Yöntem makalesi

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

DOI:

10.3791/51164

⸱

19 Mayıs 2014

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry, and Pathology, Faculty of Medicine, Laval University, 2CHU de Quebec Research Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MRNA çevirisi hassas kontrolü, özellikle fizyolojik ve patolojik strese yanıt olarak, ökaryotik hücre homeostazı için temeldir. Bu programın değişiklikler kanser gelişimi arasında ayırt edici bir özelliği, ya da nörodejeneratif hastalıklarda görüldüğü gibi, prematüre hücre ölümüne hasarlı hücrelerin büyümesine yol açabilir. Translasyonel kontrol için moleküler temel ilişkin bilinenlerin çoğu bir yoğunluk gradyan ayırma sistemi kullanılarak Polizom analizinden elde edilmiştir. Bu teknik, bir doğrusal sakroz gradyanı üzerinde sitoplazmik özler ultrasantrifüj dayanır. Sıkma işlemi tamamlandıktan sonra, sistem, farklı çeviri tekabül eden santrifüj bölgelerinin ayırma ve böylece bir miktar Polizom profili ile sonuçlanan popülasyonları ribozom sağlar. Polisom profilde değişiklikler stres çeşitli tepki olarak meydana gelen çeviri başlatma değişiklikler veya kusurların göstergesidir. Bu teknik aynı zamanda inci değerlendirmek sağlar:e çeviri başlatma belirli proteinlerin rolü ve spesifik mRNA translasyon aktivitesini ölçmek için. Burada, normal ya da stres ya da büyüme koşulları altında, ökaryotik hücrelerin ve dokuların başlatılması için değerlendirmek amacıyla Polizom profilleri gerçekleştirmek için protokol açıklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik hücreler sürekli bir hızlı adaptif hücre yanıtı gerektiren zararlı fizyolojik ve çevresel stres koşulları bir dizi karşılaşma. Hücre stres yanıtı, anti-hayatta kalma ve pro-sağkalım etkili faktörler arasındaki hassas denge içerir. Bu dengeyi bozarak kanser ve nörodejeneratif hastalıklar gibi insan patolojilerin gelişimine öncülük geri dönülmez sonuçlar doğurabilir. Stres yanıtı ilk adımı sırasında, hücreler mRNA çeviri düzeyinde gen ekspresyonunda değişiklikler koordine kontrolü ile ilgili pro-hayatta kalma yolunu aktive edebilir.

ökaryotlarda mRNA çevirisi başlatma faktörleri (EIFS), spesifik RNA bağlayıcı protein (RBDS) ve RNA molekülleri 1 ila koordineli etkileşimleri içeren karmaşık hücresel bir süreçtir. başlatma, uzama ve sonlanma: mRNA çeviri üç ayrı evreye ayrılır. Her üç faz dede tabi olsa da,translasyonel kontrol mekanizmaları, böylece protein sentezi 2'nin oran-sınırlayıcı bir adım teşkil etmektedir çeviri çoğunlukla başlangıç ​​aşaması, hedef merciin düzenleyici mekanizmalar,.

Çeviri başlatma i ön başlatma kompleksinin oluşumuna yol açan, üçlü kompleks ve 40S ribozom alt birimine yönelik daha sonraki bağlanma Met eIF2a.GTP.Met-tRNA oluşumu ile başlayan bir çok düzenli bir süreçtir. Bir sonraki adım, eIF4F ve eIF3 gibi çeviri başlatma faktörlerinin aktivitesi içerir mRNA için preinitiation kompleksinin işe olan. Bu şekilde oluşturulan 48S preinitiation kompleksi AUG başlangıç ​​kodonunun tanıyıncaya kadar mRNA'nın 5'-ötelenmemiş bölge tarama başlatmak için bu makine sağlayacak özel yapısal değişikliklere uğrar. Çeviri başlangıç ​​faktörlerin çoğu daha sonra serbest bırakılır ve 60S alt birimleri bir 80S oluşturmak için işe alınırlar ribozom kompleksi çeviri, yetkili birt hangi nokta protein sentezi başlar (Şekil 1). Birden fazla 80S monosome sözde polisomlann (veya poliribozomların) üreten bir zamanda aynı mRNA'nın tercüme edilebilir. Bir mRNA üzerinde polizom yoğunluğu başlatma, sonlandırma ve uzama oranları yansıtır ve böylece, belirli bir transkriptin çevrilebilirlik bir ölçüsüdür. Bununla birlikte, polisom profili esas olarak başlangıç ​​aşamasında mRNA çevirisinde değişiklikleri değerlendirmek için kullanılır. Burada çeviri başlatma inhibitörü gibi bir proteazom önleyicisi kullandık. Bu ilaç kanser hücrelerinin tedavisi translasyon başlatma faktörü eIF2a 3 fosforile HRI adlı stres kinazın aktivasyonu ile karakterize edilen bir stres tepkisi oluşturur. EIF2a fosforilasyonu, memeli hücrelerinde 4 çeviri başlatma inhibisyonuna yol açan önemli olaylardan biridir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol kuralları takip Laval Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1.. Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Beyin Manipülasyon

  1. Memeli hücreleri ve Drosophila
    1. American Type Culture Collection tarafından tavsiye edilen, HeLa servikal kanser hücreleri ve Schneider Drosophila embriyonik hücreler büyür. Düşük bir geçit hücreleri ile çalışmak.
    2. % 80 izdiham Deneyin gün ulaşmak için Plaka hücreler. En iyi sonuçları elde etmek için, her bir deney için hücreler 12 x 10 ~ 6 kullanın. Polizom analizi için özler yapmadan önce, en az 90 dakika boyunca, taze tam orta ekleyerek çeviri uyarır.
  2. Beyin izolasyon: doğumdan sonra 9 ve 16 gün arasında değişen farelerin beyinleri kesin. Ötenazi anestezi ve servikal dislokasyon sonra CO 2 solumaktan içerir. Kurban sonra, bütün beyin ve iki yerde izole it -80 ° C ya da doğrudan doğruya hemen kullanım için soğuk PBS 1X içine aktarın.

2.. Yoğunluk hazırlanması Gradyan Bölünmesi Sistemi

  1. 5 dakika için% 0.1 SDS ile boru sistemi yıkayın.
  2. DEPC su ile yıkamadan önce, 5 dakika boyunca RNaseZAP Çözüm ile, daha sonra 5 dakika için% 70 etanol ile boru sistemi yıkayın.
  3. Aparatın boru sistemi kurutmak için hava pompası.

Sakroz Gradyanların 3. Hazırlanması

  1. 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.25 mM MgCI2, 150 mM NaCI, ve 1 mM DTT,% 15 ve% 55 sükroz cevap verir.
  2. Oluşturmak üreticinin talimatlarına göre tarif edildiği gibi, eski bir Isco Model 160 kullanarak lineer gradyan% 15-55 sukroz gradyanı. Bununla birlikte, bu geçişlerini kabarcıklar veya türbülanslar oluşmasını önlemek için de TRIS peristaltik pompa hızını kontrol etmek önemlidir. Kullanılana kadar 4 ° C'de gradyanlar tutun.
  3. Degrade yapımcısı programı çalıştığı süre boyunca, 4 ° C'ye ultrasantrifüjdeki serin

4. Hücre hazırlanması ve Fare Beyin özler

  1. Hücre ekstrelerinin hazırlanması
    1. Buz ve yıkama hücreleri üzerinde plaka (lar) soğuk PBS 1X ile 3x.
    2. Hasat hücreleri, pH 7.4, 1.25 mM MgCI2, 150 mM NaCI, 1 mM DTT,% 1 Nonidet P40, 5 U / ml RNase inhibitör, takviye edilmiş, 1 ml liziz tamponu (20 mM Tris-HCI (12 x 10 ~ 6) tam Mini EDTA'sız proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri ile birlikte), bir Eppendorf tüpüne transfer ve 1 cc U100 insülin şırınga 28 G 1/2 ile olanağına 15x geçirilerek iyice karıştırın. Hücre lizatı 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.
    3. 10X objektif kullanarak bir faz kontrast mikroskop ile gözleyerek hücre lizizi değerlendirmek için bir slayt üzerine hücre lisatı birkaç damla koyun. Sadece çekirdekleri görünür olmalıdır ve herhangi bir hücre zarları hücre lizizi görebilir doğrulayan olmalıdır. Bir kontrol olarak, gözlemlemekLizinlerle parçalanmayan hücreler.
    4. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 11,000 x g'de santrifüj ile hücre lizat açıklığa kavuşturulması ve poliribozomların içeren çözünebilir lizat tutun.
  2. Fare Beyin ekstrelerinin hazırlanması
    1. Liziz tamponu 2 ml buz gibi soğuk bir Dounce homojenizatör içinde 10 vuruş ile izole edilmiş bütün beyin (~ 500 mg) homojen ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 11,000 x g'de santrifüj ile Homojenat açıklamak
    2. % 50 sakroz yastığı üzerine elde edilen süpernatan yükleyin ve 4 ° C'de TH-641, bir ultra santrifüj rotor kullanılarak 200,000 xg'de 2 saat boyunca devam sedimantasyon
    3. Liziz tamponu içinde 1 ml poliribozomların içeren şeffaf pelet yeniden süspanse edin ve aşağı ve yukarı pipetlenerek ile iyice karıştırın. Geçişlerini üzerine yüklenmeden önce 30 dakika için buz üzerinde kalan süspansiyon olsun.

5.. Sakaroz Gradyanların ve Ultrasantrifügasyon üzerine ayıklar yükleniyor

  1. Konsantrasyonunu ölçmekBir spektrofotometre kullanılarak, sitoplazmik ekstre içinde mevcut RNA. Dikkatli ve yavaş yavaş% 15 ila% 55 sukroz gradyanı üzerine ~ ekstrenin 20 OD 260 adet yükleyin. Kullanılabilir alan 2-3 mm santrifüj sırasında tüpler taşan önlemek için borunun yüzeyinde olduğundan emin olun.
  2. 4 ° C'de TH-641, bir ultra santrifüj rotor kullanılarak 230,000 x g, 2 saat 30 dakika için ultra-santrifüj kullanarak gradyanlara santrifüj Santrifüj sona erdiğinde, tüpleri çıkarın ve geçişlerini rahatsız etmemek için dikkatli bir şekilde buz koyun.

Polisomlann profilleme için Sitoplazmik Ekstraktlarının 6. Fraksiyonu

  1. Üretici tarafından tarif edildiği gibi, (0.5 ml her biri) Otomatik Yoğunluk Fraksiyonu Sistemi sakaroz gradyanları yerleştirin ve fraksiyonların otomatik fraksiyonasyonu ve toplama ile devam edin.
  2. 254 nm'de absorbans sürekli olarak izlenmesi ile ayrı Eppendorf tüpleri içine her fraksiyonu (~ 500 | il) toplayın. Parall yılındagradyan ayrıştırma işleminin el, polyribosomal profil grafik kağıt üzerinde düzenleme olacaktır. Seçenek olarak ise, polisom profilinin bir elektronik satın için grafik kaydedicisinde bağlanmış bir veri toplama birimi kullanır.
  3. Her çalışma sonunda, kuru buz üzerinde toplanan Eppendorf şişesi aktarın. Şu anda, mağaza ya da -80 ° C'de kısımlar toplandı ve aşağıdaki gibi direkt protein-RNA kompleksleri hızlandırabilir.

7. Protein Ekstraksiyon ve Analiz

  1. Sukroz gradyanı her toplanan fraksiyon için,% 100 soğuk 2 hacim etanol ekleyin ve RNA-protein kompleksleri, -20 ° C sıcaklıkta gece boyunca çökelmeye sağlar.
  2. Santrifüj 4 ° C'de 20 dakika boyunca 11,000 x g, her bir RNA-protein çökelti daha sonra% 70 etanol ile yıkayın. Kuru ve (bkz. Şekil 2) özel antikorlar kullanılarak Batı beneği ile devam etmeden önce, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon çökelti.

8. RNA Ekstraksiyon ve Analysis

  1. Bölüm 7.1 olarak RNA-protein kompleksleri çöktürün. % 0.1 SDS ihtiva eden liziz tamponu içinde her bir RNA-protein çökeltisinin yeniden süspanse edin. Bir 55 ° C su banyosu içinde 30 dakika boyunca 2 mg / ml proteinaz K ile çökeltinin protein bileşeni Digest.
  2. ": Kloroform fenol", kloroform 2 birimleri ve 2 M NaOAc pH 4 0.1 hacim ve 20 dakika boyunca 4 ° C'de 10,000 x g'de santrifüj 1 hacim ekleyerek Çökeltinin RNA bileşenleri çıkarmak. Izopropanol içinde 1 hacim ve glikojen 0.2 ug / ul ekleyerek -20 ° C 'de bir gece boyunca, her numunenin edilen sulu fazdan Çökelti RNA. 4 ° C'de 10,000 x g'de 1 saat boyunca çökelti spin % 70 soğuk etanol ile RNA pelet yıkayın.
  3. RNAse içermeyen su, küçük bir hacim içine RNA topağı yeniden süspanse edin. Miktarını değerlendirmek ve kalite RNA spektrofotometre kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce belirtildiği gibi, polisom profil stres şartları altında için başlatma değişikliklerin analizi. 1. Daha önce çeviri başlatma komplekslerinin sıralı bir düzeneği içeren bir çok aşamalı bir süreçtir tarif edildiği gibi çeviri başlatma basitleştirilmiş bir görünüşüdür sağlar. Normal büyüme şartları altında, çeviri başlatma kompleksleri olan algılama Polizom profili tarafından bir aktif için başlatma (; İşlenmemiş Şekil 2) için kanıtlamak poliribozomların dönüştür...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sukroz dereceleri üzerinde Polizom profil analizi hücreler ya da dokulardan 9,11-14 izole polizom yoğunluğu analiz ederek çeviri başlangıç ​​ölçümünü sağlar. Bu teknik, en iyi yaklaşım (değil benzersiz ise) in vivo çeviri inisiyasyon ölçmek için. Bu, hücre döngüsü boyunca 15 hücrelerinin büyüyen translasyonel durumunu izlemek için ve çeviri başlatma üzerinde, viral enfeksiyonlar, hipoksi 13,16, radyasyon 17 ve kimyasal ilaçlar terapide kullanılan 18 de dahi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PA Laval Üniversitesi Tıp Fakültesi bursu "Pierre Durand" bir alıcı. Bu çalışma Polizom parçalama RMR M yeni CIHR araştırmacı maaş ödülü tutar için inovasyon hibe Kanadalı Vakfı (MOP-GF091050) yoluyla elde edilmiş RM Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (MOP-CG095386) tarafından desteklenmiştir.

Biz Dr minnettarız. Yararlı tavsiyeler E. Khancıyan, I. Gallouzi, S. Di-Marco ve A. Cammas.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücreler
HeLa rahim ağzı kanseri hücreleriAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (Manassas, VA; ATCC)CCL-2
Schneider Drosophila embriyonik hücrelerAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (Manassas, VA; ATCC)CRL-1963
Kültür ortamı ve Takviyeler
Schneider' s Drosophila OrtaSigma-AldrichSO146-500ml 
DMEMYaşam teknolojileri11995-073 
FBSFisher Bilim Adamı Bilim İnsanıSH30396-03 
Penisilin / streptomisinYaşam teknolojileri15140122
Sükroz çözeltileri
D-sükrozFisher Bilim AdamıBP220-212 
GliserolSigma-Aldrich49767 
Bromofenol mavisiFisher Bilim AdamıB3925
Lizis tamponu
Tris HClFisher Bilim AdamıBP153-500
MgCl2Sigma-AldrichM2670-100G
NaClTekniscience3624-05 
DTTSigma-AldrichD 9779 
Nonidet P40 (Igepal CA-630)MJS Biolynx19628 
SDSTeknibilim4095-02 
RNase inhibitörü (RnaseOUT Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörü)Yaşam teknolojileri10777-019ve nbsp;
Antiproteazlar (tam, mini, EDTA içermez)Roche11,836,170,001 
RNA Ekstraksiyon
Proteinaz KLife teknolojileriAM2542 
Fenol: kloroformFisher Bilim AdamıBP1754I-400 
KloroformFisher Bilim AdamıC298-500 
GlikojenYaşam teknolojileri10814-010 
İzopropanolAkros organikler327270010 
Antikorlar
anti-FMRP antikoruFournier et al., Cancer Cell International, 2010 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
  2. Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
  3. Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
  4. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
  5. Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
  6. Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
  7. Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).
  8. Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
  9. Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  10. Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
  11. Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
  12. Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
  13. Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
  14. Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
  15. Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
  16. Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
  17. Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).
  18. Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
  19. Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
  20. Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
  21. Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
  22. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
  23. Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
  24. Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).
  25. Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
  26. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  27. Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

S kroz GradyanUltrasantrif jasyonWestern Blot AnaliziSitoplazmik EkstraktlarRibozomal FraksiyonlarOtomatik FraksiyonlamaRNA Presipitasyonu

İlgili makaleler