İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen

Özet

Bu protokol, tek bir hücre süspansiyonu için ayrışma olmadan küresel nöral kök ve projenitör hücre agrega genişlemesini sağlayan bir yeni mekanik bir kesme yöntemi tarif etmektedir. Hücre / hücre teması sürdürmek üzerinde 40 geçişleri için hızlı ve istikrarlı bir büyüme sağlar.

Özet

Araştırma deneyleri ve klinik denemeler için tek bir örnekten hücrelerinin çok sayıda toplamak için bir hücre genişleme tekniği büyük ölçüde kök hücre topluluğuna yarar sağlayacak. Birçok mevcut genişleme yöntemler zahmetli ve masraflı ve tam ayrılma içeren bu birkaç kök ve progenitör hücre tipleri farklılaşmasını ya da erken yaşlanmayı geçmesi neden olabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, basit ve ucuz olan "kesme" olarak adlandırılan bir otomatik mekanik pasajı bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, tek bir hücre içine, kimyasal ya da enzimatik ayrışma önler ve bunun yerine sabit bir hücre / hücre teması muhafaza süspansiyon, küremsi kültürlerin büyük ölçekli bir genişleme sağlar. Doğrama yöntem öncelikle fetal beyin kaynaklı nöral progenitör hücreleri veya neurospheres süredir kullanılan ve son zamanlarda embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen nöral kök hücreler ile kullanım için yayımlanmıştır. Prosedür involves bir doku kültürü Petri kabı üzerine neurospheres tohumlama ve sonradan etkin elle mekanik olarak her küre Ayrıştırıcı sıkıcı sürecini otomatize hücreleri aracılığıyla keskin, steril bir bıçak geçirerek. Kültür içinde hücreleri süspansiyon uygun bir yüzey alanı-hacim oranı sağlar; 500.000 'den fazla hücre çapı en az 0.5 mm, tek neurosphere içinde yetiştirilebilir gibi. Bir T175 bir şişe içinde, 50000000 fazla hücreleri sadece 15000000 yapışık kültürlerinde göre süspansiyon kültürlerinde büyüyebilir. Önemlisi, kıyma prosedür klinik dereceli hücre ürünlerin kütle miktarı üretimine izin veren, güncel iyi üretim uygulamaları (cGMP) altında kullanılmıştır.

Giriş

Bir tek tabaka ^1-3 veya toplam neurospheres ^4-7 ya gibi kültür kemirgen sinir kök hücreleri genişleyen uzun bir geçmişi vardır. Buna ek olarak, gelişmekte olan merkezi sinir sisteminin ^8-17 çeşitli bölgelerinden izole insan nöral progenitör hücrelerin (hNPCs) in vitro genişletilmiştir. Bu hücreler iki güçlü, astrositlerde ve nöronlar hem de farklılaşma yeteneğine sahiptirler ve nöral gelişme ^18,19 ve hastalık mekanizması ^20,21 okuyan çok yararlı bir araç olmuştur. hNPCs ayrıca entegrasyon, hayatta kalma ve fonksiyonel etkileri ^22-24 çeşitli düzeylerde ile santral sinir sistemi hastalığı birçok farklı hayvan modellerinde naklediliyor edilmiştir.

Genellikle epidermal büyüme faktörü (EGF) ve / veya fibroblast büyüme faktörü-2 ^{(FGF-2), 25-28} - - ve yapışkan ²⁹ ve hem de üç Geleneksel olarak, kemirgen ya da insan fetal NPC-türevi büyüme faktörleri maruzBoyutlu küremsi sistemleri tipik olarak bir tek hücre süspansiyonu halinde ^30-34 enzimatik ayrılma ile pasajlanır. Araştırma ya da klinik kullanım için hücreleri genişletmek için bir standart yöntem kolay manipülasyon nedeniyle yapışkan bir tek tabaka olduğu gibi. Bununla birlikte, enzimatik veya kimyasal çözeltiler ile pasajı tek tabaka ve neurosphere hNPCs erken yaşlanma ³⁵ ile sonuçlandığını göstermiştir. Buna ek olarak, enzimatik ayrışma embriyonik kök hücreler ^36-38 ile gösterilen verilere dayalı olarak farklılaşma ve kromozomlarda anormallikleri artan seviyeleri ile sonuçlanabilir. Pasajlanması hNPCs standart yöntem mevcut iyi imalat uygulamaları fazına 1 klinik çalışmalarda (Hücreler Inc, Neuralstem Inc Stem) gitti (cGMP) sınıf ürünler üretti rağmen, yöntem sınırlayıcı, hücre büyütme sadece birkaç mermi izin potansiyeli bankacılık.

Açıkçası, büyük araştırma deneyleri ve gelecekteki klinik denemeleri yeteneği yararlanabilecekbüyük ölçekli büyüme ve hücre bankacılığı izin toplu olarak ve gecikmeli yaşlanması ile hücreleri yaymak. Bu ihtiyacı karşılamak için, hücre-hücre teması korumak için küçük kümeler halinde onları "kesme" bir roman ve mekanik Pasajlanması bozulmamış neurospheres otomatik bir yol geliştirdi. Bu yöntem büyük bir alternatif 3 boyutlu biyoreaktör kültürü yöntemi ⁴⁰ ile görüldüğü gibi bunların ömrü ³⁹ ve süspansiyon kültürü, tek tabakalı kültürler ile karşılaştırıldığında kuluçka alanı daha verimli kullanımına izin verir artmıştır. Resim kıyma protokol geçişi 10, standart yöntemler kullanılarak bir pasajı olası bir feat daha büyük bir fetal numuneden büyük ölçekli bankaların üretimine olanak sağlamaktadır. Pasajı hNPCs için bu yöntem alışılmamış iken, popülaritesi artmaktadır ve yakın zamanda, bu tür insan embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen nöral kök hücreleri gibi diğer hücre tiplerinde, v dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş ölçekli bir genişleme sağlayan yayınlanmıştıritro hastalık modelleme ^41-46. Daha da önemlisi, bir cGMP dereceli hNPC hücre bankası zaten tekniğin gelecekteki klinik uygulamalar karşı uygulanabilir olduğunu gösteren, kesme yöntemi ile üretilmiştir.

Protokol

1.. Etik Beyanı ve Güvenlik

1. Bu prosedür, insanlardan veya hayvanlardan elde edilen hücre kültürü ürünleri kullanımını gerektirir. Türetilen tüm dokular uygun Kurumsal Değerlendirme Kurulu (ler) ve / veya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (ler) tarafından kullanımdan önce onaylanması gerekir.
2. Bütün biyo-tehlikeli atıklar, ilgili kurum tarafından kararlaştırılan güvenlik yönetmeliklerine uygun olarak imha edilmelidir. Bilmek ve bu işlem boyunca münasip güvenliği ve atılması tüm kurallara uyun.

Ekipman 2. Hazırlanması, Malzemeleri, Reaktifler ve Gözlemler

1. Hazırlık
   1. Bir cam Petri kabı, 8.5 cm filtre kağıdı çevreleri ve çift-kenar hazırlık bıçakları edinin.
   2. Petri kabındaki bir filtre kağıdı parçası koyun ve Petri kabındaki filtre kağıdı üzerine birkaç kılıfsız bıçakları aktarın.
   3. Petri kabı kadar tekrar tekrar tabaka filtre kağıdı ve bıçaklar kabaca% 75 dolu, kapak zekâh Petri kapağı ve otoklav. Sterilliği korumak için bir steril ya da kapalı bir ortamda saklayın.
   4. Otoklav 18 cm forseps ve sterilizasyon kese içinde bir otoklavlanabilen somun sürücü. CGMP üretimi için, sterilizasyon torbalar çeşitli paslanmaz çelik şim diskleri otoklav. Şim diskin ilgili daha fazla bilgi için, adım 3.5 'e bakınız.
   5. % 70 izopropil alkol (IPA) ile biyo-güvenlik kabini (BSC) sterilize.
   6. Bütün prosedürler sterilliği korumak için, bir BSC gerçekleştirilmelidir. Aseptik BSC aşağıdaki transferi:
      1. McIlwain Doku Chopper (kıyıcı). % 70 IPA, özellikle helikopter kolu (Şekil 1B) ile tüm yüzeylerini silin. Tüm kıyıcı gerekirse, etilen oksit kullanarak dekontamine edilebilir.
      2. Bir Otoklavlanmış somun sürücüsü veya fındık anahtarı (kıyıcı, Şekil 1I dahil), bir 18 cm forseps, standart ölçü Mikropipetler (20 ul-1, 000 ul), bir pipetaid ve tüp rafları bir set.
      3. Steril tek serolojik pipet, bariyer pipet uçları, 15 ml konik tüpler, 60 mm Petri kapları, çift kenar hazırlık bıçaklar ve uygun büyüklükte T matara. DİKKAT: Yalnızca bir forseps ile keskin bıçakları ele.
2. Reaktifler
   1. 100, 10 ng / ml 'de ng / ml ve lösemi inhibitör faktörü (LİF) ya da hücre genleşme maddesi, EGF Stem Nöral oluşan bakım Media (MM) içinde hNPCs aç. BSC içine ortamını hazırlamak için gerekli reaktifler ve filtrasyon cihazı (ler) aktarın.
   2. Sinir Hücresi Büyüme Ortamı Kök ve en fazla 1 yıl boyunca -80 ° C'de saklamak için 100 ug / ml 'de alikotları hazırlamak kullanılarak liyofilize EGF yeniden askıya. 6 aya kadar veya üretici tarafından verilen son tarih için 4 ° C'de satın olarak LİF saklanır.
   3. BSC içine MM reaktif aktarın. Bir vakum cihazı kullanılarak uygun büyüklükte bir filtrasyon cihazı ile filtre tüm reaktifler birleştirin. Kadar 3 hafta boyunca 4 ° C'de depolayın.
3. hNPC Gözlemler
   1. Doğrama önce adresine en önemli iki faktör küre çapı ve medya klima veya renktir. Koşullu ortam (CM) kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 _CO2,% 95 rutubet) şartlar altında kültür hNPCs tarafından metabolize edilmiş ortamı olarak tanımlanmaktadır. Hücreler medyayı metabolize olarak fenol kırmızı bileşen bir daha asidik bir ortam (Şekil 5D) simgeleyen sarı renk bir pembe kayacak.
   2. (Ayrıntılar için bakınız tartışma) medya rengini gidermek için ışığa kadar hNPCs bir balon (ler) tutun.
   3. Hücreleri gözlemlemek için bir mikroskop ile şişe içinden tarayın. Küre boyutunu incelemek için bir retikülü kullanın. Birçok küreler 300 um'lik veya daha büyük bir çapa sahip ise, kesme işlemi ile devam edin. Her 7-10 gün hücreleri doğrayın.
   4. Bir pirzola garanti değilse, taze medya her 3-4 gün hücreler medyayı metabolize edilir ne kadar hızlı bağlı olan CM değişimi% 25-75. Aleyhteküreler geçişi için yeterince büyük olana kadar ortam değişimi için devam ediniz.
   5. hNPCs genel olarak daha küçük şişelerden daha büyük şişeler için, 1:2 'lik bir oranda doğranır. Şişeyi boyut ve hacim önerileri için bir başvuru kılavuzu olarak Tablo 1 kullanın.

Cep şişesi	Toplam medya hacmi	Pre-Chop	→	Post-Chop
1 T12.5	5 mi	1 T12.5	→	1 T25
1 T25	10 mi	1 T25	→	1 T75
1 T75	20 mi	1 T75	→	1 T175
1 T175	40 mi	1 T175	→	2 T175s
80 mi	2 T175s *	→	4 T175s
* 2 T175s bir anda doğranmış olabilir matara maksimum sayıdır. 2 T175s setler halinde doğrayın ve 7. adıma bakın.

2 T175s

Tablo 1. HNPC genişletme paradigma. HNPCs için tipik bir genişleme düzeninin açıklaması. Her 7-10 gün hacimsel iki kat genişletmek için standarttır.

3.. Chopper Kurulum

Şekil 1.. McIlwain Doku Chopper. A)) Petri kabı, D plaka tutucuya Hook kalınlık ayarı mikrometre, B) Chopper kol tabanı ve bağlı kol, C) doğrayın Tablo bırakma düğmesi ve tepsiKıyıcı, J) Blade / toka somun, K) Blade toka, L ile birlikte, E) Blade kuvvet kontrol düğmesi, F) Sıfırlama anahtarı, G) Plaka sahibi, bıçak, toka ve somun H) Bolt eki I) Somun anahtarı ) Otomatik kesme hız kontrol düğmesi, M) Manuel doğrama kol çalıştırma düğmesi, N) Güç anahtarı.

1. BSC bir prize takın helikopteri ve güç anahtarı (Şekil 1N) açın. 200 mikron (Şekil 1A) için kesme uzaklığını ayarlayın. Topuzu bir saat (Şekil 1E) ise 270 ° ya da 9:00 bıçak kuvvet ayarlayın. Otomatik hız topuzu kadar saat yönünün mümkün döndürülmüş olduğunu onaylayın. (Şekil 1 L).
2. Sağa şekilde tüm tablo serbest hareket plaka tutucu (Şekil 1D) stabil olduğunu onaylayın.
3. Manu döndürmekEl kol manipülatör maksimum düzeyde (Şekil 1M) için kolunu yükseltmek için saat yönünde. Manuel kol manipülatör sadece döndürülmüş saat yönünde olması gerekir.
4. Aseptik bir çift forseps (Şekil 1H) kullanarak helikopter kolu cıvata üzerine steril, çift taraflı doğrama bıçağı aktarın.
5. Yalnız Petri araştırma dereceli işleme için yeterli olduğu gibi, sadece cGMP geçiş için bu adımı tamamlayın. Adım 2.1.4 belirtildiği gibi, Petri çanağı tabanının içine yerleştirilen dolgu cGMP diskleri için gereklidir. Şim disk kesme işlemi sırasında küreler içine birleşmeyle gelen plastik cam kırıklarını önler. Planlanan her pirzola, her Petri kabı ve kapak tabanına bir şim disk transfer.
6. Aseptik forseps kullanarak bıçak üzerinde toka (Şekil 1K) yerleştirin. Toka kavisli kısmı, kolun üst kenarı üzerinde olmalıdır. Somun güvenli moda olmuştur kadar toka kol üzerinde kalmayacaktır. Clas tutmak için forseps kullanınp koluna ve steril somun sürücüsü ile cıvata üzerine somunu (Şekil 1J) sabitleyin. Soyunursa ¼ somun a bırakın.

4. Pre-pirzola Prosedürü

1. Tablo 2, Sütun C başına yeni bir balona (ler) içine MM önerdi hacmini aktarın.
2. Aseptik BSC içine inkübatör hücreleri aktarın. Bir tüp raf (Şekil 2A) üzerine balon (ler) yalın ve küreler şişeye (ler) yerleşmek için izin verir.
3. Bir kez kurulmuş, 5 ml veya 10 ml serolojik pipet ile süpernatanın 12 ml kadar aspire ve şişeye (ler) yüzeyinden tüm gevşek yapışkan alanları yıkayın. Gerektiği kadar tekrarlayın ve durulama aralarında küreler yerleşmek.
4. İki veya daha fazla T175 şişeleri pasaj durumunda. Tablo 2, Sütun D'ye göre, yeni bir şişe (ler) içine CM önerilen ses aktarma aşamasını 7.1.
5. Yeni bir 15 ml konik tüp içine kalan tüm CM ve küreler aktarın. Küreler se verttle ve kullanılan balon (ler) atın.
6. Kritik Adım: Yavaş 60 mm Petri kabı veya düşük mümkün hacminde takoz diske 15 ml konik tüp küreleri aktarmak; 0.1-0.5 ml (Şekil 2B) tavsiye edilir. Bu çanak sonrası pirzola gelen hücreleri yıkamak için kullanılacak gibi CM kalan hacmi tutun. Çanak (Şekil 2C) medya ve küre ile kaplı yüzey alanını en aza indirmek için deneyin.

Şekil 2). Şişe. B köşesinde küreler yerleşmek Petri konik tüp yoğun mümkün olduğunca küreler Transfer için bir tüp raf veya benzer bir madde karşı balon (ler) Yalın. A) doğrama için Sphere hazırlık çanak. C) t konik tüp küreleri Poolo Petri kabı. D orta) toplanmış kürelerin üst mümkün olduğunca süpernatantı. E)), bir plastik mikropipet ucu. F yan kullanılarak küreler yayın yavaşça havuzun bir tarafında küreler taşımak . medya çıkarılmasını kolaylaştırmak için havuzun bir tarafına taşındı küreler G) Örnek. H) Yoğun küreler doğrama hazır Petri kabı, üzerinde yayılmış. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

7. Daha sonra, küreler aşama 4.6 üzerinden aktarılır süpernatant kaldırarak kondanse edilmesi gerekir. Bir aerosol bariyer uçlu mikropipetöre (Şekil 2B) ile geriye 15 ml konik tüp içine süpernatant aktarın, kürelerin kaldırılmasını önlemek. Ortam / hücre havuzu üstünden mümkün olduğunca medya kaldırarak başlayın. Bu mümkün olmadığındaküreler olmadan ortamı çıkarmak için, aşağıdaki adıma geçin.

Sütun A		Sütun B	Sütun C	Sütun D	Sütun E	Sütun F
Pre-Chop Ebatı	→	Post-Chop Flask (ler) Boyut	Yeni bir balona (ler) pre-kes aktarmak MM Önerilen hacmi	Yeni bir balona (ler) pre-kes aktarmak CM Önerilen hacmi	Yeni bir balona (ler) post-pirzola içine aktarmak için küreler medya / Önerilen hacmi	Nihai hacim Tohumlu / Flask
T12.5	→	T25	5 mi	0 mi	5 mi	10 mi
T25	→	T75	10 mi	0 ml	10 mi	20 mi
T75	→	T175	20 mi	10 mi	10 mi	40 mi
1 T175	→	2 T175s	Kap başına 20 mi	Kap başına 15 mi	Kap başına 5 ml	40 mi
2 T75s	→	4 T175s	Kap başına 20 mi	Kap başına 17.5 mi	Kap başına 2.5 mi	40 mi

Tablo 2.. Medya aktarma kılavuzu öncesi / sonrası doğrayın. Önerilen hacimleri kesme işlemi sırasında kullanmak için.

8. Yüzey alanı (Şekil 2E) artırmak için pipet ucu yan kullanılarak havuz yayıldı.
9. Kritik Adım: kendinize doğru hafifçe Petri İpucu ve hafifçe sl pipet ucu tarafını kullanınhavuz (Şekil 2F, G) bir tarafına kürelerin her ide.
10. Kritik Adım: tüm hücreleri taşındı zaman, yavaş yavaş petri ters yöne devrilebilir. Bu süreç sırasında, tek başına ortam uzak alanlarda akacaktır. Geri 15 ml konik tüp içine medya aktarın. Minimal küre kaldırma kabul edilebilir.
11. Yavaşça böylece havuz 0,5-2,4 cm (Şekil 2H) bir çapa sahiptir geri Petri kabı merkezine kürelerin her kaymasına pipet ucunun yan kullanın. Bu küre havuz sığ derinliği tutmak önemlidir. Havuz çok derin ise, küreler sadece kıyma esnasında kenara itilmiş olacaktır. Not: küre havuzunun çapı 2.5 cm 'den daha büyük olamaz veya bıçak hücreleri eksik, Petri kabı kenarlarını temasa geçecektir.

5.. Chop Prosedürü

1. Plaka tutucu (Şekil 1G) üzerine Petri aktarın ve çanak sağlamakplaka tutucu kanca (Şekil 1C) altında sabitlenir.
2. Tablo bırakma topuzu o vitese uyacak çentikler vardır. Böylece bıçak küre açıktır ve dişli (Şekil 1D) kilitli sola plaka yuvasını kaydırın için tablo serbest bırakma düğmesini kullanın.
3. Kritik Adım: bıçak Petri kabı üzerine aşağı düz oturana kadar saat yönünde manuel manipülatör topuzu (Şekil 1M) çevirerek helikopter kolu indirin. Nutdriver ile somunu sıkarken kol montaj (Şekil 1B) üzerine bastırın tek bir elinizi kullanın.
4. (Şekil 1F) bir kere reset düğmesine basın. Topuzu bir saat ise 90 ° pozisyonunda veya 12:00 otomatik kol manipülatör topuzu (Şekil 1L) saat yönünde dönerken tek elle Petri sürekli. DİKKAT: uzakta her zaman hareket bıçaktan parmaklarınızı tutun.
5. Kürelerin havuzu ile tam bıçağı geçirin. Plaka tutucusunu döndürmek90 °.
6. Cıvatasını gevşetin ve adımı 5.3-5.5 tekrarlayın.
7. Aseptik BSC bir çalışma alanı üzerine plakası sahibinin Petri aktarın.

6. Post-pirzola Prosedürü

1. Prime daha sonra bir 10 ml serolojik aşama 4,6 konik bir tüp içinde CM ile pipet ve kıyılmış küreler üzerine 1 ml aktarın. Yavaşça yeniden askıya alma ve yeni bir 15 ml konik tüp içine aktarın. Kabarcıklar önlemek ve doğranmış küreler toplamak için gerekli olduğu kadar birçok kez tekrarlayın.
   İPUCU: plastik parçaları kaldırın olabilir çanak kazıma en aza indirin. Bu paslanmaz çelik takoz diskleri kullanarak bir endişe değildir. Plastik serolojik pipet içine takılarak hücrelerin sakının. Bu durumda, aspire kabarcıklar aralıklı pipet medya aracılığıyla hücreleri ayırmak için.
2. CM hacmi ve doğranmış küreler ölçün. Tablo 2'de listelenen hacim, Sütun E elde etmek için MM uygun hacim.
3. ÇiğnemekHerhangi bir gevşek erimiş küreler kırmaya 2-3x küreler.
4. Kritik Adım: Her yeni bir balona küre süspansiyon kısım. Sadece bir defada bir balona küre süspansiyonu transfer ve transfer arasında küreler yeniden askıya. Aynı anda birden fazla şişeleri aliquoting her bir şişe içinde küreler orantısız bir dizi ile sonuçlanır. Her bir şişe içinde nihai hacmi, Tablo 2, Sütun F birimleri eşit olmalıdır. 'Den daha büyük, iki T175 Şişelere konmadan zaman adım 7.2 bakınız.
5. Fındık sürücü ve steril forseps ile daha sonra toka ile somunu sökün. % 70 IPA veya eşdeğeri uygun dekontamine. DİKKAT: Yalnızca bir forseps ile kullanılan doğrama bıçağını çıkarın ve bir biyo-tehlike kesici kapta atın.
6. % 70 IPA ile helikopterde tüm yüzeyleri dezenfekte.

. 7 Proses Çeşitlemeler - Çoklu matara

İkiden T175s pasaj çeşitli farklılıklar vardır. AdımAşağıdaki s başvurulan aşamasının değişiklikler bulunmaktadır.

1. 4.4 adıma Referanslar:
   1. İki T175s pasaj zaman, bir T175 şişeler içine medya ve küre tüm birleştirmek. Tablo 2'de belirtildiği gibi küreler yeni şişelere her birine CM uygun hacmi yerleşmek ve daha sonra bir kısım izin verin, sütun D. Aşama 4.5 'e geçin.
   2. Den daha fazla iki T175s pasaj zaman, CM şişeye olarak yeni T175 şişesi ve etiket elde edin. Komple adım 7.1.1 ama CM balona CM aktarın. Bütün şişeler kıyılmış kadar bütün şişelerden CM toplamak için kullanılacak BSC tarafında şişe saklayın. Sonra CM eşit yeni şişelere her içine örnek olacaktır.
2. Referans adım 6.4 - aynı hücre hattını birden çok kez doğrama, yeni bir T75 şişesi etiketli küreler post-pirzola içine doğranmış küre süspansiyonu transfer ve transfer hacmi rekor. Bu hücrelerin bir araya devamHer şişeye pirzola sonra ve 37 ° C'de,% 5 _CO2,% 95 nemde inkübatör şişeyi saklayın. Tüm eti tamamlandıktan sonra, her yeni bir şişeye hacmindeki küre süspansiyon kısım. 6.5 adıma geçin.

8. Kryoprezervasyon

Aşağıdaki protokol kriyojenik hNPCs korumak içindir.

1. 37 ° C de bir temiz su banyosu içinde hücre donma orta çözülme ve daha sonra buz üzerinde saklayın. Hücre ortamı, donma kadar 6 ay boyunca parçalara ayrılmış ve -80 ° C'de ˚ saklanabilir.
2. Bir alev pipetlemeyin açılmasını çevirerek lehçe cam Pasteur pipetlerini ateş. Hazırlayın büyük ve iki küçük delik yangın cilalı pipetler (Şekil 3), en az iki. Küreler Büyük küçük kalibreli pipetleri taşıyarak ayrışmış olacak.
3. 5 dakika boyunca 37 ° C'de su banyosunda TrypLE Seç yerleştirin. Çıkarın ve kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında tutulması.

Şekil 3. Yangın-parlatma cam Pasteur pipetler. A) için geniş çaplı yangın parlatılmış cam pipet ve eşit olarak cam pipet kenarları yuvarlak. B) Örnek olarak alev ve spin üst kısmında pipetlemeyin tutun. küçük çaplı bir yangın parlatılmış cam pipet C) Örnek.

4. Aseptik BSC içine neurospheres aktarın. Küreler bir tüp raf karşı balon (ler) yaslanmış tarafından yerleşmek ve herhangi gevşek yapışık küreler kaldırmak için şişenin dibini durulayın izin verin. Küreler yeniden yerleşmek için izin verin.
5. Steril şişe içine CM her ancak 5-10 ml transferi ve toplam hacmini ölçün. Konik bir tüp içine, geri kalan küreler ve ortam yerleştirin.
6. Tüm hücreler yapıldıktan sonra, şişeye CM küçük bir menisküs ama aktarmak ve vol summateume.
7. Aseptik transferi konik tüp içine ısıtılmış TrypLE Select 5-10 ml ve yeniden askıya hücre pelet. 15-20 dk için 37 ° C su banyosu içine konik tüp aktarın. 7.5-10 dakika sonra hafifçe konik tüp karıştırmak için sallayın.
8. Aşama 8.5 ölçülen CM ve MM hacmini kullanarak eşit hacimde hazırlanır. 50% CM ve% 50 MM solüsyonu (CM / MM çözelti) birleştirin ve filtre.
9. Aseptik bir 50 ml konik tüp içine 40 mikron süzgeç transfer.
10. Kuluçka tamamlandıktan sonra, 100 x g de 15 saniye için 15 ml konik tüp dönerler.
11. Dikkatle aspire ve TrypLE Seç ve herhangi lifli tabakayı atın. Küçük bir menisküs bırakın. Pelet rahatsız değil iken kalan TrypLE Seç sulandırmak için CM / MM 4 ml - nazikçe 2. ekleyin. Herhangi bir yerinden hücreleri yıkama atmadan önce yeniden halledelim.
12. 2-5 ml CM / tüp kürelere MM solüsyonu ekleyin. 10x en fazla öğütülerek bir 5 ml pipet ile küreler ayrıştırmaları. BM izinayrışmış küreler 1-2 dakika dinlendirilir. Tam ayrışmamış kümeleri kaldırmak için 40 mikron süzgeç üzerine ayrışmış hücre süspansiyonu aktarın.
13. Bir yangın cilalı geniş çaplı cam pipet ve daha sonra küçük çaplı bir cam pipet ile adımı 8.12 tekrarlayın.
14. CM / AA çözeltisi 2-5 ml süzgeç durulayın.
15. Hücre süspansiyonu karıştırın ve canlılık analiz için numunelerin alınması.
16. Uygun bir seyreltme faktöründe tripan mavisi ile örnekleri sulandırmak ve saymak. Ortalama canlı hücre konsantrasyonunu hesaplamak ve toplam canlı hücreleri hesaplamak için aşağıdaki standart denklemi kullanın.
    
17. 5.0 x 10 ⁶ hücre / ml 'de yeniden askıya hücreler için gerekli hücre dondurma ortamının toplam hacmi hesaplayın. Hücre 1 ml her bir dondurarak saklama viali içine ekildi olacaktır. BSC içine kriyotüplerin aktarın.
18. 15 m, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjEn iyi verim için l konik tüpler. 50 ml konik tüp, aşağıya doğru büyük ölçekli bir dondurma için kullanılması halinde, 10 dakika boyunca 400 x g ile hızı ve süresi artar.
19. 5,0 x 10 ⁶ hücre / ml 'de, hücre dondurma ortamı kullanılarak hücre pelletini yeniden askıya. Her bir dondurarak saklama viali içine hücre süspansiyonu kısım 1 mi. Süspansiyonu ve 5 kısım cryovials x 1 mi eşit bir dağılımı, aspirat 6 ml için. Geri hücre havuza süspansiyonu geriye kalan 1 ml aktarın. Tüm küçük şişeler doldurulmuş kadar tekrarlayın.
20. Aseptik tüm seribaşı kriyotüplerin mühür ve 5-10 dakika süreyle buz üzerine aktarabilirsiniz.
21. İzopropil Alkol Odası: hNPCs korumak için dondurulması stratejileri için aşağıdakilerden birini kullanın
    1. Oda sıcaklığında% 100 IPA ile odasının gerekli sayıda (ler) doldurun.
    2. Oda (lar) içine buz tohumlanmış cryovials aktarın ve gece boyunca -80 ° C dondurucu içine bölmeyi (ler) aktarılır. Hücreler, ancak -80 ° C kadar bir hafta boyunca stabildirBu ertesi gün uzun süreli sıvı azot depolama şişeleri aktarmak için önerilmektedir.

    Kontrollü Oranı Dondurucu

    3. Kontrollü hız freezer yazılımına uygun bir dondurma programı yükleyin. Bir örnek programı Tablo 3'te listelenmiştir. Şekil 4, hNPCs için tipik bir dondurma eğrisini gösterir. Ancak, tam program her dondurucu model için değişecektir. Donma hızı olabilir -40 ° C, ulaşana dek en az -80 ° artmış, standart genel örnek oranı -1 ° C / dk yakın olmalıdır C.

Adım	Oranı (° C)	Uç Sıcaklık (° C)	Tut (dk sn)	Tetik
1	-	-	5 dk 0 sn	Oda
2	- 1.3	- 5	-	Örnek
3	-	-	1 dk 0 sn	Oda
4	- 45	- 58	-	Oda
5	+ 10	- 26	-	Oda
6	+ 3	- 23	-	Oda
7	- 0.8	- 40	-	Örnek
8	- 10	- 100	-	Oda
9	- 35	- 160	-	Oda

Tablo 3. Kontrollü r hNPCs dondurma adımlarıdondurucu yedik. Hızı kontrollü dondurucu üzerinde hNPC dondurulması için önerilen bir program.

Şekil 4. Örnek donma eğrisi. Hızı kontrollü dondurucu üzerinde hNPCs için tipik donma eğrisi.

21. 4. Kontrol oranı dondurucu ile ilişkili sepet içine buz kriyotüplerin aktarın. Yalnızca hücre ortam numune sıcaklık probu için kullanmak dondurma ile bir cryovial yüklemek için emin olun. Dondurma bölmesinin içine sepet transferi ve prob şişe içine örnek sonda yerleştirin. Programını başlatın.
    5. Protokol tamamlandığında, uzun süreli sıvı azot depolama içine şişeleri aktarın.

9. Çözülme Prosedürü

Aşağıdaki protokol eritme kriyojenik p içindirhNPCs saklıdır.

1. Derhal kuru buz üzerine sıvı azot depolama cryovials aktarın. DİKKAT: Flakon çatlak ya da sıvı azot flakon girmek için izin gevşek kapakları olabilir. Derin dondurucu koşullarda çıkarken, sıvı derhal şişeyi patlayan, kaynatın. Şişeleri çıkarırken uygun KKE kullanın.
2. Vaktinden aşağıdaki reaktifler ve malzemeleri tüm hazırlayın. Çözülme süreci başladıktan sonra, verimli üzerinden takip etmek önemlidir.
   1. Sinir Hücresi Genişleme Orta, MM, 15 ml konik bir tüp, bir 2 ml ve 10 ml BSC içine her cryovial için serolojik pipet Stem aktarın.
   2. Nöral 9 ml en az hücre genleşme maddesi Kök ve MM 5 ml her şişe için gereklidir. Gerekirse, her medya hazırlayın.
3. Sadece bir seferde hNPCs bir flakon çözülme. Temiz bir 37 ° C su banyosu içine, kuru buz, donmuş hücreleri transferi ve sürekli olarak bir su banyosunda şişeyi karıştırın. Hacmini Monitöreridi buz. Şişede kalan buz yaklaşık 0.5 cm'lik bir parça olduğunda, sprey ve% 70 izopropil alkol ile silin ve BSC içine aktarın.
4. 2 ml'lik bir pipet ile serolojik bir 15 ml konik tüp dondurarak saklamaya uygun vialler içeriğini aktarın. Boş kriyotüpe Hücre Genişleme Orta Kök Nöral 1 ml ekleyin ve sonra yavaş olarak çözülmüş hücreleri üzerine Hücre Genişletme Orta Kök Nöral 8 ml transferi, tüp hafifçe sallayarak ise akıllıca bir şekilde bırakın. Bu ozmotik şok riskini azaltmak için yapılır.
5. Hücre süspansiyonu 9 ml dondurarak saklamaya uygun vialler gelen durulama aktarın. Buz üzerine konik tüp transferi ve tekrar kalan tüm flakon için 9,4-9,5 adımları.
6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de konik santrifüj tüpleri Santrifüj sırasında, Tablo 4 göre tohumlama şişeler için uygun sayıda hazırlar.

Şişeler içinde	Toplam Tohumculuk Hacim (ml)	Cep şişesi
1	5	T12.5
2	10	T25
3	15	T75
4	20	T75
5	25	T75
6	30	T175
7	35	T175
8	40	T175
8 +	-	Şişeler kombinasyonu

Tablo 4.. Çözülmüş cryovials sayısına göre Matara boyutları. HNPCs sonrası çözülme tohum Önerilen hacmi ve şişe boyutu.

7. Yeniden askıya ve Tablo 4 dayalı MM uygun hacimde tüm tüpler birleştirir. Iyice karıştırın ve yenidencanlılığı sayımı için bir örnek hareket eder. Ayrıntıları sayma adımları 8,15-8,16 bakın. Standart tohumlama aralığı / cm ² 160,000-320,000 hücreler arasındadır.
8. De hücreleri karıştırın ve şişeler içine hücreleri alikosu. % 5 CO _2/37 ° C/95% nem inkübatör için şişeler aktarın. Nazikçe eşit hücrelerini dağıtmak için ileri geri sallayarak şişeyi karıştırın.
9. Hücreler 24-48 saat içinde küreler oluşturacak. Bazen hücreler plastik yüzeye yapışır ve bir bal peteği benzeri koloni dağıtım oluşturacaktır. Bu durumda, küre oluşumuna yardım, gevşek hücreleri durulama 3 gün için hücreler bırakın. Hiçbir yapışık hücre kadar her 1-3 gün durulayın. Yeni bir şişeye gerekli aktarma hücreler ise.
10. Döviz MM ile medyanın her 3-4 gün% 25-75 hücreler, genellikle 7-14 gün sonrası çözülme doğrayın hazır olana kadar.

Sonuçlar

P19'un de donduruldu hNPCs Şekil 5. Temsilcisi veri. A) Öngörülen hücre sayıları, sonra çözülmüş ve kesme yöntemi ile pasajlanır neurospheres karşılaştırıldığında enzimatik ayrılma kullanarak yapışık tek tabaka olarak genişletti. Hücreler p20 eritildi edildiğinde Gün 0 gösterir. B) küreler Temsilcisi görüntüleri ön pirzola, küreler post-pirz...

Tartışma

Şekil 6.. Doğrama şematik. Mekanik kesme yöntemini kullanarak kültür içinde sfero kök / progenitör hücreler genişletilmesi.

Kritik Adımlar

Kıyma genişleme paradigmasının bir bakış. HNPC küre boyutu neurospheres pasaj önce gözlemlemek için önemli kriterlerden biridir Şekil 6'da gösteri...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Beher, 50 ml	Fisherbrand	FB-100-50	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Biyo-Güvenlik Kabini, sınıf II	Baker	SG-603A	4 ft veya 6 ft. model.  6 ft. model önerilir; birden fazla üretici/tedarikçi
Bıçaklar, Çift Kenarlı Hazırlık	Personna	74-0002	birden fazla üretici/tedarikçi.  DİKKAT: Keskin
Hücre Dondurma	Ortamı Sigma-Aldrich	C6295-50ML	DMSO, serumsuz
Santrifüj, 15 ml uçlu döner kova	Eppendorf	5810 R	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Konik Tüpler, 15 ml	Fisherbrand	S50712	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Konik Tüpler, 50 ml	BD Falcon	352074	birden fazla üretici/ Tedarikçiler
Kontrollü Hız Dondurucu	Planya	Kryo 750	çoklu üreticiler / tedarikçiler
Cryovials, 2 ml	Corning	430488	birden fazla üretici/tedarikçi
Kültür Şişesi, Havalandırmalı, T12.5	BD Falcon	353107	birden fazla üretici/tedarikçi
Kültür Şişesi, Havalandırmalı, T25	BD Falcon	353081	birden fazla üretici/tedarikçi
Kültür Şişesi, Havalandırmalı, T175	BD Falcon	353045	birden fazla üretici/tedarikçi
Kültür Şişesi, Havalandırmalı, T75	BD Falcon	353110	çoklu üreticiler / tedarikçiler
Filtre, 0.22 ve mikro; m, ekli kap, 1 L	Millipore	SCGPU11RE	birden fazla üretici/tedarikçi
Filtre, 0.22 ve mikro; m, ekli kap, 150 ml	Millipore	SCGVU01RE	birden fazla üretici/tedarikçi
Filtre, 0.22 & mikro; m, ekli kap, 500 ml	Millipore	SCGPU05RE	birden fazla üretici/tedarikçi
Filtre, 0.22 & mikro; m, ekli kap, 50 ml	Millipore	SCGP00525	birden fazla üretici/tedarikçi
Filtre Kağıdı, 8,5 cm daireler	Whatman/GE	1001-085
Forseps, Standart Desen - Tırtıklı/Kavisli/18 cm	Güzel Bilim Araçları	11001-18
Dondurma Odası, İzopropil Alkol	Nalgene	5100-0001	"Mr. Frosty"
İnkübatör, 37 > C/5% CO2	Forma	370 serisi	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Hematitometre, Phase	Hausser Scientific	1475	çoklu üreticiler/tedarikçiler
McIlwain Doku Doğrayıcı	Lafayette Aletleri	TC752-PD	Petri kabında değişiklik yapılması gerekiyor.   DİKKAT:  Hareketli, keskin bıçak.
Mikropipetör, 1-10 & mu; l	Gilson	F144562	birden fazla üretici / tedarikçi
Mikropipetör, 100-1.000 μ l (başlangıç kiti)	Gilson	F167700	birden fazla üretici/tedarikçi
Mikropipetör, 2-20 & mu; l (başlangıç kiti)	Gilson	F167700	birden fazla üretici/tedarikçi
Mikropipetleyici, 20-200 & mu; l (başlangıç kiti)	Gilson	F167700	birden fazla üretici/tedarikçi
Somun Sıkma, Otoklavlanabilir, 5/16"	Steritool	10302
Pasteur Pipetler, pamuk tıkalı	Fisherbrand	13-678-8B	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Petri Kabı, Cam, Otoklavlanabilir	Corning	3160-100
Pipet Yardımı	Drummond	4-000-101	birden fazla üretici/tedarikçi
Şim diski	McMaster-Carr	DEĞİŞKEN	birden fazla üretici/tedarikçi
Steril bariyer pipet uçları, 10 μ l	AvantGuard	AV10R-H	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Steril bariyer pipet uçları, 1.000 μ l	AvantGuard	AV1000	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Steril bariyer pipet uçları, 20 μ l	AvantGuard	AV20-H	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Steril bariyer pipet uçları, 200 μ l	AvantGuard	AV200-H	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Steril Tek kullanımlık pipetler, tamamen plastik sargı, 10 ml	Fisherbrand	13-676-10J	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Steril Tek kullanımlık pipetler, tamamen plastik ambalaj, 2 ml	Fisherbrand	13-675-3C	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Steril Tek kullanımlık pipetler, tamamen plastik ambalaj, 25 ml	Fisherbrand	13-676-10K	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Steril Tek kullanımlık pipetler, tamamen plastik sargı, 5 ml	Fisherbrand	13-676-10H	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Sterilizasyon Torbaları, 19 x 33 cm	Crosstex	SCL	çoklu üreticiler/tedarikçiler
Süzgeç, 40 & m	BD Falcon	352340
Doku Kültürü Kapları, 60 mm	BD Falcon	351007
Tüp Rafları, Birbirine Kenetlenen Dört	Fisherbrand	03-448-17
fazla üretici/tedarikçi	S52602Q	Su Banyosu	Fisherbrand
Nöral Progenitör Hücreye Özgü İşleme Reaktifleri
Nöral Kök Hücre Genişleme Ortamı (Stemline)	Sigma-Aldrich	S3194-500ML	Stemline markasını kullanmak için önemlidir
Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)	Millipore	GF316	birden fazla üretici/tedarikçi
Rekombinant İnsan Lösemi İnhibitör Faktörü (LIF)	Millipore	LIF1010	birden fazla üretici/tedarikçi
Tripan Mavisi (%0,4)	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	çoklu üreticiler/tedarikçiler
TrypLE Select (1x)	Life Technologies	12563-011