Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Bir yumurta-in-solucan (EIW) testi yumurtlama davranışı ölçmek için yararlı bir yöntemdir. Yumurtlama değişiklikler model organizma bir davranış tepki olabilir<em> Caenorhabditis elegans</em> Bu patojen bakteriler tarafından üretilen gibi zararlı çevresel maddelere.

Abstract

C. elegans yumurta döşeme davranış, osmolaritesi ¹ ve titreşim ² gibi çevresel ipuçları etkilenir. Gıda C. toplam yokluğunda elegans da yumurta döşeme ateşkes ve rahim ³ döllenmiş yumurta korumak. Ancak, özellikle farklı gıda kaynakları, özellikle patojen bakteri ve yumurta döşeme davranış Enterococcus faecalis, etkisi iyi karakterize değildir. Yumurta-in-solucan (EIW) testi bu durumda E'de, bakteri farklı etkilerini ölçmek için bir araçtır faecalis, yumurta döşeme davranış.

EIW deneyleri C rahim korudu yumurta sayısı, sayım içerir elegans ^4. EIW testi sahnelenen ağartma, gebe yetişkin C. içerir elegans manikür kaldırmak ve hayvan muhafaza yumurta ayırmak için. Önce beyazlatma için, solucan bakteri (veya çevresel işaret her türlü maruz kalan) Zaman belirli bir süre için. Ağartma sonra, bir çok kolay solucanlar rahim içinde muhafaza yumurta sayısını yapabiliyor. E. sonra yumurta tutma Bu deneyde, ölçülebilir bir artış faecalis maruz kolaylıkla ölçülebilir. EIW tahlil patojenik bakteri veya çevresel toksinler varlığı açısından taranması için kullanılabilecek bir davranış deneyidir. Buna ek olarak, EIW testi yumurta döşeme davranış, serotonin ve asetilkolin ^5-9 gibi nörotransmitterlerin tarafından modüle olduğu için sinyalizasyon nörotransmitter etkileyen ilaçlar için ekrana bir araç olabilir.

Introduction

Caenorhabditis elegans, mikroskobik, serbest yaşayan yuvarlak kurt, geleneksel olarak insanlara nedeniyle şeffaf anatomi, iyi karakterize geliştirme, tam sıralı genom, kısa nesil zamanlı ve genetik homoloji gelişim ve hücre sinyal süreçleri incelemek için kullanılan bir model organizmadır . Daha yakın zamanda, C. elegans çevresel toksikoloji ve doğuştan gelen bağışıklık ^{10, 11} alanında bir model organizma haline gelmiştir.

Bu kendi kendine gübreleme hermaphroditic solucanlar yumurtadan çıkım iki-üç gün içinde cinsel olgun olur. Yaşam döngüsü, C. sırasında elegans yetişkinliğe ulaşmadan önce, dört larva aşamaları (L1-L4) geçer. Bir izole hermafrodit tepe verimlilik üç gün içinde, ortalama, 300 yavru üretebilir. Üreme olgun C. elegans çift cinsiyetli, döllenmiş yumurta koydu önce birkaç saat boyunca rahim içinde korunur.Herhangi bir anda, rahim içinde depolanan yumurta normal sayıda (en yüksek verimlilik esnasında) on ila onbeş ^12'dir. Rahim yumurta sayısı yumurta üretimi oranı ve yumurtlama oranını hem de bir fonksiyonudur. Döllenmiş yumurta vulva ¹³ açılış etrafında düzenlenmiş on altı vulva kasların kasılması ile rahim kesilir. Hermafrodit özel nörotoksinlerini (HSN) 'ın ve dolayısıyla VC nörotoksinlerini kas kasılması etkileyen vulva kasları üzerine sinaps ve yumurtlama davranışı ^5,7,13,14. Rahim yumurta ihraç nöronlar ve kasların koordine aktivite nedeniyle oluşur.

C. Laboratuar kültürleri elegans genellikle patojen olmayan Escherichia coli OP50 bir diyet yetiştirilir. Doğal ortamda, C. elegans gibi patojen bakteriler gibi gıda kaynakları, çeşitli temas, potansiyel olarak zararlı olabilir. Zararlı maddelere maruz kaldığındaçevre, C. çevreye daha elverişli hale gelinceye kadar elegans yumurta saklayın. Muhtemelen bu yumurta tutma onların soyu korumak için bir çabadır.

Solucan (EIW) testi, C bu yumurta elegans, potansiyel olarak patojenik bakteriler, ortamda bulunan Enterococcus faecalis, maruz kalmaktadır. E. patojenik biçimlerine maruz faecalis C. kalıcı bağırsak enfeksiyonu ve hatta ölüme neden olabilir elegans ^15. Patojenik bakterilerin diğer formlarına maruz kalma yumurta tutma ^16,17 etkilediği gösterilmiştir, bununla birlikte etki miktarı değildi. E. Buna ek olarak, hafif patojenik etkisini suşları faecalis, yumurta döşeme davranış, hemen öldürücü olmayan suşları çalışılmamıştır.

EIW deneyleri C rahim korudu yumurta sayısı, sayım içerir elegans ^4. Olsa ° C. eleganssaydam, rahim içinde biriken yumurta bozulmamış bir hayvanda ölçmek için zor olabilir. EIW testi gebe yetişkin C. beyazlatma içerir zaman sabit bir süre için bakterilere maruz bırakıldı elegans. Çamaşır suyu solüsyonu geride bırakarak yumurta dış kütikül çözünür. Yumurta kabuğu koruyucu bir varlığı nedeniyle ağartıcı etkilerine refraktif vardır. Ağartma sonra, bir çok kolay beyazlatma üzerine solucanlar rahim salınan yumurta sayısını yapabiliyor.

Bu deney, bir anda rahim içinde yumurtaların sayısını ölçmek için basit, ucuz ve hızlı bir yöntemdir, ve böylece E. etkilerini ölçmek yumurta tutma üzerinde faecalis. Bu testte yumurta tutma bakteri, çevresel toksinler veya ilaç diğer türleri etkisini ölçmek için kullanılabilir. Bu deney aynı zamanda bakteriyel patojen için bir ekran olarak kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir.

Protocol

Nematod Büyüme Medya 1) hazırlanması (NGM)

1. 50 levha yapmak için, 1.5 g NaCl, 8.5 g saf olan Ağar ve 1 Lflask 1.25 g pepton ekleyin.
2. Balona dH ₂ O 487.5 ml ekleyin. Alüminyum folyo bir parça balonun açılış karıştırmak ve karşılamak için yavaşça girdap.
3. Standart koşullar (121 psi, 120 ° C, 20 dakika) otoklav ile çözüm sterilize edin.
4. Çözüm bir su banyosunda 45 ° C soğumasını bekleyin.
5. 5 mg / ml stok çözeltisi (etanol içinde çözülmüş), 500 ul 1 M _CaCI2, 500 ul 1 M MgSO ₄ ve 12.5 ml KPO ₄ tampon maddesi (54.15 g ile 500 ul: kolesterol çözeltisine, sırayla aşağıdaki eklemek dH ₂ O 500 ml KH ₂ PO ₄ ve 17.8 g K ₂ HPO ₄₎ ¹⁸ olarak tanımlanmıştır.
6. Steril pipetler kullanarak, her 60 mm polistiren Petri kabı agar çözüm 10 ml ekleyin. Medya oda sıcaklığında overn katılaşmaya izinight.

B Broth E. 2) hazırlanması coli Medya

1. Beş, 100 ml kültür hale getirmek için, bir behere Bacto Tripton, 2.5 g maya özütü, 5.0 g NaCl, 5.0 g ekleyin.
2. 500 ml 'lik bir son hacim için steril, damıtılmış su ekleyin. Çözünen çözünmüş kadar, karıştırarak, sıcak bir plaka üzerinde çözüm ısıtın.
3. Beş cam şişe (en az 200 ml hacim) içine Oda suyu 100 ml dökün.
4. Standart koşullar (121 psi, 120 ° C, 20 dakika) otoklav ile çözüm sterilize edin.
5. B suyu kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.

3) Tohumlama C. elegans Bakım Tabaklar

1. NGM plakalar en az bir hafta için oda sıcaklığında kuruması için izin verdikten sonra, E. birkaç koloni ile bir 100 ml oda suyu kültürü aşılamak coli (OP50).
2. E. büyütün 37 ° C'de gece boyunca kültür coli.
3. Pipet bir-iki damlası (yaklaşık 10081, l) OP50 kültürünün her NGM plaka ortasına üzerine. Tabaklar genellikle kapak tarafı yukarı dizilir. (Ekim) pipetleme zaman, yığının altındaki plaka üzerine kültür pipetleme başlar. Her yığın şekilde çalışır. Bu kültür çok yakın plakanın kenarlarına alamadım önemlidir çünkü, tohumlama sonra plakaları taşımak için çalışın.
4. Tohumlanan plakalar kullanılarak önce en az bir hafta için oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
5. Tohumlu plakalar oda sıcaklığında kapalı plastik kaplarda (ters) saklanır.

4) C. bakımı elegans Suşlarının

1. Iyi beslenen C. korumak için elegans stokları, her 3-4 günde bir yeni bir, numaralı seribaşı NGM plaka için üç L4S veya gebe yetişkin taşımak için almak bir solucan kullanın.
2. Mağaza plakalar (ters) tercihen bir inkübatör içinde 15 – 22 ° C Açıklanan tahlillerinde kültürler 20 ° C C de muhafaza edildi elegans geliştirme sıcaklığa bağlıdır. Maintena gibisıcaklık artışları nce, gelişim evreleri arasında zaman azalır.

Triptik soya ağarı (TSA) E. 5) hazırlanması faecalis Kültür Medya

1. Bir ocak, karıştırarak 50 plaka yapmak için, bir balona steril, distile su 500 ml ölçmek ve bir taşım kaynatın.
2. Şişeye toz TSA agar 20 g ilave edin ve eritmek için bir çözüm sağlar.
3. Standart koşullar (121 psi, 120 ° C, 20 dakika) otoklav ile çözüm sterilize edin.
4. Çözüm bir su banyosunda 45 ° C soğumasını bekleyin.
5. Steril pipetler kullanarak, her 60 mm polistiren Petri kabı agar çözüm 10 ml ekleyin. Ortam gece boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya izin verin.

Tryptic Soy Broth (TSB) E. 6) hazırlanması faecalis Kültür Medya

1. Karıştırılırken 250 kültür tüpleri hale getirmek için, bir ocak üzerindeki bir şişeye ve sıcak olarak, steril, damıtılmış su, 500 ml ölçer. </li>
2. Şişeye TSB, agar tozu 15 g ekleyin ve tozu çözmek için izin verir.
3. Standart koşullar (121 psi, 120 ° C, 20 dakika) otoklav ile çözüm sterilize edin.
4. Steril, 5 ml test tüplerine çözelti oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve daha sonra pipet 2 mi.

7) E. için Streptomisin ile Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) Medya, hazırlanması, faecalis Kültür

1. Bir şişe içine steril damıtılmış su, 500 ml ölçmek ve bir ocak, karıştırılırken, bir kaynama noktasına getir.
2. Şişeye BHI ortamı 26 g ekleyin ve çözelti, çözünmesi için izin verir.
3. Standart koşullar (121 psi, 120 ° C, 20 dakika) otoklav ile çözüm sterilize edin.
4. Çözüm ° C su banyosunda 45 soğumasını bekleyin.
5. Steril tekniği kullanarak, bir 10 mg / ml streptomisin stok solüsyonu ve karıştırmak için girdap 0.5 ml.
6. Her 60 mm polistiren Petri kabı çözüm 10 ml ekleyin.
<li> Veren ortam gece boyunca oda sıcaklığında katılaşmaya bırakılır. Mağaza, 4 tabak (ters) ° kullanmadan önce birkaç saat kadar C.

8) E. bakımı faecalis suşları

1. E. korumak için faecalis hisse senetleri, ayrı triptik soya agar (TSA) plakalar üzerine çizgi tek tek koloniler steril bir döngü kullanın.
2. 37 ° C gecede kültür büyütün. Birkaç hafta boyunca oda sıcaklığında kapalı bir torba ya da kutu içinde plakları (ters).

9) E. hazırlanması EIW Testi için faecalis Plakalar

1. E. bir koloni ile 2 ml TSB kültürü aşılamak faecalis ve 37 gece boyunca inkübe ° C
2. E. Pipet 20 ul faecalis hazırlanmış BHI-streptomisin plakasının ortasına üzerine kültür ve 37 gece boyunca inkübe ° C

10) E. hazırlanması EIW Testi (Kontrol Levhalar) için coli Tabaklar

1. 100 ml'lik bir B-bro inoküleE. bir koloni ile inci kültürü coli OP50 ve 37 ° C gece boyunca inkübe
2. Pipet 20 bir giremeyen NGM plaka merkezi üzerine OP50 kültür ul ve tohumlu plakalar gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Solucan Deneyi 11) Yumurta

1. 15 almak – 20 sahnelenen-L4 C. hazırlanmış bir BHI-Strep-E. bakteri çim ortasında üzerine elegans (Şekil 1) faecalis plaka. BHI plakasına OP50 bir sürü aktarmak için dikkatli olun. NGM-OP50 plaka bir kontrol için L4S aynı sayıda seçin.
2. 20 ° C'de 40 saat boyunca inkübe edin
3. 20% çamaşır suyu çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su, uygun hacmi ile ticari bir çamaşır suyu (% 6.0 sodyum hipoklorit) karıştırın.
4. Bir plastik kapak on farklı yerlerde (bir solucan veya bakteriyel plaka) için çamaşır suyu 10 ul damla ekleyin.
5. Bir solucan seçim kullanarak, her çamaşır suyu damla içine bir solucan aktarın. Bir Yavaşça girdap ucusolucan seçim sonunda (bir mikroskop altında damlacık görüntüleyerek teyit) yıkanır emin olmak için çamaşır suyu damlacık içinde almak.
6. Solucanlar yumurta (Şekil 2) kovma, açık patlayana kadar manikür yaklaşık 10 dakika ya da çözmek için izin verin. Plaka yumurta transferi için dikkatli olun.
7. Bir mikroskop kullanarak, çamaşır suyu her damla yumurta sayısı.

Representative Results

Discussion

Başarılı bir şekilde bu testte performans en kritik adımlar şunlardır: 1) C iyi beslenmiş desteleri kullanarak, tahlil plaka, 3 elegans, 2) kültür bakteri tek tip) doğru belirlenmesi E. maruz kalma L4 solucanlar sahnelenen faecalis, 4) E. maruz kalma süresi tutmak zaman ağartma tüm çalışmalar ve 5 tutarlı faecalis) yumurta parçalanma önlemek için on dakika geçmemelidir.

Bu testi için sağlıklı, iyi beslenmiş solucanlar almak için önemlidir. Anne açlık doğurganlık ve döl ^19,20 büyüme etkileyebilir, bu nedenle solucanlar de bu tahlil yapmadan önce birkaç nesildir beslenen olduğunu önemlidir. Solucanlar bir iyi beslenmiş stok kolayca sadece yeni bir numaralı seribaşı NGM plaka 2-3 günde bir kaç yetişkin solucanlar aktararak korunur. Tahlil iki gün önce, erişkin solucanlar tahlil için kullanılabilir yeterli L4 döl sahip olmak için OP50 yeni bir çim yerleştirilmelidir.

<p = sınıf "jove_content"> Bu EIW tahlil plakaları bakteri yalnızca tek bir tip büyümesini teşvik etmek de önemlidir. E. faecalis suşları BHI plakalar üzerinde yetiştirilmiştir. Streptomisin E. karşı seçmek için plakalara ilave edildi Bu tahlil plakalarına bakım NGM plakalar ikinci transfer olarak L4 solucanlar ile transfer edilir coli OP50,. OP50 da BHI plakaları yetişir. , C. karşı seçili değilse elegans BHI plakaları sırasında bakteri iki tür (E. coli ve E. faecalis) beslenirler olacaktır. E. suşları Bu tahlilde kullanılan faecalis streptomisin direnci vardır. Bakteri farklı bu tahlil, bir antibiyotik, ve belki de farklı kültür ortamı kullanılmıştır durumunda, tercih bakterilerin seçilmesi için kullanılan ve E. karşı olmalıdır coli OP50.

Doğru bu tahlil için solucanlar sahnelenen seçimi çeşitli nedenlerden dolayı çok önemlidir. İlk olarak, t sırasında yumurta tutma saymak önemlidir o yumurta üretim süresi / kendini gübreleme C. döşeme elegans. Yumurta üretimi C. ilk beş gün boyunca yalnızca oluşur elegans erişkin (40 saat sonrası L4 etrafında zirve) ve hızlı bir şekilde daha sonra ^4,21 azalır. Döllenmiş yumurta üreten değil ise erişkin solucanlar iki üç hafta bir ortalama için yaşamak, pek çok erişkin solucanlar en az bir hafta yaşıyoruz. Bu nedenle, EIW testi bilinmeyen yaş unstaged erişkin solucanlar üzerinde gerçekleştirilen olmadığından emin olmak önemlidir.

Kullanmak önemlidir İkinci sebep EIW tayininde hayvanlar solucanlar bakterilere maruz kalmış hangi gelişiminde zaman, toksin veya ilaç sıkı kontrol edilir böyledir düzenledi. C. kültürleri elegans genellikle yumurta, L1 veya L4 aşamalarında eşitlenir. L4 sahne nedeniyle endişe bu tahlil için kullanıldığını E. için uzun pozlama solucanlar gebe yetişkin olmadan önce faecalis öldürücülüğü neden olacaktır.

çadır "> zaman solucanlar süresi çamaşır suyu kalır bu kez solucanı solucan değişir olmasına rağmen Worms döllenmiş yumurta sonunda çamaşır suyu ile çözülür., genellikle on dakika altında çözülmesi gerekirken. izlemek için de önemlidir, ama süreç koruyucu bir kabuk bölgesinin varlığı nedeniyle kütikül daha yavaştır. kabuğu daha uzun bir süre 10-15 dakika boyunca çözelti içinde bırakılırsa ağartıcı çözünmüş başlayacaktır.

Yumurta tutma yumurta üretimi ve yumurta döşeme arasındaki dengeyi yansıtır. Tek başına EIW testi rahim tutulan yumurta sayısı yumurta üretimi veya yumurtlama değişiklikler nedeniyle olup olmadığı ayırt etmez. Bu bir bakteri suşu veya toksin ile tedavi solucanlar kontrol grubuna göre daha az yumurta korumak, özellikle bir husustur. Özellikle, bu durumda, bir takip kuluçka boyutu tahlilinde yapılmalıdır. Brood boyutu deneyleri solucan üreme ömrü ⁴ üzerinde yumurta koydu sayısını ölçmek </sup>. Deney ve kontrol gruplarında solucanlar yavru boyutu aynı ise, yumurta saklama farklılıklar yumurtlama davranış farklılıkları bağlanabilir. Bu mümkün değildir çünkü E. gibi hafif patojen bakteri suşları faecalis yumurta üretimi artırmak için hareket edeceğini, bu varsaymak makul olduğunu E. maruz kaldıktan sonra yumurta tutma artış faecalis (Şekil 3'te görüldüğü gibi), azalmış yumurtlama davranışlarının bir sonucudur.

EIW testi de bakteri yumurta tutma değiştirebilir hangi mekanizma belirlemez. Bu mümkün olduğunu C bir kötü besin kaynağı olduğu için patojenik bakteriler kolonize ve ağız açıklığı engelleme ya da tarafından besleme etkiler çünkü elegans yumurta muhafaza edebilir. Bu bakteri kolonize ve vulva açılmasını engellemek, ya da yumurta döşeme sistemindeki hücrelerin fonksiyonunu etkileyebilir olması da mümkündür. Diğer analizler WHI mekanizmasını belirlemek için gereklidirch yumurta tutma değişir.

Bu EIW test kolayca yumurta tutma üzerinde bileşiklerin çok çeşitli etkilerini belirlemek için değiştirilebilir. Buna ek olarak, bu deney bu patojenin etki için gerekli ya da bilgisayar (C. elegans) veya (E. faecalis) patojen bölgesi, genleri belirlemek için bir ekran içine dahil edilebilir kadar basittir. EIW analiz: yumurtlama düzenleyen kendisi için gerekli olan genlerin taranması için de kullanılabilir. ° C. elegans yumurta döşeme davranış, serotonin ve asetilkolin ^5-9 gibi nörotransmitterlerin tarafından modüle ve çeşitli nöronlar ve kas gruplarının ¹² koordineli faaliyet gerektirir. EIW deneyleri yapılmış ve nörotransmitter sinyal ve / veya kas aktivitesi için önemli genlerin tanımlanması için kullanılmaya devam etmektedir. EIW deneyleri, bir nicel değil, nitel daha önemli bir C analizini elegans davranış.

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
<em>C. elegans</em>, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for <em>C. elegans</em>	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for <em>E. faecalis</em>	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
<em>E. coli </em>(OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
<em>E. faecalis</em> strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
<p>all strains grew at 44.5 &ordm;C and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified&nbsp;<span style="line-height: 1.6em;">dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">(arabinose, mannitol, methyl-&alpha;-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">presumptive identification of all <em>E</em>. <em>faecalis</em> strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).</span></p>
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000