RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

Özet

Virüs çoğaltma ölçmek için in vitro deneylerinde önemli ölçüde lusiferaz veya biyolüminesans edebilen diğer enzimleri ifade eden rekombinant RNA virüslerinin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir. Burada ayrıntılı kızamık ve kimyasal kütüphanelerden geniş spektrumlu antiviral izole etmek Chikungunya virüsler, rekombinant suşlar birleştiren bir yüksek verimli tarama hattını.

Özet

RNA virüsleri gibi grip, bronşit, dang, Hepatit C ya da kızamık gibi önemli insan hastalıkları sorumludur. Ayrıca, çünkü daha doğal ekosistemlerin nüfuz artan dünya çapında değişim ve insan nüfusu yükselen bir tehdit oluşturuyor. Böyle yükselen bir duruma iyi bir örnek Hint Okyanusu'nda 2005-2006 arasında chikungunya virüsü salgın olduğunu. Viral replikasyonu kontrol hücresel yolların anlayışımızda son gelişmeler konakçı hücre fonksiyonlarını hedefleme bileşikleri, daha doğrusu virüsün kendisinden daha, RNA virüsleri büyük bir panel inhibe olabileceğini düşündürmektedir. Bazı geniş spektrumlu antiviral bileşikler, ana hedef odaklı deneyleri ile tespit edilmiştir. Ancak, hücre kültürlerinde viral replikasyonun inhibisyonunu ölçen bir gösterge olarak sitopatik etkileri azaltma kullanarak yine çok önemli bir tarama stratejisi temsil eder. Bu gibi fonksiyonel ekranlar çok raportör ifade eden rekombinant virüslerin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir ca enzimlerilüsiferaz gibi bio-ışıldamanın palpe edilebilir. Bu raporda, ayrıntılı bir geniş spektrumlu anti-viral profili olan bileşikleri tespit etmek, yeniden birleştirici kızamık ve hücre canlılığı deneyleri ile Chikungunya virüs birleştiren bir yüksek verimli tarama boru hattı.

Giriş

RNA virüsleri, insan enfeksiyonlarına çok çeşitli sorumludur, hem halk sağlığı ve ekonomik maliyet açısından dünya nüfusu üzerinde büyük bir etkisi var. Etkin aşıların pek çok insan RNA virüslerine karşı geliştirilmiş ve yaygın olarak profilaktik tedavi olarak kullanılır. Ancak, RNA virüs enfeksiyonlarına karşı tedavi edici ilaçların önemli bir eksikliği var. Gerçekten de, verimli bir aşı, dang virüsü, Hepatit C virüsü ya da insan solunum sinsisyal virüsü (hRSV) gibi büyük, insan patojenlerine karşı mevcut değildir. Ayrıca, RNA virüsleri, çünkü küresel değişim ve ekolojik sistemler üzerindeki insan etkisi sıklığı arttı ortaya çıkan hastalıkların bir çoğunluğu sorumlu....

Protokol

Bileşikler ile 96 oyuklu kızı Plakaların 1. Hazırlanması

1. Oda sıcaklığına kadar -20 ° C DMSO kimyasal bileşiklerin 10 mM stok çözeltileri ihtiva eden 96 oyuklu plakalar ana hareket ettirin. Seyreltik bileşikler, 2 mM'de orta 96 oyuklu plakalar seyreltme elde etmek üzere DMSO içinde 5 kat. Seyreltme DMSO içinde 20 ul içine 5 ul pipetleme ve karıştırılarak elde edilir.
2. Pipet beyaz, bar kodlu doku kültürü, 96 oyuklu plakaların kuru kuyu içine seyreltme plakalarından 1 ul. Kız plakalar (D1) bu ilk set 20 uM nihai konsantrasyonda bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılacaktır. -20 ° C'de kullanıma kadar saklayın kızı plakalar. <....

Sonuçlar

Bu tarama hattı PD çoğalmasını önleyen bileşiklerin seçimi ilk dayanır ve önemli bir hücresel toksisite (Şekil 1, birinci ekranı) göstermezler. Bu, hücre toksisitesi ve viral replikasyonun inhibisyonunu belirlemek üzere lusiferaz bazlı deneylerde yararlanır. Tüm adımlar, pipetleme ve veri toplama bir robot platform ile, bir yüksek verimli bir ortamda gerçekleştirilebilir.

Bileşiklerin hücresel toksisite, metabolik olarak aktif hücrelerin karşılık mevcut ATP, ve nicelenmesine.......

Tartışma

Burada açıklanan tarama hattı RNA virüslerinin geniş spektrumlu inhibitörleri olarak uygun bir profili olan bileşiklerin seçilmesi amaçlamaktadır. 10000 bileşiklerinin bir kütüphane bu protokol ve belirtilen kriterleri filtreleme uygulanmıştır ile tarandı zaman,% 75, 40 bileşikleri (% 0.4) daha üstün PD replikasyonunun inhibisyonu, yani pozitif attı. Bunun yanı sıra, bunların yaklaşık yarısı lusiferaz tabanlı canlılığı deneyde bir toksisite göstermiştir ve bu nedenle göz ardı edilmiştir. Son olarak, büyük bir m.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Freedom EVO platformu	TECAN		Robotik platform
96 oyuklu polistiren hücre kültürü mikroplakaları, beyaz	Greiner Bio One 655083
CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Canlılık Testi	Promega	G7570	Luciferaz bazlı canlılık testi
Bright-Glo Luciferase Test Sistemi	Promega	E2610	Ateşböceği lusiferaz içeren reaktif substrat
Renilla-Glo lusiferaz Test Sistemi	Promega	E2710	Renilla lusiferaz substratı içeren reaktif
Britelite artı Reporter Gen Test Sistemi	Perkin-Elmer	6016761	Firefly lusiferaz substratı içeren Reaktif. Lusiferaz aktivitesini belirlemek için Brigh-Glo reaktifine alternatif olarak kullanılabilir.