içinde yer kavanoz, "pirana" çözelti ile lamel boyama kavanozları doldurun.
5. "Piranha" soluti off dökünişyerinde güvenlik kurallarına tarafından talimat olarak ve üzerine atın. Yıkama, deiyonize su ile 10x lamelleri.
6. , 0.1 M KOH ile lamel boyama kavanozları doldurun 10 dakika inkübe edilir ve deiyonize su ile 10x yıkayın. Bu, "pirana" tedavi sonrasında lamelleri kalan herhangi bir asit kalıntılarını nötralize eder.
7. Kuru lamelleri Teflon kaplı düz kenarlı cımbız (cam yüzeyine zarar en aza indirmek için) her lamel tutarak bir seferde bir ve sıkıştırılmış kuru azot üflerken. Silan çözelti su ile son derece reaktif olduğundan, lamelleri tamamen kurutulur emin olun.
8. Iyice azot ile kurutmaya tabi olmalıdır seramik sahiplerine (tutucu başına 12 lamelleri), içinde kurutulmuş lamelleri yığını. Lamel yüzeyine yapışmasını önlemek için toz kaplı seramik sahipleri tutun.
9. Moleküler Elek, Sınıf 564, su emme ile 250 ml cam kavanoz içinde (çapı 6 cm) alt kapak.
10. 200 ml ile kavanoz doldurunPlusOne Repel Silan çözeltisi ve yavaşça kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir, bir kavanoza lamelleri ile bir seramik tutucu bırakın. Bu lamel yüzeyinde hidrofobik kaplamaya yaratacaktır.
11. Yavaşça kavanoz lamelleri ile yuvasını çıkarın ve transfer metanol ile dolu lamel boyama kavanoz içine bir anda lamelleri.
12. Lamel boyama kavanoz yüksekliğinin 2/3 için batırılır böyle bir sonik banyo, su haznesi içine bir metal ya da cam kaide yerleştirin. 20 dakika boyunca 70 W de sonikasyon, metanol solüsyonu 5 dakikada bir değiştirme, daha sonra deiyonize su ile 10x yıkayın. Silanlaştıncı düzgün çalıştı ise sudan kaldırıldı zaman, lamelleri kuru görünecektir.
13. İyice yukarıda belirtildiği gibi, azot kullanılarak bir artık suyun ayrılması.
14. Lamelleri arasında yüzey-yüzeye temas önlemek için Kimwipes lamelleri Interlay. Lameller, oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca mühürlü bir kap içinde saklanabilir.
    NOT 1: 2.1-2.6 ölçüde toplam hazırlık süresini azaltarak, 30 W 15 dakika boyunca Plazma Temizleyici ile lamelleri temizleyerek değiştirilebilir Adımlar. Temizleme odası içindeki basınç, 100-200 mTorr ayarlanır. Her ikisi de, atmosferik basınçlı, oksijen ve kullanılabilir. Seramik tutucular plazma temizlenmiş lamelleri yığını ve 2.7 adıma geçin.

3. GMPCPP-mikrotübül stabilize tohumları hazırlanması

Bu prosedür, ~ 1 saat sürer ve elde edilen mikrotübül tohumlar oda sıcaklığında 1-2 gün boyunca stabildir. Reaktiflerin bir listesi için bakınız Tablo 4.

1. Buz üzerinde Mix:
   • 10 ul BRB-80 tampon tubulin (100 uM, Tablo 4) etiketlenmemiş (80 mM Pipes, 1 mM EGTA, 4 mM _MgCI2, KOH ile pH 6.9; takviyesi 1-2 mM DTT ile her bir deney için taze bir kısım kullanılarak) dönüştürülmüştür.
   • 2.6 ul digoksigenin-etiketli tubulin (Tablo 4). Hazırlık bağlı olarak ses seviyesini ayarlayın,etiketsiz tubulin etiketli nihai oranı en az yaklaşık 01:10 olduğu şekilde. Pipetleme ile iyice karıştırın.
   • 1.4 ul 10 mM GMPCPP (nihai konsantrasyon 1 mM)
2. 35 ° C'de 15 dakika inkübe, tohum uzun 2-3 um büyüyecektir. Farklı mikrotübül uzunluğu isteniyorsa saati ayarlayın.
3. Oda sıcaklığında tohum pelet için 25.000 x g de 15 dakika boyunca 35 ul BRB-80 (35 ° C'ye önceden ısıtılmış), pipetleme ile karıştırın ve santrifüj ekleyin.
4. , Süpernatant atın hafifçe ılık BRB-80, 50 ul ekleyerek ve kaldırarak pelet yıkayın.
5. Süspanse 25 ul BRB-80 iyi pelet.

4. Lameller için Mikrotubul tohumları eki

Protokoller 4 ve 5 2-3 saat gerektirir, bu yüzden iki akım odaları günde kullanılır.

1. Silanlanmış lamelleri kullanarak üreticinin talimatlarına göre akış odasının birleştirin ve 4.2 adıma geçin. Ismarlama lamelleri kullanıyorsanız (Protokol 1), bel adımları izleyinow.
   1. , Merkezi ~ 5 mm genişliğinde bir alanda birlikte çift taraflı bant, iki adet (5 mm x 30 mm) takın sıkıca bant, basın tepesinde Silanlanmış lamel koydu.
   2. Tüplerinden biri aracılığıyla BRB-80 ile odasını doldurmak ve yuvarlak kürdan ile iki tüpü takın.
   3. Küçük bir plastik Petri kabı üstüne iki-renkli Kwik Cast dolgu küçük bir damla sıkın ve bir kürdan kullanarak hızlı bir şekilde ama iyice karıştırın. Mastik yeşil olur, hemen uygulamak, dikkatli lamel tüm kenarları sızdırmazlık. Mastik coverslip altında çok derinden nüfuz ederse, kürdan fişi çıkararak tüplerden birini açın ve tüpler içinde sızıntı mastik önlemek için hafif bir basınç uygulayın.
   4. 10 dakika için odayı kuru edelim ve akış daha fazla ilerlemeden önce sınırlı olmadığını onaylayın.
2. 32 ° C önceden ısıtılmış bir mikroskop sahnede odasına yerleştirin ve sıvıyı dışarı pompalamak hangi bir pompaya tüplerden birini takın. Giriş borusunun uzunluğuÖnerilen uzunluğu 5-7 cm: reaktiflerin gereksiz kaybını önlemek için en aza düşürülmesi gerekmektedir. Bir 0.5 Bu ucu daldırın ml BRB-80 tamponu ile flakon. Bu ve aşağıdaki tüm çözeltiler 32-35 ° C'ye önceden ısıtılmış olmalıdır
3. Bir pompa ile hafif bir baskı uygulayın ya da sadece giriş tüpü fiş çekildiğinde bazen oluşturabilir hava kabarcıklarını dışarı sıkmak için çıkış borusunun ucunu kaldırın.
4. 100 ul / dk 'da pompa hızını ayarlayın. , BRB-80 1:30 seyreltilmiş anti-digoksigenin antikorları 2 odacık hacmi ile yıkanır antikor soğrulmasına olanak vermek için 15 dakika inkübe edilir.
5. Sıcak, BRB-80 5-10 odası hacimleri ile yıkayın silanize lamel hidrofobik yüzey engellemek için BRB-80 içinde% 1 Pluronic F-127 ile 10 dakika inkübe edilir.
6. Motilite tampon 5-10 oda hacimleri (BRB-80 kazein 0.4 mg / ml ile takviye edilmiş) ile yıkayın.
7. 10 ul / dk pompa hızını düşürün ve 30-40 ul hareketlilik tamponu 1:200-1:600 ​​seyreltilmiş mikrotübül tohumları serpmek. 15 mi inkübelamel-adsorbe antikorlara tohumların bağlanmasını teşvik etmek için n.
8. Herhangi bir bağlanmamış malzemenin bertaraf edilmesi için motilite tampon 400 ul ile 100 ul / dk 'da bölmeyi yıkayın.
   Not 1: Elde edilen tohum yoğunluğu 10-30 ortalama alan bir mikroskop (Şekil 2A) olmalıdır. Gidermek için, lamel bağlı tohumların daha kolay tespiti için polimerizasyonu (adım 3.1) sırasında floresan etiketli tubuline kullanın.
   Not 2: Chlamydomonas ⁴⁰ ya da başka biyolojik kaynaklardan, hem de lize edildi ve hücre deciliated Tetrahymena ⁴¹ ince zarlar hazırlandı Axonemes da çekirdek oluşturucularının mikrotübül olarak kullanılabilir. Bu çekirdek oluşturucularının küçük mikro tüp dizileri oluşturmak için yararlıdır ve protofilaments belirli sayıda mikrotübülüsleri (GMPCPP tohum çekirdeklenmiştir ≥ 14 protofilaments ⁴² içeren tek bir mikrotübül) arzu edildiği zaman tercih edilir. Bu yapılar, atta spesifik olmayan emme ile temizlenmiş lamelleri bağlı, ama olabilirchment silanize lamelleri kullanarak, özellikle antikor bazlı bağlanma ile karşılaştırıldığında, genellikle daha az stabildir.

5. Kesimli Mikrotübüller hazırlanması

Altındaki tüm çözüm hacimleri kamara hacmi 15-20 ul içindir; büyük oda kullanılması durumunda orantılı olarak artırmak.

1. Ön ısıtılması etiketlenmemiş tubulin karışımı 35 ° C'de 30 saniye boyunca (45 ul tampon motilite 1 mM Mg-GTP ile ve 10-15 uM etiketlenmemiş tübülin ile takviye edilmiş) 30 | il / dk 'da serpmek.
2. DIC optik (Şekil 2B, Video 1) ile mikrotübül büyümesini izlemek. 5-7 dk İnkübasyon sırasında mikrotübülüsleri genellikle ~ 10 mikron uzun büyümek.
3. Rhodamine-tubulin karışımı (0.5 mM GMPCPP ve tübüline Rodamin, 0.5-1 mol oranı rodamin etiketli tubulin 2-5 uM ile takviye edilmiş 65 ul hareketliliği tamponu) ile hazırlayın ve 30 saniye boyunca 35 ° C 'de sıcak bir çözüm.
4. 30 μ hemen serpmekl / dak. Mikrotübül uçları kararlı floresan kapaklar oluşumunu teşvik etmek için 8-10 dakika boyunca inkübe edin. Kararlı mikrotübül kesimleri de kendiliğinden çekirdekleştirmek ve DIC optik ile görünür olacaktır.
5. Tübülinler ve nükleotidler, yanı sıra çözünebilir mikrotübül parçalarını almak için 20 ul / dk 'da hareketliliği tampon 100 ul de odası yıkayın.
6. DIC, mikrotübülüsleri (Şekil 2B) görülebilir onaylamak; birçok mikrotübülüsleri kapatma sırasında sökmeye çünkü onların sayısı, ancak, (Video 2 segmentli mikrotübüllerle tipik bir alan gösterir) azaltmak gerekir.
   Not 1: Segmentli mikrotübüller çok stabil olan ve en az 2 saat boyunca kullanılabilir. Bununla birlikte, bu mikrotübül ömrü aşırı çözelti değişimi ile azalır, ya da 2-mersaptoetanol görüntüleme tampon maddesi kullanılır ise.

6. Depolymerizing Mikrotubul saplı Protein Takibi Deneysel Gözlem

1. IntrodUCE 30-50 10 ul / dk 'da odacık içine floresan proteini (0.1-20 nM) ul. Lamel yapışmasını belirgin bir protein ise, 4-8 mg / ml BSA ile motilite tampon takviyesi. Alexa488 Dam1 ucu izleme ayrıca 10 mM DTT veya% 0.5-1 βME ¹⁰ gerektirir.
2. Mikrotübül gereksiz ağartma ve sökebilme önlemek için bir mikroskop alanında diyafram kullanarak aydınlatma alanını sınırlayın.
3. GFP filtre küp kullanarak video satın alma başlayın, daha sonra görüntü kaydını kesmeden Rhodamine filtre küp geçmek. Mikrotübül ucunda kırmızı parça açıkça görünür olmalıdır, onlar (Video 3) solmaya ve hızlı bir şekilde çözülmeye başlayacak.
4. Kapaklar neredeyse (genellikle, 10-20 saniye boyunca ama bu sefer daha uzun bir alt Rhodamine etiketleme oranı ile yetiştirilen kapaklar için olacak) kayboluncaya kadar aydınlatmak ve mikrotübül demontaj ile izleme protein kaydetmek için GFP kanala geri dönmek için devam edin.
5. AnalizKymographs oluşturarak çıkan diziler, MetaMorph, serbestçe kullanılabilir ImageJ veya diğer görüntü işleme yazılımları (Şekil 2E) kullanılarak) gözlem süresince çeşitli zamanlarda mikrotübül ekseninde floresan yoğunluğunu göstermek, yani iki boyutlu görüntüler.
   Not 1: Kazanım oranı gözlenen olayların zamanlamasına bağlı olarak ayarlanabilir olmalıdır. Önerilen oran yavaş hareket için saniye (fps) başına 2-3 kare olduğunu, halka ölçekli Dam1 ²⁷ kompleksleri ama tek moleküllerin için toplama süresi> 20 fps ¹⁹ olmalıdır.
   Not 2: Son derece hassas bir EMCCD, örneğin ANDOR iXon3, depolymerizing mikrotübüllerle uç-izleme olayların hızlı kayıt için gereklidir. Andor iXon3 kamera için önerilen ayarlar şunlardır: kazanç 5x, EM kazanç 200, 1 MHz okuma hızı, 16-bit sensör modu, 80 msn maruz kalma süresi.
   Not 3: TIRF mikroskobu kullanarak sinyal-gürültü oranını geliştirmek, ancak, daha kısa mikrotübüller kullanılmalıdır, bu that floresan stabilize kapaklar yiten alanına ulaşılabilecek kalır.

7. Mikrotubul İpucu izleme Kompleksi Moleküler Boyutu Kantitatif Analiz

Bu yaklaşımın mantığı, bir fluorofor yoğunluğuna uç izleme kompleksinin toplam floresan yoğunluğu oranının bularak bir uç izleme kompleks moleküllerin sayısının belirlenmesidir. Bu yaklaşım, GFP-protein füzyonları ve florasan boya ile işaretlenmiş proteinler uygulanabilir, ancak terkiplerde bir protein moleküller flüoresan değilse, bu tip-izleme komplekslerinde molekül sayısını yetersiz kalabilmektedir.

1. Floresan etiketli protein molekülleri için kayıt ışıkla ağartma kinetiği.
   1. Tüm Protokolü'nü 2 kullanılarak hazırlanabilir bir nonmodified cam slayt, çift taraflı iki şerit, ve temiz bir lamel kullanılarak düzenli mikroskopi odasının birleştirin, ya da yalnızca bu 2.1-2.6 adımlarıprotokolü.
   2. , Hareket tamponunda yaklaşık olarak 50 nM protein ekleyin hareketliliği tamponu ile yıkayın ve kısa bir süre valap (Tablo 4) ile odası kapağını kapatın. (Çözelti içinde kendiliğinden oluşabilir veya birkaç tek moleküller birbirine yakın olan ve çözülemeyen görünebilir trimerleri ve tetramerler) tek moleküller temsil eşit dağılmış noktalar (Şekil 3A) ve kendi küçük agrega ile alanını elde etmek için protein konsantrasyonu optimize . Bu adım, ışıkla adımlar ve adım büyüklüğü doğru belirlenmesi (aşağıya bakınız), çok yoğun dağılımı elde edilmesi için çok önemlidir.
   3. Tek flüoresan lekelerin hala görünür olduğu da aydınlatma lazer yoğunluğu en aza indirmek, düşük aydınlatma ile ışıkla ağartma uzamış olmaktadır, yani daha uzun ışıkla ağartma izleri elde edilebilir. Ayrıca bir kare içinde birden fazla florofor ağartma olasılığını azaltmak için maruz kalma süresini en aza indirir. Önerilen ayarAndor iXon3 kamera için: kazanç 5.0 x, EM kazanç 999, 10 MHz okuma hızı, 50-100 msn maruz kalma süresi.
   4. , Aydınlatma deklanşörü kapatmak taze bir alana taşımak, aydınlatma kapağını açın ve tüm komplekslerin (bundan sonra img (x, y olarak anılacaktır)) ağartılmış kadar görüntü elde, lamel yüzeyinde odaklanın.
2. Aydınlatma düzensizliğini (Şekil 3B) için elde edilen görüntüleri düzeltin.
   1. Herhangi bir fluorofor çözeltisi hazırlayın, BRB-80, örneğin 1 uM Fluoresein izotiyosiyanat (FITC). Bu çözelti, önceden hazırlanmış parçalara ayrılmış ve -20 ° C'de saklanabilir
   2. Bölüm 7.1.1 deki gibi bir odasının birleştirin ama düzenli bir lamel kullanın. Fluorofor çözüm ekleyin ve valap kullanarak odasını sızdırmaz.
   3. > Tüm mikroskop alanında 50 görüntüleri toplayın: aydınlatma deklanşör kapalı iken yeni ağartılmamış alana sahneye taşımak ve hemen deklanşöre açtıktan sonra görüntü kazanır.
   4. (Şekil 3C) kullanılarak 5 piksel yarıçapı ile Gauss bulanıklığı filtre. Elde edilen görüntü alanına (x ve y koordinatları pikselin uygun Illum (x, y)) 'in aydınlatma yoğunluğu dağılımını temsil eder.
   5. Bu görüntünün (Max (Illum)) maksimum piksel parlaklığı belirler.
   6. Kapalı aydınlatma obtüratör ve 7.2.3 Edinme Bölüm gibi bir görüntüyü aynı kamera ayarlarını kullanarak, bu görüntünün ortalama piksel yoğunluğunu belirlemek, bu değer CN, kamera sesine karşılık gelir.
   7. Aşağıdaki ifade kullanılarak deney görseli (img (x, y)) normalleştirmek için, yukarıdaki değerleri ve görüntü (Illum (x, y)) kullanın:
      
      Bri kantitatif analiz için elde edilen görüntü img ^norm (x, y) kullanınucu-teyel kompleksleri (Şekil 3D) ile görüntüleri normalleştirmek için de sabit floresan kompleksleri, ve ghtness.
3. Tek bir floroforun şiddetini belirler.
   1. ^Norm (x, y) img normalize görüntüleri kullanarak ve herhangi bir görüntü işleme yazılımı dairesel bir bölgede (çapı 5-6 piksel) ile floresan nokta seçin ve tüm çerçeveler için onun ayrılmaz yoğunluğunu belirlemek, photobleaching izlerini üreten. Çok parlak noktalar (> sönük daha parlak 5 kat) kaçının.
   2. Aynı dairesel bölge aracını kullanarak, en az 3 nokta-özgür alanları seçmek ortalama gelen ışıkla izlerini oluşturmak ve üstel bozunma fonksiyonu ile uyum.
   3. Deneysel zaman noktaları maç ve photobleaching eğrileri onu çıkarmak için bu plan yoğunluk eğrisini tablolaştırıyoruz.
   4. Photobleaching eğrileri (3-5 puan kayar pencere ile ortalama) Pürüzsüz. Görme çıkan eğriler ve denetlemekfloresan veya belirgin beyazlatma (Şekil 3E) eksikliği ani bir artış gösterir herhangi bir eğriyi atın.
   5. (Eğrilerin toplam sayısı genellikle% 50-70) geri kalan eğrilerinin her biri için, görsel olarak floresan nokta ağartılmış olan son yayla seçin. Sadece ~ 100 puan bırakın ve bu yoğunlukları ortalama bu segmenti kısaltın. Küçük bir varyasyonu en aza indirmek için kısaltılmış ışıkla ağartma eğri arka plan düzeyleri bu değer çıkarma ve arka tepe (aşağıda) boyutunu azaltmak için.
   6. 20 veya daha fazla photobleaching eğriler (> 1.000 kez puan) tüm zaman noktalarında şiddetlerinin bir histogram çiziniz. Histogram, en azından 4 farklı tepe noktaları (Not 2 ye bakınız) göstermelidir.
   7. MATLAB, Mathematica veya benzer yazılım (Şekil 3F) kullanarak eşit Gauss dağılımı ^10,43 ile histogram Fit:
      
      wA _i ve σ _i, d ve N burada uydurma parametreleri vardır. _I genlik karşılık gelen ve genişlik i-th zirve A _i ve σ Parametreler d tepe arasındaki mesafedir; N dağılımında tepe noktalarının toplam sayısına karşılık gelen bir tam sayı olduğu. Ilk 3 veya daha fazla tepe merkezleri monte hattına görsel olarak iyi bir eşleşme göstermiştir, bu tepe noktalarının (parametre d) arasındaki mesafe, tek bir floroforun floresan yoğunluğuna karşılık gelir.
      Not 1: mikroskopi sistemi önemli titreşimleri sergileyen ya da gürültü (örneğin kararsız lazer ışını) başka bir kaynak varsa incelendiğinde nokta (Bölüm 7.3.6) sayısı artırılmalıdır.
      Not 2: Bu> eşit Gauss uyum ile doğru analiz için 3 zirveleri elde etmek esastır. Az zirveler elde ediyorsanız, yanlış (örneğin çift) adım büyüklüğü elde edilebiliraydınlatma koşulları uygun olmadığı zaman, noktalar çok hızlı ve tek adımları ağartmak örneğin çözülmez.
4. Ucu-izleme kompleksinin molekül büyüklüğünü belirleyin.
   1. Protokol 6 toplanan görüntüleri kullanın ve hemen deklanşöre açıldıktan sonra edinilen ilk 2-4 kareleri seçin. Uç-izleme gözlenmiştir önce alan bir süre aydınlatılmıştır, aynı deney koşulları altında, foto ağartıcı kinetikleri orijinal yoğunluğu tahmin ediyoruz.
   2. Seçilen kareleri ortalamasını ve Bölüm 7.2.5-7.2.7 olarak çıkan görüntü normalleştirmek.
   3. Bölüm 7.3.1 deki gibi aynı bölgenin boyutunu kullanarak floresan ucu izleme kompleksinin ayrılmaz yoğunluğunu ölçün.
   4. , Ucu izleme kompleksi yakınında bulunan ve aynı bölgeyi kullanan 3 plan alanlarının ayrılmaz yoğunluğunu ölçmek bu değerleri ortalama ve Bölüm 7.4.3 gelen uç-izleme kompleksinin yoğunluğu çıkarma.
   Bölüm 7.3.5 'de elde edilen bir fluorofor yoğunluğu ile Bölüm 7.4.4' de elde edilen floresan yoğunluğunu bölünmesiyle komplekse florofor molekül sayısını hesaplayın.
   Not 1: Bu protokol 7.4 için aydınlatma ve satın alma ayarları protokol 7.1 'de olduğu gibi aynı olması arzu edilir. Maruz kalma süresi ve lazer yoğunluk ya da bu aşamalar sırasında ayarlandı, elde edilen flüoresan değerleri buna göre ölçeklenmiştir olmalıdır. Bununla birlikte, bu ölçekleme doğruluğu bu farklı koşullar altında, aynı örnek (örneğin flüoresan süresi) görüntüleme ve elde edilen yoğunluklarının oranı hesaplanarak doğrulanmalıdır.

8. Protein Kaplı Boncuk tarafından mikrotübül İpucu izleme

1. Protokolü 6 olarak MT sökme tetikleyerek tip izleme boncuklar ile deneyler yürütmek. DIC, ışık kaynağının yoğunluğu ile aynı anda Rhodamine floresan görüntülenmesine izin düşürülmelidirDIC görüntüleme.
2. 10 ul / dk 'da odacık içine boncuk süspansiyonu 30-50 ul tanıtılması in Grishchuk et al. ¹⁰ ve Asbury et al. ¹¹ olarak boncuklar hazırlayın. Önerilen boncuk konsantrasyonu, 10 ^-16 -10 ^-17 M. olduğu
3. Dik bir mikroskop kullanıyorsanız, mikroskop sahneden bölmeyi kaldırmak ve boncuklar lamel de çöktürmek için izin 5-10 dakika için onu çevirin. Bu lamel gergin mikrotübüle kordonun iyi bir bağlayıcı teşvik, fakat bu prosedür, kısa bir süre içinde çok az ağırlık tabanlı bir sedimantasyon göstermektedir 0,5 um polistiren boncuklar, başarılı değildir.
4. Lamel-tethered mikrotübülün bağlı bir boncuk seçin, boncuk net bir yay ⁴⁴ (Şekil 4A) hareket etmelidir. Gergin boncuk 1-3 mikron uzaklıkta m kalır arada lamel bağlı boncuk nedeniyle açıkça görülebilir lamel yüzeyinden yer olmalıotionless.
5. Rodamin filtre küp geçmek ve DIC aydınlatma kullanırken görüntüleri toplamaya başlar.
6. Bir cıva lambasından veya 530-550 nm lazer ile (bir alan diyafram ile sınırlı) görüntüleme alanını aydınlatmak için açık deklanşör. Boncuk ayırır veya sökülmesi mikrotübül ucu ile hareket eder (Şekil 4D, 4F ve 4G) kadar kayıt devam ediyor.
   Not 1: Optik tuzak mikrotübül duvarı ve protein kaplı boncuk arasındaki etkileşimi teşvik etmek için kullanılabilir. Kinesin motorlar (Şekil 4E-G) ile kaplanmış boncuk ile çalışırken bu özellikle yararlıdır. Yukarıdaki gibi aynı protokolleri uygulayın fakat 2 mM Mg-ATP ile hareketlilik tampon ek. Adımında 8.3, 1.064 nm lazer ışını ile bir serbest yüzen boncuk yakalamak yakın kesimli mikrotübül duvara tuzağa boncuk getirmek için sahneye taşımak. Düşük ışık DIC ve Rhodamine filtre küp aracılığıyla görüntüleme başlar ve şapkalı mikrotübül sonuna doğru yürümeye başlamak için boncuk bekleyin. Kıçtaer yönettiği boncuk hareketi gözlenir, kiriş yakalama için deklanşöre kapatın ve floresan aydınlatma için kapağını açın. Boncuk ayırır veya sökmeden mikrotübül sonuna parçaları kadar kayıt devam ediyor.

Sonuçlar

Mikrotubulu depolymerizing izlemeyi Protein biter. Maya kinetochore bileşen Dam1 kadar depolymerizing mikrotübülün en uç-tracker ¹⁴ biter. GFP ile etiketlenmiş bu 10 alt birim kompleksi kolaylıkla ifade edilen ve bakteri hücrelerinin ^18,38 saflaştırılmıştır, bu nedenle uç izleme deneyi için pozitif bir kontrol olarak kullanılmasını tavsiye edilebilir. Bir mikrotübülün depolymerizing ucuyla izleyen bir floresan proteini sürekli lamel bağlı tohum (Video 3) doğru hare...

Tartışma

Birçok tek molekül tahliller günümüzde rutin büyük ölçüde non-spesifik protein yapışmasını azaltmak için özel olarak işlenmiş lamelleri kullanın. Biz burada açıklamak prosedür Howard laboratuarda ³² geliştirilen orijinal protokol bir değişiklik olduğunu ve lamelleri Silanizing bile floresan kullanmayın DIC-tabanlı boncuk deneyleri ile çabaya değer olduğunu bulmak. Bu tür lamelleri ile monte Chambers daha temiz yüzeyler göstermektedir, ve çözünür mikrotübül bağlama proteini varlığında elde edilen sonuçlar çok ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tablo 1. Mikroskopi ve diğer ekipmanlar.
Mikroskop	Zeiss Nikon	Axio Imager 2 Eclipse Ti	DIC ve epifloresan görüntüleme yapabilen diğer mikroskop modelleri kullanılabilir
Objektif	Zeiss Nikon	420490-9900-000 CFI Apo 100x Yağ 1.49	100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objektif ısıtıcı	Bioptechs	150803, 150819-19
Floresan filtre küpü	Chroma	49004 veya 49008 41017 veya 49020	Rhodamine floresan için optimize edilmiştir  GFP floresan için optimize edilmiştir
Edinme yazılımı	ücretsiz MicroManager Moleküler Cihazlar	uygulanamaz MetaMorph 7.5	http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ diğer yazılımlar görüntü elde etmek ve parçacık izleme
EMCCD kamerası	Andor	iXon3, DU-897E-cs0-#BV	Son derece hassas EMCCD kamera
Yakalama lazeri	IPG Fotonik	YLR-10-1064-LP	1.064 nm lazer, 10 W
Floresan uyarma lazerleri	Coherent, Inc. Coherent, Inc.	Safir 488 LP Safir 552 LP	yeşil floroforların uyarılması kırmızı floroforların uyarılması
Plazma Temizleyici	Harrick Plazma	PDC-001
Ticari akış odaları	Warner Instruments	RC-20 veya RC-30
Perfüzyon pompası	Cole Palmer Harvard Aparatı	Masterflex 77120-52 Pico Plus	Her iki pompa da gerekli sıvı akış hızını sağlar, ancak peristaltik bir pompa çok yavaş hızda titreyebilir. Bir şırınga pompası ile akış, çok çeşitli oranlar için daha tutarlıdır, ancak bu pompanın ataleti vardır.
Tablo 2. Mikroskopi odası hazırlığı.
Yeniden kullanılabilir odalar için modifiye mikroskop slaytları	Colorado'nun Hassas Cam Üflemesi	şemaları kullanarak slaytlarda özel sipariş www.precisionglassblowing.com Sonic yuvaları Şekil 1
Polietilen boru	Intramedic	427410	Kimlik 0.58 mm, OD 0.965 mm; Monte edilmiş hazneyi pompaya ve atık kabına bağlamak için bu tüpleri kullanın
Polietilen boru	Intramedic	427400	ID 0.28 mm, OD 0.61 mm; Yeniden kullanılabilir hazneyi yapmak için bu tüpleri kullanın
Düzenli mikroskop slaytları	VWR	48312-003	Diğer benzer slaytlar kullanılabilir
Lameller	VWR	48393-150, 48366-067	Diğer benzer lameller kullanılabilir
Silikon dolgu macunu	World Precision Instruments	KIT, SILIKON DOLGU MACUNU 5 DK KÜR
Epoksi yapıştırıcı	Loctite	83082
Siyanoakrilat yapıştırıcı	Scotch 3M	AD114	Veya diğer üreticilerin siyanoakrilat yapıştırıcısı
Tablo 3. Lamel temizleme ve kaplama.
Moleküler Elekler, Sınıf 564	Macron	4490-04
Kapak Camı Boyama Kavanozu	Ted Pella, Inc.	21036
Lamel Seramik Tutucu	Thomas Scientific	8542e40
PlusOne Repel Silan	GE Healthcare Biosciences	17-1332-01
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Anti-digoksigenin AB	Roche Uygulamalı Bilimler	11093274910
Tablo 4. Tohumların ve segmentli mikrotübüllerin hazırlanması.
	beyinlerinden saflaştırılmış tübül Cytoskeleton, Inc	T238P	Saflaştırma protokolleri için bakınız 49– 51 Etiketsiz domuz tübülini
Etiketli tübülin	Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen	TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin)	Rodamin etiketli domuz tübülini Tubulin, referansta olduğu gibi herhangi bir amin reaktif boya ile etiketlenebilir52.
GMPCPP	Jena Biosciences	NU-405	Aliquot ve -70 °C'de saklayın; C
VALAP	Vazelin, lanolin ve parafin kütlece 1: 1: 2'de	referansa bakınız9< / sup>