Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi
Bu makalede
Özet
Özet
Birden fazla alt-hücresel organellere tek bir hedef protein için, bitkiler tipik olarak, ilgili genleri çoğaltmak ve diferansiyel promoterler ve / veya sinyal sekansları da dahil olmak üzere karmaşık bir düzenleyici stratejiler kullanılarak ayrı ayrı her bir geni ifade eder. Metabolik mühendisleri ve belirli bir organele hedef enzimlerin ilgilenen sentetik biyologlar bir meydan okuma ile karşı karşıyayız: Birden fazla organele lokalize olan bir protein için, mühendis aynı gen birden çok kez klonlamak gerekir. Bu çalışma bu strateji için bir çözüm sunar: mRNA alternatif kırpılmayı sokmak. Bu teknoloji kurulmuş ve peroksizom kloroplast hedefleme dizilerinin yararlanır ve alternatif olarak eklenmiş bir tek mRNA halinde birleştirir. Bazı ek yeri varyantları sitoplazmada peroksisom bazı ve bazı, kloroplast gönderilir. Burada sistem çoklu-organel alternatif eklenmeye hedefleme için tasarlanmıştır. Bu çalışmada, GFP ifade olması bekleniyordurasyonel şekilde tasarlanan 5 'mRNA etiketleri bir dizi kloroplast, sitosol ve peroksisom olarak işlenene. Bu etiketler, heterolog genler, birden çok alt-hücresel organellerde ifade edilmesi gerektiğinde gerekli klonlama miktarını azaltma potansiyeline sahiptir. Bu yapılar önceki çalışmada 11 olarak tasarlanmıştır ve Gibson montaj, kısıtlama enzimleri gerektirmeyen bir ligasyon bağımsız klonlama yöntemiyle klonlanmıştır. Elde edilen plazmidler, bir modifiye protokol ile Gen Tabancası Nicotiana benthamiana yaprak epidermal hücrelere dahil edilmiştir. Son olarak, transforme edilmiş yapraklar konfokal mikroskopi ile gözlemlenmiştir.
Giriş
Bu çalışma, bitki hücrelerinin çok organellerde bir raportör proteini ifade etmek için, ancak yalnızca tek bir DNA yapısı ile, burada bir metabolik mühendislik / sentetik biyoloji projedir.
Birden fazla konuma proteinleri hedef için bir yaklaşım, çok sayıda klonlama genetik kopya, farklı bir lokalizasyon peptit içeren her içerir. Her kopya tek dönüşümleri 1 çaprazlanması ile, alternatif olarak ardışık yeniden dönüştürülmesinin tarafından tanıtılan, ya da olmalıdır. Bu ek klonlama içerir ve terminaline başına bir lokalizasyon etiketi ile sınırlıdır.
Birden fazla yere lokalize protein için başka bir a....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hedefleme Çoklu organel için alternatif olarak eklenmiş diziler-1. Design
- Nihai protein ifadesi için siteler belirler. Bu iş için, faiz kloroplast, peroksisom ve sitosola hedefleme olduğunu.
- Ilgi organellere proteinleri hedef bilinen protein ve DNA dizilerini tanımlamak için literatür kullanın. Bu durumda, bir kloroplast Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferaz 6,15 ikinci hedef sekansı ve Arabidopsis thaliana transtiretin gibi S-allantoin sentez 16,17 ikinci hedef sekansı, bir peroksizom belirlenmiştir.
- Doğru organellere ilgi proteinleri hedef gereken bir alternatiftir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tasarım çaba önemli bir planlama sonucudur. Bu proje için yeni diferansiyel olarak ifade edilen proteinlerin çevrilmiş bir ön-mRNA'nın alternatif uç uca eklenmesi oluşturmak için kullanılmasıdır. Bu proteinler, bu durumda, farklı organeller olarak ifade edilmiştir kloroplast, peroksizom ve / veya Sitosol. Bu alternatif olarak 6 eklenmiş doğal Arabidopsis geni uyarlanmış ve (TriTag-1 ve TriTag-2) alternatif olarak ekson dizileri hedef kloroplast 6 ve peroksizom 17 bilinen yer.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, basit yöntemler bitkilerde çok sayıda hücresel bölümlerin, tek bir transgenik proteini lokalize için tarif edilmiştir. Amaç, Nicotiana benthamiana birden fazla organelde tek bir gen ifade edecek bir yapı tasarlamaktı. Rasyonel stratejiler GFP bazlı DNA konstruktlarının tasarımı, Gibson montaj, Gene Gun yaprak hücrelere plasmidlerin teslimat ve konfokal mikroskobu ile sonuçların gözlenmesi bulunur.
Üç farklı kısa, N-terminal etiketler 11 hedef eşzamanlı kloro.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Yazarlar Nicotiana benthamiana fidan cömert bağış için Massachusetts Genel Hastanesi Jen Sheen teşekkür etmek istiyorum. Jen Bush bitkilerin büyüyen ve büyüme odası alanı kurma tavsiyesi bize büyük ölçüde yardımcı oldu. Wyss Enstitüsü'nden Tom Ferrante konfokal mikroskobu ile çok önemli yardım teklif etti. Yazarlar, özellikle Boston Çocuk Hastanesi'nden Don Ingber ve Gen Tabancası ve ilgili malzemeleri cömert bağış için Wyss Enstitüsü'ne teşekkür etmek istiyorum. Bu proje için finansman PAS, JCW, ve MDM Enerji İleri Araştırma Projeleri Ajansı Başkanlığı (ARPA-E Ödül # DE-000079) ile bir işbirliği anlaşması ile sağlanan ve Chimerion Biyoteknoloji,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Oligonükleotid primerleri | IDT | (özel) | GeneBlocks |
| IDT | (özel) | 500 bp oligonükleotid | |
| ApE yazılımı | U Utah | (indir) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kiti | Qiagen | 28004 | PCR ürünlerini saflaştırmak için kullanılır |
| QIAprep spin mini hazırlık kiti | Qiagen | 27104 | Klonlamaya uygun miktarlarda plazmit hazırlamak için kullanılır |
| Phusion Master Mix, GC Tamponu | ile NEB | M0532S | İlgilenilen geni PCR ile amplifiye etmek için kullanılır |
| Gibson montaj reaksiyon karışımı | NEB | E2611L | Aşağıdaki 9 bileşenin ana karışımı |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson montaj karışımı |
| 1 M MgCl2 | G Biosience | 82023-086 | Gibson montaj karışımı |
| dNTP karışımı | Fermentas | R0192 | Gibson montaj karışımı |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson montaj karışımı |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson montaj karışımı |
| NAD | Uygulaması | A1124,0005 | Gibson montaj karışımı |
| T5 eksonükleaz | Epicentre | T5E4111K | Gibson montaj karışımı |
| Phusion polimeraz | NEB | F530S | Gibson montaj karışımı |
| Taq DNA ligaz | NEB | M0208L | Gibson montaj karışımı |
| Gibthon.org | Hesaplamaları basitleştirmek için web sitesi | ||
| Plazmid PLUS Maxi kiti | Qiagen | 12963 | Gen tabancası mermileri için DNA hazırlamak için kullanılır |
| Gen Tabancası sistemi | BioRad | 165-2451 | Gerekli tüm parçaları içerir |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Jen Sheen'in hediyesi, MGH |
| Konfokal mikroskop | Leica | SP5 X MP | Elde edilen hücrelerin görüntülenmesi |
| Derin kuyu slaytları | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 71561-01 | Konfokal görüntüleme için kullanılır |
| Bir Plazmid Editörü (ApE) | Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligasyon hesaplayıcı | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
Kaynaklar
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
