Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Pluripotensini koruyarak çünkü kendi benzersiz yeteneği kendini yenilemek, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) rejeneratif tıpta paha biçilmez bir kaynak olarak kabul edilir. In vitro hastalık modelleme için iskelet kaslarının hastalıklı kas ve HESC-veya uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin hücre aracılı iskânından Kök (iPSC) türetilmiş nesil tedaviler belirlenmesi ve birçok nöromüsküler hastalıkların patogenezi tanıtılması amaçlanmıştır çalışmaların önemli hedefleri vardır. Ancak bu çalışmalar iskelet kası hücrelerine dönüştürmek için hESC direnci ve iskelet Miyogenesis doğru HESC-taahhüdünün moleküler düzenlenmesi ile ilgili bilgilerin azlığı meydan olmuştur. Gerçekten de, hESC iskelet kası ata hücreleri üretmek için daha önceki girişimler sadece embriyoit gövde (EB) türetilmiş yavrularıyla veya mezenkimal hücreler transkripsiyonel aktivatör elemanının ve ektopik ifade (alttaki iskelet Miyogenesis aktif hale getirmek için yeterli olduğunu ortaya örPax3 veya Myf5) ^1-3 ya da özel kültür koşulları ^4-5 maruz kalma.

Daha önce (SMARCD3 tarafından kodlanan) SWI / SNF bileşen, BAF60C, kas özel lokusların ⁶ MyoD aracılı aktivasyonunu sağlar: transkripsiyonel makinelerin önemli bir bileşen olduğunu göstermiştir. Yakın zamanda BAF60C seçici olmaması HESC üzerine başka bir somatik hücreler ^8-10 ifade BAF60C gözlenmiştir iskelet Miyogenesis ^7'nin MyoD aracılı aktivasyonu için direnç kazandıran keşfettiler bir işlem genel olarak kas kaynaklı dönüştürme anılacaktır. BAF60C Zorla ifadesi doğrudan BAF60C ve miyojen soy ⁷ doğru hESC taahhüt epigenetik bir imza heybetli myod ile, belirli bir kültür şartlara bağlı, hESC iskelet Miyogenesis etkinleştirmek için myod sağlar. Not, önceki proteomik analiz BAF6 seçici olmadığını ortaya0C, SWI / SNF bileşenleri arasında, EKH ^11. Biz üç boyutlu kasılma oluşturmak için toplanmış olabilir iskelet miyoblastların homojen bir nüfus nesil lider, miyojenik soy üzerine hESC epigenetik bir taahhüt altına bu bilgi kullanılır yapıları (myospheres), işlevsel taklit minyatür iskelet kasları ^7. Nitekim, hESC iskelet kas atalarıdır üreten bizim yöntem böyle hücresi gibi hücreler farklılaşma sinyallere maruz kadar fenotipik gizildir miyogenik soyu, için hESC epigenetik taahhüt dayanır farklılaştırma ortamı içinde toplama ve kültür (belirli bir protokol bakınız). Bu strateji epigenetik iskelet kası soy kararlı ve histolojik iskelet ve fonksiyonel özellikleri özetlemek üç boyutlu kasılma myospheres oluşumuna uygun olan hESC bir homojendirler ve genişlemesine izin verenkaslar. Myospheres kas hastalıklarının modeli bir "bulaşık hastalık" için işletilebilir minyatür kasların ilk kanıt. Hasta türetilmiş iPSCs üretilen, bu myospheres tedavi edici bileşiklerin yüksek veri akışı tarama için bir araç olarak büyük potansiyel sunan ek olarak, uzun süredir devam eden gelişim soru aydınlatmak için potansiyel ve nadir hastalıkların patojenezi. Ayrıca Gomes et al. ¹² ile bir JoVE protokolde tarif edildiği gibi analiz myosphere hemen tek bir okuma, bölme immünohistokimyasal olarak temin edilebilir olduğuna dikkat

HESC 1. Enfeksiyon

Bu protokol, yüksek titre lentivirüsler kodlayan BAF60C ve MyoD ¹³ gerektirir. Bu yapılar istek üzerine mevcuttur.

1. Başlamadan önce Öneriler
   1. Besleyici ücretsiz koşullarına enfeksiyon viral alımı sırasında hücresel rakiplerini ortadan kaldırmak için (Şekil 2A) için enfeksiyon, plaka hESC yüksek verim sağlamak için. Gerçekten de, MEF'ler HESC göre ve MyoD-aracılı dönüşüm için yetkin olduğu gibi enfekte herkesin bildiği gibi daha kolaydır. Bu nedenle, HESC kültürlerden MEFS ortadan enfeksiyon oranı artar.
   2. Bu enfeksiyon, yüksek verim sağlamak için yüksek titre lentivirüsler olması tavsiye edilir. Enfeksiyon verimliliğini artırmak için Seçenekler "enfeksiyon kontrol" bölümünde tartışılmıştır.
   3. Her kuyucuğa 1 mg / ml 1 ml Matrigel eklenerek Matrigel kaplı tabak hazırlayın ve en az 1 saat oda sıcaklığında (veya O bırakmak / N 4 ° C'de mühürlübir gün önce hazırlandı ise).
2. Enfeksiyon işlemi
   1. Enfeksiyondan bir gün önce
      1. 1000 X seyreltme (2 mM nihai konsantrasyon) de ortam içinde embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek ekleyin.
   2. Gün 0 - BAF60C ile enfeksiyon
      Not: İlk MyoD ile enfeksiyonu takiben BAF60C ile hESC enfeksiyon yapın.
      1. 37 ° C'de 5 dakika boyunca TrypLE 1 ml ile kuluçkalama ile tek bir hücre süspansiyonu olarak ¹⁴ koloni olarak yetiştirilen hESC bir 6-yuvalı plakanın bir kuyu ayrıştırmaları
      2. 15 ml tüp transfer süspansiyon, 1200 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj HESC orta ve 9 ml ekleyin.
      3. Santrifüj sırasında, 1 ml mTeSR1, polibren (6 mg / ml) ve embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek (2 mM) ilave edilerek temiz bir tüp içinde enfeksiyon karışım hazırlayın.
      4. Bir c yeniden askıya hücre topağı (yaklaşık olarak 5 x 10 ⁵ -1 x 10 ⁶ hücreonfluent iyi hESC) plastiğe yapışmasını engelleyen bir hücreler 6-çukurlu, düşük tutturucu levha, üzerine enfeksiyon karışımı ve plakanın 1 ml.
      5. ⁸ 10 MOl'de BAF60C-IRES-GFP virüs ekleyin ve inkübatör içinde 3 saat inkübe
      6. Virüs içeren hücre süspansiyonu toplayın ve iki Matrigel kaplı oyuklara eşit bölün. Daha sonra her bir oyuğa mTeSR1 + embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ekleyin ve inkübatör O / N bırakın.
   3. Gün 1
      1. Dikkatle virüs içeren orta kaldırmak ve mTeSR1and iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ile değiştirin. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, hücreler topaklanmış başlayacaktır.
   4. Day2 - myod ile enfeksiyon
      1. Devam önce, enfeksiyon riski yüksek verim için emin olmak için flöresanlı bir mikroskop altında, hücrelerin floresans durumunu kontrol edin. Değilse, Infect kontrol "bölümüne bakıniyonu ".
      2. Hücreler izdiham en az% 80 ulaştı varsa aşağıdaki işlemleri; Aksi önce işlem için ek bir gün bekleyin.
      3. Ortamı çıkarın ve hücreleri ayırmak için TrypLE maddesi 1 ml ekleyin. 37 ° C'de 5 dakika inkübe
      4. Tarif from1.2.2.2 gibi tekrarlayın - 1.2.2.6 10 ⁸ MOI'da MyoD virüs ekledi.
   5. 3. Gün
      1. Dikkatle virüs içeren orta kaldırmak ve mTeSR1and iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ile değiştirin.
      2. Matrigel Plaka MEF'ler enfekte olmuş hücrelerin yayılmasını sağlamak için ertesi gün için 2.5 x 10 ⁵ / cm ² plakaları kaplı.
   6. 4. Gün
      1. Ortamı çıkarın ve hücreleri ayırmak için TrypLE maddesi 1 ml ekleyin. 37 ° C'de 5 dakika inkübe
      2. 15 ml Falcon tüpüne transfer hücreleri, 1200 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj HESC orta ve 9 ml ekleyin.
      3. Raldır süpernatan ve HESC orta 6 ml yeniden askıya.
      4. Her bir MEF'ler ihtiva eden 3 ml dağıtma 1:2 bir bölünme oranında MEF'ler ihtiva eden 6 oyuklu plaka ve plaka hESC orta çıkarın.
         Koloniler izdiham ulaştığınızda! TIP, MyoD/BAF60C-infected hücrelerin bazı kuyularında bir rezerv stok olarak sıvı nitrojen içinde dondurulmuş olabilir. Donma orta 90 KOSR% ve% 10 DMSO artı 2 mM iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Desteği içerir. Geri kalan kuyular sonra farklılaşma protokole maruz olabilir - açıklama için aşağıya bakınız. Daha hücreleri daha myospheres üretmek için gerekli aşağıdaki gibi, enfekte HESC daha çoğaltılabilir:
      5. Ortamı çıkarın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca 1 mg / ml kollajenaz IV, 1 ml 'si ile inkübe
      6. Kollajenaz IV çıkarın ve HESC ortamın 1 ml.
      7. Diseksiyon mikroskobu altında 10 ml ucu ile koloniler kazımak.
      8. Coloni ve parçaları toplayın, 15 ml bir tüp içinde ve 3 dakika boyunca tortu izin es. Daha sonra, bir oran 01:04 ile MEF'ler tabakalarına HESC orta ve plaka içindeki süpernatan, tekrar süspansiyon çıkarın.
3. Enfeksiyon kontrol etme
   1. Hücreleri yayılan iken, RNA analizi için hasat ve (Temsilcisi sonuçları görmek) her aşamada doğru biyolojik durumu yansıtır biyobelirteçlere kontrol etmek için immünofloresans tarafından protein ekspresyon analizi gerçekleştirmek için daha küçük bir ölçekte enfekte hücreleri plaka tavsiye edilir. Yüksek titre lentivirüsler için beklenen enfekte olan hücrelerin yüzdesi en az% 80 olmalıdır.
   2. Yüksek verim sağlamak için, lentiviral vektörler, floresan bir seçim işaretleyicisi ve / veya bir antibiyotik direnç sokulması, modifiye edilebilir. BAF60C ifade Bizim lentiviral Plazmid aynı zamanda GFP floresan taşır.
   3. Bir floresan işaretleyici için hESC sıralama. Enfeksiyonunun düşük verimlilik durumunda floresan a kullanılması önerilirBAF60C virüs eksprese eden hücreler için zenginleştirmek ve daha sonra yüksek titre MyoD virüs ile enfekte etmek için hücreler (FACS-sıralama) sıralama ctivated hücreleri.
      1. Orta iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek sıralama gün önce ekleyin.
      2. Sıralama günü, (günde 0 açıklandığı gibi) TrypLE tarafından hücreleri ayırmak ve FACS-tüplerde KO yedek serum artı iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Eki'nde hücreleri tekrar süspansiyon.
      3. Sıralama sonunda, iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Desteği ekleyerek MEF'ler plakalar üzerinde KO yedek serum ve plakadaki hücreleri toplamak.

2.. EB-benzeri İndüksiyon ve Farklılaşma

1. Indüksiyon ve farklılaşma prosedür
   1. Gün 0 - EB indüksiyon
      1. Kuyunun (Şekil 2C) koloni sayısının yüksek olması, BAF60C/Myod-infected hESC farklılaşma başlamadan önce, emin olun.
      2. Her bir Raldır ortam, PBS ile yıkayın ve 1 mg / ml kollajenaz IV, 1 ml. 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe
      3. Kolajenaz çıkarın ve EB ortamın 1 ml.
      4. , Bir teşhir mikroskopu altında hızlı bir şekilde, mekanik olarak 10 ml ucu ile kazınarak 400-800 hücre agregalar halinde kolonileri ayırmak.
      5. 15 ml'lik bir tüp içinde koloni parçalarını toplamak ve 3 dakika boyunca çöktürmek için izin verir. Süpernatantı, EB ortamının 3 ml yeniden askıya ve 6-kuyulu düşük bağlanma plakanın bir çukuruna hücre süspansiyonu aktarın.
   2. Gün 1
      1. Geçmeden önce koloni büyüklüğü ve hücre ölümünü edin. Büyük parçalar varsa, bir 5 ml pipet, 3-4 kez hafifçe yukarı pipetleme ve onları yıkmak. Hücre ölümü çok yüksek ise (bir çok yüzer hücreler ve döküntüler) çekimi ile bir 15 ml'lik bir tüp içinde agregalar toplayarak orta yerine taze ortam EB 3 ml ile levha, aşağıdaki gibi başka bir devam edin.
      2. Ekle 1.5kuyu taze ortam ml EB
   3. 2. Gün
      1. 15 ml'lik bir tüp içinde kuyulardan agrega toplayarak orta değiştirin. Onları 2 dakika sakin olalım.
      2. Süpernatantı taze EB orta 3 ml ile değiştirin ve aynı kuyuların üzerinde dağıtabilir.
   4. 3. Gün
      1. Kuyularda taze EB orta 1.5 ml ekleyin.
   5. 4. Gün
      1. "2. Gün" de anlatıldığı gibi devam edin.
   6. Gün 5 - EB-benzeri kümeler (Şekil 2B) ve andMyogenic farklılaşması.
      1. 2.1.3.1 tarif edildiği gibi agrega toplayın ve 2 ml PBS ile bir kez yıkama; toplanmış çöktürmek için izin verir.
      2. PBS çıkarın ve DM orta 3 ml ekleyin; Aynı kuyu üzerinde plaka.
   7. Gün 6 - Gün 20
      1. D6 kaynaktan d20 için her 3 günde bir, taze ortam ile orta yerine. Temsilci myospheres F gösterilirŞEKIL 2E.
2. Denetleme myosphere farklılaşma
   1. Daha fazla ilerlemeden önce, bir önceki protokol JoVE ^12'de tarif edildiği gibi, OCT bileşiği içine gömülü myospheres bölümleri yaparak myospheres içinde miyojenik farklılaşma etkinliğini kontrol etmek için önerilmektedir. Böyle myognenin gibi miyojen belirteçleri (klon F5D, DSHB) ve miyozin ağır zincir (klon MF20, DSHB) (Temsilcisi sonuçları görmek) için bir imünoflüoresans lekeleme gerçekleştirin.
      Bu, 5 dakika boyunca sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.5 ile işlenerek antijen alma gerçekleştirmek için kritiktir EB bölümlerinde myogenin için boyama ile başarılı olmak için! Uç. Buna ek olarak, bu F5D ve MF20 antikorlar kullanılarak çift boyama için bu protokolü kullanmak mümkündür.

3.. Medya Tarifler

1. ESC orta
   DMEM-F12
   1 mM L-glutamin
   % 20 Knockout Serum değiştirme ortamı (KOSR)
   0.1 mM esas olmayan amino asitleri (NEAA)
   50 U / ml penisilin / streptomisin (Pen / Strep)
   0.1 mM beta-merkaptoetanol
   8 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)
2. EB orta
   DMEM F12
   1 mM L-glutamin
   % 15 FBS
   % 5 at serumu
3. DM ortamı
   DMEF F12
   1X ITS Sıvı Medya Desteği
   1X N-2 Ek

Şekil 1A protokolünün şematik hESC myospheres oluşturmak için önerilen gösterir. (Oklar ile belirtilen) kontrol etmek için en önemli adımlar hESC enfeksiyonun etkinliği ve myospheres içindeki kas kaynaklı dönüştürme bulunmaktadır.

Deneylerde GFP floresan taşıyan lentiviral vektör kodlama BAF60C yararlanmak. Genellikle BAF60C ifade nüfus için zenginleştirmek için enfeksiyondan sonra BAF60C ve FACS-sıralama 72 saat ile hücreleri enfekte etmektedir. Hücreler izdiham yaklaşık% 70-80 ulaştığında, biz MyoD lentivirüsünün ile enfekte. İlk enfeksiyondan sonra, normal olarak bu izdiham ulaşmak için, hücreler için iki ya da üç gün sürer.

Şekil 1B bulaşmamış HESC misli indüksiyon göreceli olarak eksojen genlerin ifade seviyelerini gösterir. Şekil 1C tanıtılan faktörlerin protein seviyesinde ifade ve dağılımını gösterir. BAF60C MyoD ifade MyoD antikoru ile bağışıklık fluorışıması yoluyla tespit edilir ise ifade GFP floresan olarak gösterilir. Biz EB gibi agrega içine enfekte hESC farklılaşma başlatmak gün Günü 0 düşünün. DM ortamı içinde 15 gün sonra, myospheres bir kısmı (genelde bir bütün oyuk) bileşik 12 Ekim gömülü ve kas kaynaklı dönüştürme etkinliğini kontrol etmek için kas kaynaklı işaretleri için immünofloresan gerçekleştirmek için kesilir. Şekil 1D myogenin ve miyozin ağır zincir için temsili boyamasını göstermektedir optimal miyojen farklılaşma. Myospheres belki de daha küçük myospheres ile füzyon sonucunda, farklı ya da anormal şekillere sahip olabilir. Günün 10 başlayarak, (film 1 ve 2 bakınız) myospheres sporadik daralmayı gözlemlemek mümkündür.

43/51243fig1.jpg "/>
Şekil 1. A) hESC. B'den myospheres) BAF60C ve MyoD (H9-BM) QRT-PCR ile gözlenmiş ve katı bir endüksiyon olarak ifade ile enfekte HESC olarak dışsal genin mRNA seviyeleri üretimi için kullanılan protokol şematik olarak enfekte hESC taklit göre nedeniyle. D) immünofloresan Myogenin için boyandı myosphere bölümlerinde gerçekleştirilmiştir vektöründe IRES-GFP elemanı (MYOG için MyoD boyama (kırmızı) ve BAF60C floresan (yeşil) arası (H9-ctr). C) immünofloresan görsel ), miyozin ağır zincir (MyHC) ve DAPI için zıt (İmmünofloresan detaylarını görmek). Ölçek çubuğu 100 mikron.

Şekil 2. Farklı aşamalarında hücre görünümü Temsilcisi resimlerifarklılaşması (Bölüm II) için enfeksiyon (part I) protokolü. Ölçek çubuğu 100 mikron. EB-benzeri yapıların ise d1 den d5 şekil (D) çoğunlukla dairesel, Şekil 1A şeması beklenmeyen bir şekil sunmak ve kültür heterojen göre 15 gün içinde büyüdü myospheres; E ve F iki örneklere bakın.

Biz ifşa hiçbir şey yok.