Method Article

Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/51216

⸱

January 31st, 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu bitkilerde monoklonal antikorlar ve raportör proteinlerin geçici transgen ifadesi üzerindeki düzenleyici elemanlar, bitki büyüme ve gelişme parametreleri ve inkübasyon koşullarının etkisini belirlemek ve modellemek için kullanılabilecek deneyler yaklaşımın bir tasarımını tarif eder.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitkiler düşük maliyet, ölçeklenebilirlik ve güvenlik dahil biyofarmösetiklerinin üretimi için birden çok yarar sağlar. Geçici sentezleme, kısa geliştirme ve üretim kez ek bir avantaj sunar, ancak ekspresyon seviyeleri böylece iyi üretim uygulamaları bağlamında düzenleyici endişelere yol açan gruplar arasında önemli ölçüde değişebilir. Biz böyle partiler arasındaki ifade değişkenliğine ifadesi sırasında düzenleyici ifade yapı elemanları, bitki büyüme ve gelişme parametreleri ve inkübasyon koşulları gibi önemli faktörlerin etkisini belirlemek için deneyler (DOE) yaklaşımın bir tasarım kullanılmış. Bu model, anti-HIV monoklonal antikoru (2G12) ve bir flüoresan işaret proteini (DsRed) ifade eden bitkiler test edilmiştir. Biz modelin bazı özellikleri seçmek için gerekçe tartışmak ve potansiyel sınırlamaları belirlemek. Genel yaklaşım kolayca diğer sorunlara transfer edilebilir çünkü bu model ilkelerigeniş yeniden uygulanabilir: küçük modüller, optimum deney kombinasyonlar Yazılım destekli kurulum ve adım adım tasarım büyütme içine ilk sorunu bölerek bilgi-tabanlı parametre seçimi, karmaşıklığı azaltma. Bu nedenle, yöntem, sadece bitkilerde protein ekspresyonu karakterize etmek için değil, aynı zamanda mekanik bir açıklama eksik diğer karmaşık sistemlerin araştırılması için yararlıdır. Parametreler arasındaki birleştiricisi tarif akıllı denklem diğer sistemler için karmaşık mekanik modelleri oluşturmak için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitkiler büyümeye ucuzdur çünkü bitkilerde biofarmasötik proteinlerin üretimi avantajlıdır, platformu sadece daha fazla büyüyen bitkiler tarafından büyütülüyor olabilir, ve insan patojenler 1,2 çoğaltmak mümkün değildir. DNA teslimat ve arıtılmış bir ürün teslimat noktası arasındaki süre yaşındaki az 2 ay 3 azaltılır, çünkü Agrobacterium tumefaciens ile yaprakların infiltrasyonu örneğin göre geçici sentezleme stratejileri, ek faydalar sağlar. Geçici sentezleme aynı zamanda zarar fonksiyon-mutantları tamamlamak için veya protein etkileşimlerini incelemek 4-6 etme kabiliyetleri açısından test etmek için genlerin fonksiyonel ana....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Bir DoE Stratejisi Planlama

  1. Tasarım dahil ilgili faktörleri ve yanıtları belirlemek.
    1. Ölçüm için, bir ya da daha fazla yanıtları tanımlar. Burada, 2G12 ve DsRed ekspresyon düzeyleri, ilgili (sırası ile 10 ve 20 ug / ml) olarak en az bir fark tespit ve sistemin tahmin edilen standart sapma için yaklaşık bir değer (4 ve 8 ug de dahil olmak üzere, (ug / ml) kullanıldı / ml, sırasıyla) önceki deneylere dayalı.
    2. Mevcut literatürü kullanın, önceki deneylerde veya özel tarama tasarımları veri olan etkisi tepkiler üzerine sayısal olarak (Tablo 1) 7,8,19,20 önemli faktörler seçmek için (örneğin bir faktör ta....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklı destekleyiciler ve 5'UTRs kullanarak geçici ifadesi sırasında DsRed birikimi için bir açıklayıcı bir model

Yaprak ekstreleri içinde DsRed floresan rekombinant protein ekspresyon seviyesini gösterir ve bu nedenle DoE stratejisinde tepki olarak kullanılmıştır kullanılmıştır. Alakalı olarak en az algılanabilir bir fark 20 ug / ml oldu ve sistemin tahmin edilen standart sapma ilk deneylere göre 8 ug / ml idi. Geçici ifade modele dahil faktörler literatür verileri ile

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynaklar genellikle kıt ve pahalı olduğu için her deneme dikkatli bir planlama gerektirir. Planlama aşamasında (örneğin tüm önemli faktör etkileşimleri kapsamaz bir baz model seçerek) esnasında hataları büyük ölçüde çıkan modellerin tahmin gücünü azaltmak ve böylece tüm deney devalüasyon olabilir, çünkü bu DoE stratejileri için özellikle doğrudur. Ancak, bu hataları kolayca temel prosedürleri takip ederek önlenebilir.

DoE planlama sırasında Hususlar

İlk ol.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yayın ücreti kısmen el yazması veya içeriğinin herhangi bir sorumlu hazırlanmasında dahil rol almayan şirketlerin Statease, Inc (ABD) ve Statcon (Almanya), sponsor oldu.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışmada kullanılan tütün bitkileri yetiştirilmesi için ppam bitki ekspresyon vektörü ve İbrahim Al Amed sağlamak için Dr Thomas Rademacher minnettarız. Biz el yazması düzenleme ile yaptığı yardım için Dr Richard M. Twyman teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Avrupa Araştırma Konseyi İleri Hibe "Future-Pharma" tarafından finanse edildi, öneri sayısı 269.110 ve Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer Gelecek Vakfı).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tasarım Uzmanı (R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEyazılımı
TriptonCarl Roth GmbH8952.2Ortam bileşeni
Maya özüCarl Roth GmbH2363.2Ortam bileşeni
Sodyum klorürCarl Roth GmbHP029.2Ortam bileşeni
AmpisilinCarl Roth GmbHK029.2Antibiyotik
Agar-AgarCarl Roth GmbH5210.2Medya bileşeni
Escherichia coli K12 DH5aYaşam Teknolojileri18263-012Mikroorganizma
pPAMGenBankAY027531Klonlama/ekspresyon vektörü;  
NucleoSpin Plazmid MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250Plazmid DNA izolasyon kiti
NucleoSpin Jel ve PCR TemizlemeMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250Plazmid DNA saflaştırma kiti
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.Spektrofotometre
NcoINew England Biolabs, Inc.R3193LKısıtlamaendonükleaz
EcoRINew England Biolabs Inc.R3101LKısıtlamaendonükleaz
AscINew England Biolabs Inc.R0558LKısıtlamaendonükleaz
NEB 4New England Biolabs Inc.B7004SKısıtlamaendonükleaz tamponu
TRISCarl Roth GmbH4855.3Ortam bileşeni
Disodyum tetraboratCarl Roth GmbH4403.3Ortam bileşeni
EDTACarl Roth GmbH8040.2Ortam bileşeni
AgaroseCarl Roth GmbH6352.4Ortam bileşeni
Bromofenol mavisiCarl Roth GmbHA512.1Renk göstergesi
Ksilen siyanolCarl Roth GmbHA513.1Renk göstergesi
GlycerolCarl Roth GmbH7530.2Medya bileşeni
Mini-Sub Cell GT CellBioRad170-4406Jel elektroforez odası
Agrobacterium tumefaciens suşu GV3101:pMP90RKDSMZ12365Mikroorganizma
Electroporator 2510Eppendorf4307000.658Electroporator
Sığır eti özüCarl Roth GmbHX975.2Medya bileşeni
PeptoneCarl Roth GmbH2365.2Medya bileşeni
SucroseCarl Roth GmbH4621.2Medya bileşeni
Magnezyum sülfatCarl Roth GmbH0261.3Medya bileşeni
KarbenisilinCarl Roth GmbH6344.2Antibiyotik
KanamisinCarl Roth GmbHT832.3Antibiyotik
RifampisinCarl Roth GmbH4163.2Antibiyotik
FWD astarEurofins MWG Operonn.a.CCTCAG GAA GAG CAA TAC
REV astarEurofins MWG Operonn.a.CCAAAG CGA GTA CAC AAC
2720 Termal döngüleyiciUygulamalı Biyosistemler4359659Thermocycler
RNAfold web sunucusuViyana Üniversitesin.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Gübre
Grodan Taşyünü Küpleri 10 x10 cmGrodann.a.Taşyünüblok
Serayetiştiriciliği için
PhytotronIlka Zelln.a.Bitkiyetiştiriciliği için
Omnifix-F SoloB. Braun6064204Şırınga
Murashige ve Skoog tuzlarıDuchefaM 0222.0010Medya bileşeni
GlucoseCarl Roth GmbH6780.2Medya bileşeni
AsetosyringoneSigma-AldrichD134406-5GFitohormon analogu
  BioPhotometer plusEppendorf6132 000.008Fotometre
Osram soğuk beyaz 36 WOsram4930440Işık kaynağı
Disodyum fosfatCarl Roth GmbH4984.3Ortam bileşeni
Santrifüj 5415DEppendorf5424 000.410Santrifüj
Forma -86C ULT dondurucuThermoFisher88400Dondurucu
Synergy HTBioTekSIAFRTFloresan plaka okuyucu
Biacore T200GE Healthcaren.a.SPRcihazı
Protein ALife Technologies10-1006Antikor bağlayıcı protein
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Medya bileşeni
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Medya bileşeni
2G12 antikoruPolymunAB002Referans antikoru
n.a.n.a.Bitki

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Design Of ExperimentsTransient Protein ExpressionTobacco PlantsProtein AccumulationLeaf AgeIncubation ConditionsFluorescence MeasurementResponse SurfaceNumerical OptimizationPredictive Modeling

Related Articles