Bir yumurta-in-solucan (EIW) testi yumurtlama davranışı ölçmek için yararlı bir yöntemdir. Yumurtlama değişiklikler model organizma bir davranış tepki olabilir<em> Caenorhabditis elegans</em> Bu patojen bakteriler tarafından üretilen gibi zararlı çevresel maddelere.
C. elegans yumurta döşeme davranış, osmolaritesi 1 ve titreşim 2 gibi çevresel ipuçları etkilenir. Gıda C. toplam yokluğunda elegans da yumurta döşeme ateşkes ve rahim 3 döllenmiş yumurta korumak. Ancak, özellikle farklı gıda kaynakları, özellikle patojen bakteri ve yumurta döşeme davranış Enterococcus faecalis, etkisi iyi karakterize değildir. Yumurta-in-solucan (EIW) testi bu durumda E'de, bakteri farklı etkilerini ölçmek için bir araçtır faecalis, yumurta döşeme davranış.
EIW deneyleri C rahim korudu yumurta sayısı, sayım içerir elegans 4. EIW testi sahnelenen ağartma, gebe yetişkin C. içerir elegans manikür kaldırmak ve hayvan muhafaza yumurta ayırmak için. Önce beyazlatma için, solucan bakteri (veya çevresel işaret her türlü maruz kalan) Zaman belirli bir süre için. Ağartma sonra, bir çok kolay solucanlar rahim içinde muhafaza yumurta sayısını yapabiliyor. E. sonra yumurta tutma Bu deneyde, ölçülebilir bir artış faecalis maruz kolaylıkla ölçülebilir. EIW tahlil patojenik bakteri veya çevresel toksinler varlığı açısından taranması için kullanılabilecek bir davranış deneyidir. Buna ek olarak, EIW testi yumurta döşeme davranış, serotonin ve asetilkolin 5-9 gibi nörotransmitterlerin tarafından modüle olduğu için sinyalizasyon nörotransmitter etkileyen ilaçlar için ekrana bir araç olabilir.
Caenorhabditis elegans, mikroskobik, serbest yaşayan yuvarlak kurt, geleneksel olarak insanlara nedeniyle şeffaf anatomi, iyi karakterize geliştirme, tam sıralı genom, kısa nesil zamanlı ve genetik homoloji gelişim ve hücre sinyal süreçleri incelemek için kullanılan bir model organizmadır . Daha yakın zamanda, C. elegans çevresel toksikoloji ve doğuştan gelen bağışıklık 10, 11 alanında bir model organizma haline gelmiştir.
Bu kendi kendine gübreleme hermaphroditic solucanlar yumurtadan çıkım iki-üç gün içinde cinsel olgun olur. Yaşam döngüsü, C. sırasında elegans yetişkinliğe ulaşmadan önce, dört larva aşamaları (L1-L4) geçer. Bir izole hermafrodit tepe verimlilik üç gün içinde, ortalama, 300 yavru üretebilir. Üreme olgun C. elegans çift cinsiyetli, döllenmiş yumurta koydu önce birkaç saat boyunca rahim içinde korunur.Herhangi bir anda, rahim içinde depolanan yumurta normal sayıda (en yüksek verimlilik esnasında) on ila onbeş 12'dir. Rahim yumurta sayısı yumurta üretimi oranı ve yumurtlama oranını hem de bir fonksiyonudur. Döllenmiş yumurta vulva 13 açılış etrafında düzenlenmiş on altı vulva kasların kasılması ile rahim kesilir. Hermafrodit özel nörotoksinlerini (HSN) 'ın ve dolayısıyla VC nörotoksinlerini kas kasılması etkileyen vulva kasları üzerine sinaps ve yumurtlama davranışı 5,7,13,14. Rahim yumurta ihraç nöronlar ve kasların koordine aktivite nedeniyle oluşur.
C. Laboratuar kültürleri elegans genellikle patojen olmayan Escherichia coli OP50 bir diyet yetiştirilir. Doğal ortamda, C. elegans gibi patojen bakteriler gibi gıda kaynakları, çeşitli temas, potansiyel olarak zararlı olabilir. Zararlı maddelere maruz kaldığındaçevre, C. çevreye daha elverişli hale gelinceye kadar elegans yumurta saklayın. Muhtemelen bu yumurta tutma onların soyu korumak için bir çabadır.
Solucan (EIW) testi, C bu yumurta elegans, potansiyel olarak patojenik bakteriler, ortamda bulunan Enterococcus faecalis, maruz kalmaktadır. E. patojenik biçimlerine maruz faecalis C. kalıcı bağırsak enfeksiyonu ve hatta ölüme neden olabilir elegans 15. Patojenik bakterilerin diğer formlarına maruz kalma yumurta tutma 16,17 etkilediği gösterilmiştir, bununla birlikte etki miktarı değildi. E. Buna ek olarak, hafif patojenik etkisini suşları faecalis, yumurta döşeme davranış, hemen öldürücü olmayan suşları çalışılmamıştır.
EIW deneyleri C rahim korudu yumurta sayısı, sayım içerir elegans 4. Olsa ° C. eleganssaydam, rahim içinde biriken yumurta bozulmamış bir hayvanda ölçmek için zor olabilir. EIW testi gebe yetişkin C. beyazlatma içerir zaman sabit bir süre için bakterilere maruz bırakıldı elegans. Çamaşır suyu solüsyonu geride bırakarak yumurta dış kütikül çözünür. Yumurta kabuğu koruyucu bir varlığı nedeniyle ağartıcı etkilerine refraktif vardır. Ağartma sonra, bir çok kolay beyazlatma üzerine solucanlar rahim salınan yumurta sayısını yapabiliyor.
Bu deney, bir anda rahim içinde yumurtaların sayısını ölçmek için basit, ucuz ve hızlı bir yöntemdir, ve böylece E. etkilerini ölçmek yumurta tutma üzerinde faecalis. Bu testte yumurta tutma bakteri, çevresel toksinler veya ilaç diğer türleri etkisini ölçmek için kullanılabilir. Bu deney aynı zamanda bakteriyel patojen için bir ekran olarak kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir.
Nematod Büyüme Medya 1) hazırlanması (NGM)
B Broth E. 2) hazırlanması coli Medya
3) Tohumlama C. elegans Bakım Tabaklar
4) C. bakımı elegans Suşlarının
Triptik soya ağarı (TSA) E. 5) hazırlanması faecalis Kültür Medya
Tryptic Soy Broth (TSB) E. 6) hazırlanması faecalis Kültür Medya
7) E. için Streptomisin ile Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) Medya, hazırlanması, faecalis Kültür
8) E. bakımı faecalis suşları
9) E. hazırlanması EIW Testi için faecalis Plakalar
10) E. hazırlanması EIW Testi (Kontrol Levhalar) için coli Tabaklar
Solucan Deneyi 11) Yumurta
Başarılı bir şekilde bu testte performans en kritik adımlar şunlardır: 1) C iyi beslenmiş desteleri kullanarak, tahlil plaka, 3 elegans, 2) kültür bakteri tek tip) doğru belirlenmesi E. maruz kalma L4 solucanlar sahnelenen faecalis, 4) E. maruz kalma süresi tutmak zaman ağartma tüm çalışmalar ve 5 tutarlı faecalis) yumurta parçalanma önlemek için on dakika geçmemelidir.
Bu testi için sağlıklı, iyi beslenmiş solucanlar almak için önemlidir. Anne açlık doğurganlık ve döl 19,20 büyüme etkileyebilir, bu nedenle solucanlar de bu tahlil yapmadan önce birkaç nesildir beslenen olduğunu önemlidir. Solucanlar bir iyi beslenmiş stok kolayca sadece yeni bir numaralı seribaşı NGM plaka 2-3 günde bir kaç yetişkin solucanlar aktararak korunur. Tahlil iki gün önce, erişkin solucanlar tahlil için kullanılabilir yeterli L4 döl sahip olmak için OP50 yeni bir çim yerleştirilmelidir.
<p = sınıf "jove_content"> Bu EIW tahlil plakaları bakteri yalnızca tek bir tip büyümesini teşvik etmek de önemlidir. E. faecalis suşları BHI plakalar üzerinde yetiştirilmiştir. Streptomisin E. karşı seçmek için plakalara ilave edildi Bu tahlil plakalarına bakım NGM plakalar ikinci transfer olarak L4 solucanlar ile transfer edilir coli OP50,. OP50 da BHI plakaları yetişir. , C. karşı seçili değilse elegans BHI plakaları sırasında bakteri iki tür (E. coli ve E. faecalis) beslenirler olacaktır. E. suşları Bu tahlilde kullanılan faecalis streptomisin direnci vardır. Bakteri farklı bu tahlil, bir antibiyotik, ve belki de farklı kültür ortamı kullanılmıştır durumunda, tercih bakterilerin seçilmesi için kullanılan ve E. karşı olmalıdır coli OP50.Doğru bu tahlil için solucanlar sahnelenen seçimi çeşitli nedenlerden dolayı çok önemlidir. İlk olarak, t sırasında yumurta tutma saymak önemlidir o yumurta üretim süresi / kendini gübreleme C. döşeme elegans. Yumurta üretimi C. ilk beş gün boyunca yalnızca oluşur elegans erişkin (40 saat sonrası L4 etrafında zirve) ve hızlı bir şekilde daha sonra 4,21 azalır. Döllenmiş yumurta üreten değil ise erişkin solucanlar iki üç hafta bir ortalama için yaşamak, pek çok erişkin solucanlar en az bir hafta yaşıyoruz. Bu nedenle, EIW testi bilinmeyen yaş unstaged erişkin solucanlar üzerinde gerçekleştirilen olmadığından emin olmak önemlidir.
Kullanmak önemlidir İkinci sebep EIW tayininde hayvanlar solucanlar bakterilere maruz kalmış hangi gelişiminde zaman, toksin veya ilaç sıkı kontrol edilir böyledir düzenledi. C. kültürleri elegans genellikle yumurta, L1 veya L4 aşamalarında eşitlenir. L4 sahne nedeniyle endişe bu tahlil için kullanıldığını E. için uzun pozlama solucanlar gebe yetişkin olmadan önce faecalis öldürücülüğü neden olacaktır.
çadır "> zaman solucanlar süresi çamaşır suyu kalır bu kez solucanı solucan değişir olmasına rağmen Worms döllenmiş yumurta sonunda çamaşır suyu ile çözülür., genellikle on dakika altında çözülmesi gerekirken. izlemek için de önemlidir, ama süreç koruyucu bir kabuk bölgesinin varlığı nedeniyle kütikül daha yavaştır. kabuğu daha uzun bir süre 10-15 dakika boyunca çözelti içinde bırakılırsa ağartıcı çözünmüş başlayacaktır.Yumurta tutma yumurta üretimi ve yumurta döşeme arasındaki dengeyi yansıtır. Tek başına EIW testi rahim tutulan yumurta sayısı yumurta üretimi veya yumurtlama değişiklikler nedeniyle olup olmadığı ayırt etmez. Bu bir bakteri suşu veya toksin ile tedavi solucanlar kontrol grubuna göre daha az yumurta korumak, özellikle bir husustur. Özellikle, bu durumda, bir takip kuluçka boyutu tahlilinde yapılmalıdır. Brood boyutu deneyleri solucan üreme ömrü 4 üzerinde yumurta koydu sayısını ölçmek </sup>. Deney ve kontrol gruplarında solucanlar yavru boyutu aynı ise, yumurta saklama farklılıklar yumurtlama davranış farklılıkları bağlanabilir. Bu mümkün değildir çünkü E. gibi hafif patojen bakteri suşları faecalis yumurta üretimi artırmak için hareket edeceğini, bu varsaymak makul olduğunu E. maruz kaldıktan sonra yumurta tutma artış faecalis (Şekil 3'te görüldüğü gibi), azalmış yumurtlama davranışlarının bir sonucudur.
EIW testi de bakteri yumurta tutma değiştirebilir hangi mekanizma belirlemez. Bu mümkün olduğunu C bir kötü besin kaynağı olduğu için patojenik bakteriler kolonize ve ağız açıklığı engelleme ya da tarafından besleme etkiler çünkü elegans yumurta muhafaza edebilir. Bu bakteri kolonize ve vulva açılmasını engellemek, ya da yumurta döşeme sistemindeki hücrelerin fonksiyonunu etkileyebilir olması da mümkündür. Diğer analizler WHI mekanizmasını belirlemek için gereklidirch yumurta tutma değişir.
Bu EIW test kolayca yumurta tutma üzerinde bileşiklerin çok çeşitli etkilerini belirlemek için değiştirilebilir. Buna ek olarak, bu deney bu patojenin etki için gerekli ya da bilgisayar (C. elegans) veya (E. faecalis) patojen bölgesi, genleri belirlemek için bir ekran içine dahil edilebilir kadar basittir. EIW analiz: yumurtlama düzenleyen kendisi için gerekli olan genlerin taranması için de kullanılabilir. ° C. elegans yumurta döşeme davranış, serotonin ve asetilkolin 5-9 gibi nörotransmitterlerin tarafından modüle ve çeşitli nöronlar ve kas gruplarının 12 koordineli faaliyet gerektirir. EIW deneyleri yapılmış ve nörotransmitter sinyal ve / veya kas aktivitesi için önemli genlerin tanımlanması için kullanılmaya devam etmektedir. EIW deneyleri, bir nicel değil, nitel daha önemli bir C analizini elegans davranış.
The authors have nothing to disclose.
Agar, ultrapure | Affymetrix | 10906 | |
Bacto Peptone | Becton Dickinson | 211677 | |
Bacto Tryptone | Becton Dickinson | 211705 | |
Brain Heart Infusion dehydrated medium | Carolina Biological Supply | 781781 | |
<em>C. elegans</em>, N2 strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
Culture plates for <em>C. elegans</em> | Tritech Research Inc. | T3308 | |
Culture plates for <em>E. faecalis</em> | Fisher Scientific-Fisherbrand | 875713 | |
<em>E. coli </em>(OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
<em>E. faecalis</em> strains | provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci | ||
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth; | |||
<p>all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified <span style="line-height: 1.6em;">dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars </span><span style="line-height: 1.6em;">(arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed </span><span style="line-height: 1.6em;">presumptive identification of all <em>E</em>. <em>faecalis</em> strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP </span><span style="line-height: 1.6em;">and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains </span><span style="line-height: 1.6em;">were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).</span></p> | |||
Microscope | Motic | SMZ 168B | any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient |
Streptomycin sulfate | Fisher BioReagents | BP910-50 | |
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco | Becton Dickinson | 236950 | |
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL | Becton Dickinson | 211768 | |
Yeast extract | Acros | 61180-1000 |