Stres granüller (SGS) takılmıştır ribonükleoprotein parçacıklar (RNP) ve çeşitli gerilimlere, hücresel yanıt olarak önemli sitoplazmik RNA ihtiva eden granüller bulunmaktadır. SG-Dinamiği stresten sonra transfekte primer hücrelerde SGS etiketli bileşeninin lokalizasyonu görselleştirerek canlı hücrelerde takip edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme
Bu makalede
Özet
Özet
SGS spesifik protein bileşenlerinin ya da poli A + mRNA immuno hücrelerinde görselleştirilebilir. SGS son derece dinamik ve bunların montaj ve kader çalışma stres hücresel yanıtı anlamak önemlidir. G3BP (RasGAP SH3 alanı Binding Protein) gibi SGS önemli faktörler eksikliği fareler ve Merkezi Sinir Sistemi değişiklikler gelişim kusurlarına yol açar. Bir organizmanın, bir kutu kültürü birincil hücrelerden hücrelerde SG-dinamiklerini incelemek ve SGS transfekte etiketli bileşenin lokalizasyonu izleyin. Biz Fare Embriyonik Fibroblastlar G3BP1 içeren SGS (MEF'ler) gözlemlemek için time-lapse deneyi tarif. Bu teknik aynı zamanda, yakın zamanda, bu SGS Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı oluşan göstermiştir gibi önemli olan, canlı nöronlar G3BP içeren SGS incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, başka bir hücre gövdesi ve granül protein bileşeni üzere uyarlanmış ve yapılabilirtransgenik hayvanlar, bu granüller belirli bir faktör yokluğunda, örneğin granüller dinamiklerinin canlı bir çalışma sağlar.
Giriş
Stres granüller (SGS) gibi yüksek bir sıcaklıkta, oksidatif stres, hipoksi, ozmotik şok, UV ışınlama, glikoz yoksunluğu, ya da viral enfeksiyon 1. çevresel strese, bir hücre koruyucu bir cevap olarak meydana olmayan zar sitoplazmik odak noktasıdır. Bu, oksidatif stres tetikler sodyum arsenit gibi bileşikler ile muamele ile kimyasal olarak indüklenebilir. SGS durdu çeviri tutuklandı haberci ribonükleoprotein (mRNPs) birikir öteleme makine gelen mRNA'larını kenetleyerek, 2 kompleksleri ve bunların montaj eIF2α fosforlaştırılmasına (ökaryotik başlatma faktörü 2 α) tarafından tetiklenebilir. SGS P-organları gibi polisomlar ve diğer tanecikler il....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol tüm hayvan prosedürleri 24 Kasım 1986 (86-609/EEC) Avrupa Topluluğu Konsey Direktifi kurallarına sıkı sıkıya bağlı bulunmaktadır. Yiyecek ve su ad libitum izin grubundaki fareler Evi. 12 saat ışık: karanlık döngüsü (7:00 ışık) bir 12 saat, kontrollü bir ortamda (22 ± 1 ° C,% 55 ± 5 nem) onları korumak.
1 Murin Primer Hücre Kültürü:. Fare Embriyonik Fibroblastlar (MEF'ler)
- Ince forseps gibi kavisli bir forseps ve diseksiyon makas otoklavlayın. Steril bir kapta saklayın. Steril D-PBS (Dulbecco'nun Fosfat-Tamponlu Tuzu) kullanınız. Tam MEF'ler orta hazırlayın:% 10 fetal dana serumu (FBS), 1 mM L-gl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Stres granül oluşumu stres apoptozun önlenmesi ile ilişkili, temizlendikten kadar durmuş çeviri hücresel adaptasyon izin, strese hücre yanıt olarak önemlidir. Bu tahlil izin anahtar SGS protein bileşenlerinin lokalizasyonu (Şekil 1) takip ederek, primer hücrelerde SGS çalışma. G3BP, SGS tertibatının önemli bir faktör, kültürlü MEF'ler veya nöronların (Şekil 2A, ve c) sitoplazmasında oldukça dağılmak mevcut olduğu, ve açık bir şekilde MEF'ler içerisinde arsenit t.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protokol endişe transfesktiyonu ve dikkatle sitotoksisite aşağı düşürmek için kontrol edilmesi gereken daha özel zaman atlamalı satın almalar, en kritik adımlar.
Primer hücre kültürü sürece steril koşullarda muhafaza edilir ve dikkatli diseksiyon ve hücre ayrışma adımları sırasında zarar görmesini önlemek için alınır gibi, zor bir parçası değildir. MEF'ler erken pasajlara donmuş muhafaza edilebilir. Kalsiyum fosfat ile transfeksiyon iyi Neuron 21, çalışması için gösterilmiştir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Yazarlar satın almalar yapıldı Montpellier Rio Görüntüleme (MRG) platformu kabul etmek istiyorum. Onlar protokol farklı yerlerinde kendi yardım için Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot ve Virginie GEORGET teşekkür ederim. Bu çalışma la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745) Fondation tarafından dökün desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | 37 °C'de ön ısıtma; C |
| Sodyum piruvat | Gibco | 11360 | |
| Esansiyel olmayan amino asitler | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| Tripsin | Gibco | 15096 | |
| Cam alt B-35 | Greiner | 627860 / 627861 | Tedavi edilmiş veya edilmemiş (tedavi edilmiş: yapışan hücrelerin bağlanmasını arttırır) |
| Poli-L-lizin | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | 37 °C'de ön ısıtma; C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobazal | Gibco | 21103 | 37 ° C'de ön ısıtma; C |
| 2-merkaptoetanol | Gibco | 31350 | |
| Forseps | Biotek | DU-110-A | Çok ince, uçlar 0,1 mm (meninksleri çıkarmak için kullanışlıdır) |
| Kavisli forseps | Biotek | P-110-BUF | Çok ince, uçlar 0,1 mm |
| Küçük makas | Biotek | CM-85-BS | Hipokampi çıkarmak için yararlı olabilir |
| Polyplus transfeksiyon JetPEI reaktifi | Ozyme | 101-10 | MEF transfeksiyonu, ileri protokolü takip |
| edin Ters lazer taramalı konfokal mikroskop | Leica | SP5 |
Kaynaklar
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and trans....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
