Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon

11.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51192

⸱

16 Mayıs 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

DNabT hücreleri periferal T-hücreleri arasında nadirdir; Bununla birlikte, belli olmayan lenfoid dokuda bol miktarda bulunmaktadır. Non-lenfoid doku DN T hücrelerini izole Zorluk patofizyolojik önemini kabul kapasitelerine rağmen fonksiyonel analizini engellemektedir. Bu murin böbreğinden yüksek derecede arıtılmış DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir protokol açıklar.

Özet

Lenfoid olmayan dokulardan DN T hücrelerinin izole edilmesi için standart bir protokol, çeşitli immün yanıtların onların daha çok rapor katılımı rağmen bulunmamaktadır. DN T hücreleri Allotransplantlar 1-6 bağışıklık ve oto-bağışıklık yanıtlarını ve tolerans düzenlenmesinde implike edilmiştir özel bir immün hücre türüdür. DN T-hücreleri, periferik kan ve sekonder lemfoid organlarda (dalak ve lenf düğümleri) nadir, ancak, fakat normal böbrekte önemli sakinleri vardır. Çok az nedeniyle çevrede kendi azlığı onların patofizyolojik işlevi 7 hakkında bilinmektedir. Biz son zamanlarda sürekli halde ve iskemi reperfüzyon yaralanması esnasında böbrek 8'de bu nüfusun kapsamlı bir fenotipik ve fonksiyonel analiz nitelendirdi. DN T hücresi işlevinin analizi büyük ölçüde böbrek kendi izolasyon için bir protokol geliştirilerek artırılacaktır.

Burada, biz isolatio sağlayan bir roman protokol açıklarMurin böbrekten oldukça saf ab CD4 + CD8 + T hücreleri ve T hücre DN n. Kısaca, biz kollajenaz kullanılarak böbrek doku sindirmek ve yoğunluk gradyanı ile böbrek mononükleer hücreleri (KMNC) izole. Bu KMNC den% 70 'den% 3 hematopoietik T hücreleri zenginleştirmek için iki aşama takip eder. İlk adım, CD45 + izolasyon kiti kullanılarak hematopoietik hücrelerin pozitif seçim oluşur. İkinci aşamada, DN T hücreleri negatif CD4, CD8 ve MHC sınıf II monoklonal antikorlar ve CD1d α-GalCer tetramer kullanılarak olmayan arzu edilen hücreler ayrılmasıyla izole edilmektedir. Bu strateji,% 90'dan fazla saf DN T hücre popülasyonu yol açar. , FACS analizi ile, ardından yukarıda belirtilen antikorlar ile lekeleme yüzey saflığını teyit etmek için kullanılır.

Giriş

Periferik αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - double-negatif (DN) T hücreleri fenotip ve işlevlerini 1-4 sahip çeşitli tiplerin ayrılır. DN T hücreleri, tam olarak anlaşılamamıştır, fakat çok daha farklı hastalık modellerinde 4-6 patofizyolojik bağışıklık tepkilerine dahil edilmektedir.

DN T hücrelerinin artan çeşitli bağışıklık ve oto-bağışıklık tepkilerinin düzenlenmesi ve allotransplant tolerans modülasyonunda rol benzersiz bir bağışıklık hücresi bir türüdür. 4-6, 9 Bunlar dalak ve lenf düğümleri (periferal kan ve sekonder lemfoid organlarda nadirdir .) Ancak, normal böbrek ve bağırsak epitel 10-12 önemli sakinleri vardır. Çok az kararlı halde böbrekte işlevlerine yaklaşık 7 ve böbrek transpl ile bağlantılı akut böbrek hasarı (AKI) gibi patolojik koşullar altında bilinirkarınca.

Çünkü her oyuncunun rolünü tanımlayan, alloresponses de dahil olmak üzere bağışıklık tepkilerini düzenleyen farklı bağışıklık hücrelerinin karmaşık rolleri alloresponses anlamak ve yeni terapötik tasarımı önemlidir. Ve fizyolojik koşullar altında, farklı hastalık, böbrekte bulunan DN T hücrelerinin önemli sayıda göz önüne alındığında, DN T hücreleri transplant alıcılarında kritik farelerde ve insanlarda bağışıklık ve oto-bağışıklık tepkileri düzenlenmesinde bir rol oynayabilir ve alloresponses muhtemeldir. Hala dağınık delil olsa Biriken hem patojenik ve bağışıklık fonksiyonları DN T hücrelerini implicates ama neden ve nasıl belli bir zararlı ya da baskılayıcı fonksiyonunu sergilemek ve çevre onları nasıl etkilediğini de anlaşılamamıştır.

Nedeniyle böbrekte düşük bolluğu nedeniyle, izolasyon geliştirilmiş yöntemler gerekmektedir.

T DN T hücrelerinin izole edilmesi için standart bir protokol bulunmamaktadıro non-lenfoid dokular. Bizim protokol böbrekten DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir yöntem tarif eder; Bununla birlikte, yöntem, aynı zamanda, çeşitli lenfoid olmayan dokular için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Araçların hazırlanması, Kültür Medya ve Reaktifler

  1. Araçlar: steril koşullar altında reaktifler hazırlamak ve bir laminar akış başlığı altında kullanmak.
  2. Fetal sığır serumu% 5, bikarbonat, 2.1 g, 10 ml 100 x glutamat, HEPES, 10 mg, 1 mg sodyum piruvat ve 10 ml 100 x penisilin / streptomisin eklemek, RPMI doku kültür ortamı 1 L hazırlayın.
    Not: Önerilen doku kültür ortamı, RPMI, DMEM ile değiştirilebilir.
  3. % 5 kolajenaz "D" çözeltisi (doku kültürü ortamında 9 ml kolajenaz "D" 5 ml) hazırlayın.
  4. % 100,% 80 ve% 40: Üç farklı konsantrasyonlarda Percoll çözeltisi olun. Şu konsantrasyonlar 1 numune için hesaplanır. Oda sıcaklığında çözümler tutun.
    1. Percoll çözeltisi (stok çözeltiden) seyreltilmemiş Percoll 9 ml ekleyin; PBS 10x 1 ml ekleyin.
    2. Percoll çözeltisi:; Percoll 8 ml% 100 eklemek PBS 1x 2 ml ekleyin.
    3. Perkol çözüm:Percoll% 80 4 ml; 1x PBS içinde 4 ml.
  5. (FACS) tampon sıralama floresan-aktive edilmiş hücre için 1 L olun; 5 ml% 10 BSA (% 0.1 BSA), 1 ml% 10 sodyum azid (0.1%), 2 ml EDTA maddesi, 1 x PBS ile 1000 ml'ye ekleyin.

Böbrek sindirim 2. Hazırlanması

  1. , Gerekli kurumsal onayı edinilen standart yöntemlerle fareler kurban ve asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​ve mevcut yönetmelik ve hayvan bakım yönergeleri izleyerek olması.
    1. Pentobarbital (0.07 mg / kg) ile fare anestezisi.
    2. Kansızlaştırma geçin.
    3. Bir cerrahi masaya yatar pozisyonda fare yerleştirin.
    4. % 70 etanol ile karın bölgesinde püskürtün.
  2. Petri kabına kollajenaz D çözeltisinin 10 ml ilave edilir.
  3. Çıkarın ve her fareden her ikisi de böbrek açarlar.
    1. Için sternum karın derisi ve karın zarı aracılığıyla bir orta hat kesi yaparak üşüme boşluğu açınpubis.
    2. Tarafına lateral olarak bağırsak hareket ile sol böbrek Açığa.
    3. Dikkatlice forseps ile sol kapsülü ayrı.
      Not: Kapsül böbrek çevreleyen şeffaf bir katman olarak görünür ve kısmen perinefrik adipoz doku ile kaplı.
    4. Bir cerrahi makas kullanarak pedikül damarlarını keserek sol böbrek çıkarın.
    5. Sağ böbrek için aynı işlemi tekrarlayın.
      Not: sağ böbrek daha kranial ve orta hat (pedicels kısa olan) daha yakındır.
  4. Petri kabı içine böbrek yerleştirin.
  5. Normal bir metal şekillendirme bıçağı kullanılarak küçük parçalar halinde böbrek doku (boyut olarak 1-2 mm) kesme ve (Şekil 1) 37 ° C kuluçka makinesi içinde 30-45 dakika boyunca kolajenaz çözeltisi içine parçaları yerleştirin.

Böbrek sindirimden Böbrek Mononükleer Hücreleri (KMNC) 3 eklenmiştir. Hazırlanması

  1. Böbreğin, bir hücre süspansiyonu elde edilirmekanik olarak doku kültürü ortamı içinde 25 ml bir süzgeç (70 um) ve tekrar süspansiyon ile karıştırın doku bozarak sindirim.
  2. Hücre süspansiyonu topak haline 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
  3. Çok yavaş ve dikkatli bir şekilde% 40 Percoll çözeltisi 4 ml pelet yeniden askıya ve yavaşça bir transfer plastik bir pipet ile% 80 Percoll çözeltisi üzerine 4 ml kaplar. Bu açıkça bir saydam tabaka ile birbirinden ayrılmış iki aşamada neden olur. Bunun üzerine lipidler tekabül eden san bir tabaka olacaktır.
  4. Fren kapalı modunda santrifüj ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin.
  5. Aspirasyon ile sarı ve kalın üst tabakası (yaklaşık 1-2 ml) sökün.
  6. Bir transfer pipeti ile iki fazın arayüzünden hafif beyazımsı saydam tabaka toplayın. Çok dikkatli doku kültür ortamı ihtiva eden 2 ml, 15 ml konik bir tüp içine aktarmak ve bu süspansiyon daha sonra bir toplam hacmin orta bölgesinin 13 ml ekleyin15 mi.
  7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje
  8. Ortamın 1 ml numune yeniden süspanse edin.
  9. Bir menositometrede mavisi ile dışlama kullanarak KMNC sayısını saymak ve Böbrek başına ml başına KMNC numaraları gibi sonuçları ifade eder.
  10. Bir kez yukarıdaki gibi yıkayın.

KMNC 4. Hematopoetik İzolasyonu (CD45 +) Hücreler (Aşama I)

  1. Çalışan tampon 90 ul içine 10 7 hücreleri yeniden süspanse.
  2. CD45 mikro-10 ul ilave edin ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe
  3. Reaksiyonu durdurmak için çalışan tampon 1 ml ilave edilir. Çalışan tampon 500 ul, 4 ° C ve tekrar süspansiyon 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
  4. Mıknatıslarında yerleştirerek manyetik sütun hazırlayın ve çalışan tampon içinde 3 ml ile yıkayın.
  5. Manyetik kolonundan hücre süspansiyonu geçmek ve sütundan geçer etiketlenmemiş hücreleri toplamak.
  6. Runn 3 ml hücreler üç kez yıkayıntampon ing. Daha sonra çıkış maddesinin toplar.
  7. Ayırıcı ve pipet sütunlar üzerine çalışan tampon 5 ml sütun çıkarın ve hemen etiketli kısmını dışarı floş. Bu fraksiyon, CD45 + hücreleri içerir. Hücreleri saymak.
  8. Böbrekler, farklı T-hücreleri alt-mutlak sayısını hesaplamak için akış sitometrisi ile pozitif hücrelerin yüzdesi (Şekil 2) ile KMNC toplam sayısı çarpın.

Negatif Seçim ile CD45 + Hazırlık DN T Cell 5. İzolasyonu (Aşama II)

  1. Aşağıdaki biyotinile edilmiş antikorların her biri 2.5 ul (0.5 mg / ml, 1.25 ug) ekleyin, anti-CD4, anti-CD8, anti-Fc reseptörü (CD16/32), anti-MHC class II (IA b), anti- Her 10 7 hematopoietik hücreler için CD1d PBS-57 tetramer.
  2. Soğuk bir odada 30 dakika boyunca inkübe hücreleri.
  3. 1 ml anti-Biotin, mikro-boncuklar ekleyin.
  4. Soğuk bir odada 30 dakika boyunca inkübe edin.
  5. T tüpü yerleştirinO mıknatıs ve tükenmesi geçin.
  6. Bir hemasitometre kullanarak negatif fraksiyonunda DN T hücrelerinin toplam sayısını belirlemek için canlı hücreler sayılır.
  7. Ilk kapısı CD45 +, ikinci kapısı TCRαβ +: Bu yolluk strateji izleyerek akış sitometri ile DN T hücrelerinin saflığını kontrol edin. CD1d + hücreleri hariç. CD8 + vs arsa CD4 + T hücrelerini DN (Şekil 3) tespit etmek.
  8. Saflık yüzdesi ile belirlenen toplam sayısı çarpın.
    Not:% 90'dan fazla saf DN T hücre popülasyonu içinde bu protokol kullanılması,.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yabani tip C57BL / 6 (B6), böbrek böbrek başına yaklaşık 1.5-2.1 x 10 6 mononükleer hücreleri içerir. Yaklaşık olarak en fazla% 10 CD45 + hematopoietik hücrelerdir. % 5 kolajenaz ile sindirme ile ve ardından, Şekil 1'de gösterildiği gibi böbrek tek çekirdekli hücreleri (KMNC) hazırlanması için, böbrekler küçük parçalar halinde kesilir.

Bu KMNC tabakası (Şekil 2, sol panel) toplamak için, bir yoğunluk gradyan santrifüj gerçekleştiril...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu tür otoimmün hastalıklar, kanser, graft tolerans ve akut böbrek hasarı (AKI) da dahil olmak üzere böbrek hastalıkları, birincil olarak farklı patolojik koşullarda karıştıktan çünkü DN T hücrelerinde artan bir ilgi vardır, 8, 13, glomerülonefrit. Bu nedenle, daha iyi bir DN T hücrelerinin patofizyolojik fonksiyonları ve karakterize etmek için bir ihtiyaç vardır. Ancak, şu anda CD4 ve CD8 T hücreleri ile karşılaştırıldığında, bu hücrelerin fonksiyonu içinde anlayışında bir eksikliği vardır. Önemli bir neden,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH PBS (R21 AI095484) tarafından desteklenmektedir. Biz CD1d tetramerin NHI tetramerdir çekirdek tesis ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Laminer akış başlığı Baker Company, IncVeya eşdeğer ekipman 
SantrifüjBeckman CoulterVeya eşdeğeri ekipman 
Hemositometre ElektronMikroskobu Bilimleri63514-11
Atmosfer kontrollü inkübatörFisher Scientific ( 37 & derece; % 5 CO2< / sub>)
ile C Analitik akış sitometresiLSR II
RPMI 1640Media Tech10-040-CV
Kollajenaz DRoche 11088858001
Percoll ve nbsp;GE Healthcare17-0891-01
Fetal sığır serumu Corning Cellgro35-011-CV
%0.1 sodyum azid (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Tampon fosfat tamponlu salin (PBS)Corning Cellgro21-040-CV
PBS 10xMediatech46-013-CM
EDTA tamponu Sigma-AldrichE1161
LS sütunları MiltenyiBiotec130-042-401
CD45+ mikro boncuklarMiltenyiBiotec6.78E-51
Biotin mikro boncuklar MiltenyiBiotec130-090-485
anti-CD45 (klon: 30-F11)  PerCP eBioscienceG1397
anti-CD45 (klon: 30-F11)  APC-Cy7Biolegend103116
anti-TCR Pasifik Mavisi  (ab zinciri, klon: H57-597)InvitrogenHM3628
anti-CD4 PEeBioscience12-0043
anti-CD8FITC eBioscience8011-0087
anti-CD4 biyotinile (GK1.5)BD553728
anti-CD8 biyotinile ve nbsp; (Klon 53-6.7)BD553029
anti-MHC sınıf II (I-A b) biyotinileBD553609
AutoMACS Çalıştırma Tamponu - MACS Ayırma Tamponu MIlteny I Biotec130-091-221
C57BL/6J farelerJackson Labs000664Böbrekler - Lenf Düğümleri
Petri kabı BD Biyolojik Bilimler356517
70 & # 956; M filtresi Fisher Scientific22363548
Piston Veya eşdeğer ekipman 
GeneMate Tüpler 50 mlBioexpressC-3394-3Veya eşdeğer ekipman 
GeneMate Tüpler 15 mlBioexpressC-3394-1Veya eşdeğer ekipman 
CD1d α-galser tetramerNHI

Kaynaklar

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

Etiketler

Böbrek Mononükleer HücreleriKollajenaz SindirimiYoğunluk Gradyanı SantrifügasyonuCD45 Pozitif SeçimiNegatif SeçimAkış Sitometrik AnalizManyetik Boncukla AyırmaHematopoetik Hücre ZenginleştirmeMurin Böbrek İzolasyonu
Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.