Yöntem makalesi

Of kapsül Serotipleme Streptococcus pneumoniae Kapsül şişme deneyi kullanarak Reaksiyon

DOI:

10.3791/51208

⸱

24 Şubat 2014

 ,  , 
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Department of Microbiology & Immunology, The University of Melbourne

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsül şişme deneyi Reaksiyon Streptococcus pneumoniae serotip için altın standart bir tekniktir. Bu teknik mikroskop ve belirli pnömokok antiseranın kullanır ve yaygın dünya çapında bir referans ve araştırma laboratuvarlarında kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streptococcus pneumoniae kapsül 90 farklı serotip (pnömokok) vardır. Yanı sıra pnömokok epidemiyolojisi anlamak için bir araçtır olarak, kapsül serotipleme aşı etkinliği ve darbe çalışmaları için yararlı bilgiler sağlayabilir. Kapsül şişme deneyi Reaksiyon pnömokok kapsüler serotiplemeye altın standart yöntemdir. Bir yöntem olup, kapsüler polisakarite karşı havuzlanmış ve spesifik antiserumlarla bir pnömokok kökenli hücre süspansiyonu test içerir. Antijen-antikor reaksiyonları mikroskopik olarak gözlenir. Bir bakteri hücre süspansiyonu 1) hazırlanması, bir cam slayt üzerinde hücrelerin ve antiserumlar 2) karıştırma, ve 3) bir mikroskop kullanılarak kapsül şişme deneyi tepki okuma: Protokol üç ana adım vardır. Reaksiyon, kapsül şişme deneyi gerçekleştirmek için oldukça basit ve uygun bir mikroskop ve antisera mevcuttur yerde uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streptococcus pneumoniae (pnömokok) hastalık yükü kaynak yoksul ülkelerde 1 ağırlıklı olarak düşen, yılda beş yaşın altında yaklaşık 800.000 çocuk ölümünden sorumlu. Pnömokok hastalıkları örneğin sepsis, menenjit ve zatürre 2 gibi ciddi hayatı tehdit eden enfeksiyonlar, akut otitis media gibi lokalize enfeksiyonlar şiddeti değişir. Pnömokok 90 üzerinde kapsüler serotip 3, 4, tarif edilmiştir. Mevcut pnömokok aşıları invasif hastalık 5, 6 çoğunluğu için sorumlu olan serotip karşı koruma sağlar. Bununla birlikte, aşıların yaygın kullanımı, nazofarenks taşıyıcı ve invasif hastalık 7, 8, hem nonvaccine serotiplerinin aşıda bulunan serotiplerin değiştirilmesi ile ilişkilendirilmiştir. Bu epidemiyolojik için serotipleme önemini vurgulamaktadırgözetim ve uzun vadeli aşı etkisi 9 inceler.

Pnömokok tiplemesi için altın standart yöntem, 1902 yılında ilk Neufeld tarafından açıklanan kapsül şişme deneyi reaksiyonu olarak bilinen kapsül reaksiyon testi, (Avusturya 10 bakınız). Uyum yüksek derecede laboratuarlar arasında ve kapsül şişme deneyi reaksiyon ve diğer serotipleme yöntemler 11-13 arasında bulunmuştur. Kapsül şişme deneyi reaksiyonu 10, 14-16 çeşitli varyasyonları vardır. Burada tarif edilen metot, bir karşı leke veya yağ daldırma objektif kullanımını gerektirmeyen, daha ziyade, hazırlanan numune bir damla yazarak serumu ile karıştırılır ve 400X büyütme altında hemen incelenmiştir.

Reaksiyon genellikle kapsül şişme deneyi ticari olarak temin edilebilen anti-serumlar kullanılarak gerçekleştirilir. Burada tarif edilen yöntem, daha düşük maliyetli yapmak, bazı başka yöntemler 16, 17 oranla daha az anti-serumlar kullanır. Bir kez isolate bir pozitif reaksiyon gözlenmiştir kadar sekans antisera havuzları ile test edilir, bir pnömokok olarak tanımlanır. Her havuz antiserum 91 pnömokok serotipleri 18 karşı oluşturulan antiserumların farklı karışımları içerir. Havuz kurulduktan sonra, reaktif havuzda içerdiği bireysel tip antisera ve grup sırayla ayrı ayrı test edilmiştir. Grubu antisera (örneğin, Grup 22 antiserum serotip 22F ve 22A ile reaksiyona girer), belirli bir grup içindeki tüm serotipler ile reaksiyona iken, tip antisera, genel olarak, tek bir serotip (örneğin Tip 1 antiserum, serotip 1 ile reaksiyona giren) ile reaksiyona girer. Gruplar içindeki bazı serotip başka bir faktör, antisera (örneğin, serotip 22F faktör 22b ile reaksiyona girer, ancak 22c) kullanılarak ayrılır. Serotip 19, 20, tespit edilene kadar, bu durumda test ilgili tüm etken antisera ile devam edilir. Reaksiyon, kapsül şişme deneyi basit ve 14 hızlı ve herhangi bir l yapılabiliraboratory bu iyi kaliteli mikroskop antiserumlar ve uygun bir dizi ile donatılmıştır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Yazma Hücre Süspansiyon hazırlanması

  1. Steril tek kullanımlık 1 ul döngü kullanarak, katı seçici olmayan at kanlı agarda pnömokokların taze bir gecede saf kültür küçük süpürme almak ve 100 ul Kalp İnfüzyon (HI) suyu aşılamak. Süspansiyon, sadece gözle görülür bulanık olarak görünmelidir. Emülsiyon haline getirmek için hafifçe ajite tüp.
    Not: Brain Heart Infusion suyu gibi diğer ortam da uygun olabilir. Serumu (% 10, örneğin bir nihai konsantrasyon (h / h) at serumu) ve kullanılmadan önce yaklaşık olarak 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübasyon eklenmesi etkisini artırmak için kullanılabilir.

2. Hücre Süspansiyon Yoğunluğu denetleme

Adım 1.1 'de hazırlanan hücre süspansiyonu da negatif kontrol olarak kullanılacak, ve yazma sera eklemeden önce, hücre yoğunluğu için kontrol edilmelidir.

  1. 1 ul döngü kullanılarak, glas üzerine aşama 1.1 'de hazırlanan aşı bir damla aktarmaks mikroskop lamı.
  2. Bir çift forseps kullanarak, süspansiyon üzerinde bir küçük dairesel lamel yerleştirin.
  3. Faz-kontrast ayarı kullanılarak, süspansiyonun yoğunluğu (Şekil 1A) kontrol etmek için mikroskopik 400X büyütme altında hazırlanmasını dikkate alınmalıdır.
    1. Aşılama (Şekil 2A) çok ağır ise, seyreltilmesi aşama 1.1 'de yapılan hücre süspansiyonu daha fazla suyu ekleyin. Tekrar hafifçe karıştırın.
    2. Aşılama çok açık ise, örneğin, hücreler, 50 aşamasında 1.1 'de yapılan hücre süspansiyonu hazırlamak için daha fazla bakteri ekleyin ve yavaşça karıştırın, mikroskobik alan (Şekil 2B) görünür Not: deneyimi ile, hücre süspansiyonu yoğunluğu sallayarak ve sadece gözle görülür bulanık görünmelidir ışığa kadar tutarak karar olabilir.
  4. Hücrelerin uygun bir sayısı mikroskopik alanına görebilir kadar yineleyin 2,1-2,3 adımları tekrarlayın.
    Not: Cam slaytlar ve coverslips kavuz tehlikesi. Kullanımdan sonra, slaytlar ve lamelleri enfeksiyöz materyal ile kontamine olan ve biyolojik tehlikeli kesici kabın içine atılmalıdır.

3. Yazma

  1. Cam mikroskop lamı üzerine (örneğin, 1 ul döngü kullanılarak) hazırlanmış inokulum ~ 1 ul aktarın. Biohazard kesici kabın içine döngü atın.
  2. Slayt üzerine oda sıcaklığı antiserumu eşit bir hacmi (1 ul halka dolusu) ilave edilir ve iki döngü ile iyi damla karıştırın.
  3. Bir çift forseps kullanarak, damla dokunmamaya özen, süspansiyon üzerinde küçük dairesel lamel yerleştirin. Kurumasını slaytta sıvı önlemek için hemen antiserumların ilave edildikten sonra süspansiyon lamel yerleştirin.
  4. Bir mikroskop kullanarak, 400X büyütme ile faz-kontrast altında süspansiyon gözlemlemek. Pnömokok hücre 'şişme' ya da çok az 40 ° C'de görülebilir zaman negatif bir kapsül şişme deneyi reaksiyonu görülmektedirHiçbir antisera ile pnömokokal hücre süspansiyonu olarak gözlemlenen ile benzer 0X büyütme, (negatif kontrol) ilave edildi. Negatif kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında hücre büyütülmüş ya da "şişmiş" ve daha görünür olduğunda A pozitif bir kapsül şişme deneyi reaksiyon gözlenmektedir.
    Not: Şüpheli reaksiyonlar, oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübasyondan sonra, ya da daha fazla antiserum ile reaksiyonu tekrarlanarak reaksiyonun incelenmesi, örneğin daha araştırılmalıdır.
  5. Bir pozitif reaksiyon görülmektedir kadar bireysel antiserumları havuzları ardışık test ile pnömokok Serotipleme Davranış. Alternatif olarak, havuz serotiplerinin yerel sıklığı bağlı olarak 'tur' de uygulanabilir.
    Not: 'mermi' Ölçme en yaygın serotiplerine antikorları içeren havuzlar ilk test edilmesini sağlar, çaba ve maliyet en aza indirir. Birkaç havuzları Eşzamanlı test de interp yararlı olabilir, hangi ek negatif kontrolleri sağlarretation. Belirli bir 'yuvarlak' tüm havuzları negatif ise, havuzları sonraki mermi ile izolat test edin.
  6. Reaktif havuzun içinde bulunan uygun türü veya grup antiserum kullanarak izolat test edin. Uygun olduğunda, daha fazla serotip ayırt etmek için etken antisera kullanın.
    Not: Üretici tarafından verilen pnömokok antiserumlara Keys uygun havuz, tip, grup veya faktör antiseranın ve (herhangi bir çapraz reaksiyonlar dahil) sonuçlarının yorumlanması seçiminde kullanılmaktadır.
  7. Olumsuz sonuçları tüm havuzları ile elde edilirse, (91 serotiplere 21 karşı antikorlar içerir) Omniserum reaktif ile izolat test edin. Omniserum reaktif ile izole bir pnömokok test ederken olumlu bir kapsül şişme deneyi reaksiyon hala görülmez ise izolatın az veya hiç kapsül ifade veya serotip karşı antikorlar Omniserum temsil olmadığını, çünkü bu olabilir. İkinci kategori, yeni serotiplerini içerebilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tip-spesifik antikorun, kırılma endeksi 10 bir değişime yol açan, pnömokokun kapsüle bağlar olumlu bir kapsül şişme deneyi reaksiyon meydana gelir. Mikroskop altında bakıldığında, bakteriler "şişmiş" ve 14 daha görünür. Şekil 1A HI suyu içinde pnömokok hücrelerini göstermektedir. Tip-spesifik anti-serum bakteriyel süspansiyona ilave edildiğinde, pnömokokki (Şekil 1B), "şişmiş" kırılma ve daha yuvarlak görünür.

Brota ilave çok fazla bakteri hücreleri hücre toplama ya da yanlış negatif bir reaksiyona neden olabilir. (Şekil 2A) ya da "çok hafif '(Şekil 2B)' de ağır" in HI suyu içinde pnömokok kökenli hücrelerin uygulanması gibi 2: Şekil.

08fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg "/>
Şekil 1. Negatif ve pozitif kapsül şişme deneyi reaksiyon. Serotip 9V pnömokok hazırlıklar hiçbir antiserum (1A) ve grup 9 antiserum ile izole (1B), 400X büyütme altında incelendi. Bu ikinci "şişme" ve genellikle bir pozitif kapsül şişme deneyi reaksiyonunda görülen bakteriyel hücrelerin yuvarlama göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 2. Çok ağır ve çok hafif inokula. 400X büyütme altında incelendi (2A) veya çok hafif (2B) çok ağır pnömokok hücre süspansiyonları, preparatlar.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu teknikte kritik bir safha, saf kültür çorbasına bakteriyel hücrelerin uygun bir sayısı ile birlikte ekleme süspansiyonunu hazırlamak için kullanılır sağlamaktır. Bu agar plakaları üzerinde büyüme ve koloni morfolojisi, farklı pnömokok izolatı arasında değişmekte olduğu not edilmelidir. Bazı döngü ile kapalı almak için ve suyu iyi emülsifiye olmayan zor olabilir, kuru ve sert koloniler üretir. Hücre süspansiyonunun hazırlanması, bu nedenle, bakterilerin daha büyük bir tarama gerekebilir. Her durumda, bu göreceli boyutu antisera olan hücreler ile karşılaştırıldığında, böylece tek tek hücreler, ve agregalar, negatif kontrol olarak ilave ortada şarttır. Buna ek olarak, çok sayıda bakteri hücreleri kapsül antijeninin fazla kapsül şişme deneyi reaksiyonu 10 inhibe edebilir bir yanlış negatif tepkimeye neden olabilir. Bu nedenle, uygun bir hücre yoğunluğuna sahip bir bakteriyel süspansiyon (Şekil 1) oluşturmak için önemlidir. Suspansiyon konsantre edilmiş, formalin birkaç damla eklenmesi ile birkaç ay boyunca muhafaza edilebilir. Bu kolay toplu testini sağlar ve aynı zamanda laboratuvar kaynaklı enfeksiyonların riskini azaltarak suyu sterilize, bu zehirli, aşındırıcı, kanserojen, duyarlılaştırılmaları ve yanıcı taşıma formalin güvenlik riskine karşı tartılır olmalıdır rağmen. Buna ek olarak, bazı izolatlar formalin (veriler gösterilmemiştir) mevcudiyetinde tepkileri zayıf olduğunu gözlemledik.

Kapsül şişme deneyi reaksiyonları bir mikroskop kullanılarak incelenir. Faz kontrast kullanılması, kapsülün görünürlüğünü artırır. Bazı laboratuarlarda, reaksiyon 1,000 X büyütme 14, 16 petrol-batırma kullanılarak izlenebilir. Buna ek olarak, bazı laboratuar ayrıca bir pozitif reaksiyon 10, 16, 22 görünürlüğünü artırmak için bir karşı leke (metilen mavi) kullanın. Burada sunulan yöntem, yağ-i olmaksızın görülüyormmersion ve 400X büyütme 15, 17 altında. Bu yöntem, hızlı, basit ve 23, okumak için nispeten kolaydır.

Bu antiserumlar ve test prosedürleri sırayla sağlamak için iyi bir iç kalite kontrol prosedürleri korumak için önemlidir. Bir dış kalite güvence programına katılım genellikle faydalıdır.

Pnömokok olarak serolojik tipleme için kapsül şişme deneyi reaksiyonun önemli bir sınırlama gerekli olan antiserumların yüksek maliyetidir. Bununla birlikte, bu durum, her bir reaksiyon için kullanılan antiserumun küçük bir miktarına gerek yukarıdaki protokol en aza indirilir. Diğer bazı yöntemler pnömokok 23, 24 serotip için tarif edilmiştir. Ancak, kapsül şişme deneyi altın standart olmaya devam etmektedir ve yeni yöntemlerin geliştirilmesi kapsül şişme deneyi reaksiyonu 23 karşı standardizasyonu gerektirir. Uygun anti-serumlar kullanılarak, reaksiyon, kapsül şişme deneyi başka kapaklar belirlemek ve yazmak için kullanılabilirule bakteri 25 üretir. Kapsül şişme deneyi reaksiyon mevcut ve gelişmekte olan pnömokok serotipleri karakterizasyonu, yanı sıra aşı etkinliği ve taşıma ve hastalık üzerine aşılamanın uzun vadeli etkileri hakkında bilgi veren vesile oluyor.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Bill ve Melinda Gates Vakfı (PneuCarriage proje, Grant 52099) ve Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı tarafından desteklenmiştir. Eileen Dunne, Janet Strachan, ve yazının eleştirel okuma için Kim Hare teşekkürler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Pneumococcus (Neufeld) antiseraSSI Diagnosticahttp://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Kullanmadan önce tüm antiserumları oda sıcaklığına getirin
Pneumococcus (Omni) antiserumSSI Diagnostica2438Kullanmadan önce tüm antiserumları oda sıcaklığına getirin
Optik MikroskopLeica MicrosystemsLeica DML
Kalibre Edilmiş Tek Kullanımlık Aşılama Döngüleri 1 & lCopanCD175S01
At Kanı Agar (HBA) plakalarıThermo Fisher ScientificPP2001http://www.thermofisher.com.au/
Kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin
Kalp İnfüzyonu (HI) et suyuMedya Hazırlama Ünitesi (MPU), Melbourne Üniversitesi40HINKullanmadan
önce oda sıcaklığına getirinCam mikroskop slaytları 76 mm x 26 mmLomb Scientific7101Kesici alet tehlikesi: Biyolojik tehlike içeren bir kesici-delici alet kabına atın
Dairesel cam lamellerNeuVitroGG-5
*Antiserumlar hariç, diğer tüm malzemeler alternatif tedarikçilerden
*Defibranasyonlu koyun kanından hazırlanan plakalar uygundur, ancak sitrat kanından veya insan kanından hazırlanan kan plakaları uygun değildir
satın alınabilir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  3. Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
  4. Calix, J. J., et al. Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype. J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).
  5. Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  6. Johnson, H. L., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 8, (2010).
  7. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
  8. Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination. Lancet. 348, 271-272 (1996).
  9. Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
  10. Austrian, R. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).
  11. Konradsen, H. B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe. Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).
  12. Lovgren, M., et al. Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from. J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).
  13. Reasonover, A., et al. The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).
  14. Hare, K. M., et al. #34;Dodgy 6As": differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction. J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).
  15. Kong, F., Gilbert, G. L. Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes. J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).
  16. Castillo, D., et al. Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).
  17. Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae. J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).
  18. SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
  19. Sorensen, U. B. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).
  20. Diagnostica SSI, Key to pneumococcal factor antisera. , (2013).
  21. Diagnostica SSI, Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use. , (2011).
  22. Lund, E. Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections. Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).
  23. Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. 32, 165-179 (2013).
  24. Vernet, G., et al. Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).
  25. Casewell, M. W. Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species. J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Capsular SerotypingQuellung ReactionStreptococcus pneumoniaePneumococcal CapsuleAntisera TestingMicroscopic ObservationPhase ContrastBacterial SuspensionSlide PreparationSerological Typing

İlgili makaleler