Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

15.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51248

⸱

28 Şubat 2014

 ,  ,  , 
1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine and Dentistry, Western University, 3Special Hematology/Flow Cytometry, London Health Sciences Centre, 4Lawson Health Research Institute, 5Department of Oncology, Western University

Bu makalede

Özet

Sirkülasyon tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) birçok metastatik kanser prognostik bulunmaktadır. Bu el yazması altın standart CellSearch sistemi (CSS) CTC sayım platformu ve golleri ortak yanlış sınıflandırma hatalar açıklanır. Buna ek olarak, iki uyarlanmış protokolleri bu teknolojiyi kullanarak metastaz klinik öncesi fare modellerinde kapalı zaman eğrilerinin ve CTC numaralandırma kullanıcı tanımlı işaretleyici karakterizasyonu için tarif edilmiştir.

Özet

Kansere bağlı ölümlerin çoğunluğu metastatik hastalık gelişimine daha sonra meydana gelir. Bu son derece öldürücü hastalık aşama tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) dolaşan varlığı ile ilişkilidir. Bu nadir hücreler metastatik göğüs, prostat, kolorektal kanser ve klinik öneme sahip olduğu gösterilmiştir. Klinik CTC algılama ve numaralandırma güncel altın standardı FDA onaylı CellSearch sistemi (CSS) 'dir. Bu el yazması standart bu platformu tarafından kullanılan protokolü yanı sıra özetliyor standardını kullanarak, hasta kapalı zaman eğrileri protein karakterizasyonu için kullanıcı-tanımlı işaretleyici optimizasyonu ve kanın çok düşük hacimlerde CTC yakalamak için benzer bir protokol ayrıntılı sürecini açıklayan iki ek protokol uyarlanmıştır CSS reaktifler, metastaz vivo preklinik fare modellerinde okuyan için. Buna ek olarak, sağlıklı kan verici arasında CTC kalitesinde farklılıklar hastanın kan samp karşılık doku kültürü hücreleri ile tutturuldules vurgulanır. Son olarak, CTC yanlış sınıflandırma hatalara yol açabilir birçok yaygın discrepant öğeler özetlenmiştir. Birlikte ele alındığında, bu protokoller metastaz ve kapalı zaman eğrileri ilişkin klinik öncesi ve klinik araştırma ile ilgilenen bu platform kullanıcıları için yararlı bir kaynak sağlayacaktır.

Giriş

2013 yılında 580.350 kişi kanserden öleceği tahmin edilmektedir ve bu hastalığın o 1.660.290 yeni vaka başına 1 ABD'de tanısı olacaktır. Bu ölümlerin çoğunluğu metastatik hastalık 2 gelişiminde sonra ortaya. Metastaz ve metastatik kaskad sınırlı bir anlayış tedavisinde etkili tedavilerin mevcut olmaması hastalığın bu aşamada son derece ölümcül yapar. Kan içinde, tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) sirküle varlığı metastatik hastalık 3 ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu hücreler son derece nadirdir ve algılama metastatik meme 4, prostat 5 genel sağkalım göstergesidir ve kolorektal kanser 6. Daha az olan hastalar ya da Sam tespit edilebilir bir kapalı zaman eğrileri ile karşılaştırıldığında, bu hastalarda, varlığı ≥ 5 (göğüs ve prostat) veya kan 7.5 ml ≥ 3 (kolorektal) kapalı zaman eğrilerinin daha kötü prognoz göstergesidire kan hacmi. Buna ek olarak, terapötik müdahale sırasında ya da sonrasında CTC sayısındaki değişim çoğu zaman daha önce şu anda kullanılan tekniklere göre 7-10, tedaviye yanıt bir göstergesi olarak yararlı olduğu gösterilmiştir.

Bu metastatik kanser hastalarında, kapalı zaman eğrilerinin 10 5 -10 7 kan tek-çekirdekli hücreleri için yaklaşık 1 CTC bir frekansta ortaya çıkar ve lokalize hastalığı olan hastalarda, bu frekans (1 ila 8 10 ~) daha düşük olabilir, bu tahmin edilmiştir. Bu hücrelerin nadir doğası zor doğru ve güvenilir CTCS 11 algılamak ve analiz yapabilirsiniz. Çeşitli yöntemler (önceden 12-14 gözden), kan bileşenleri çevreleyen onları ayırt özelliklerini istismar ederek bu hücreleri zenginleştirmek ve algılamak için kullanılmıştır. Genel olarak, CTC numaralandırma bir zenginleştirme aşaması ve bir adım algılama gerektiren hem iki bölümlü bir işlemdir. Geleneksel olarak, zenginleştirme adımlar fizik farklılıkları güveniyorkapalı zaman eğrileri (hücre boyutu, yoğunluk, deformabilite) veya protein işaretleyici ifade (yani epitel hücre adezyon molekülü [EpCAM], sitokeratin [CK]) iCal'ın özellikleri. Zenginleştirme sonra, CTC tespiti, nükleik asit bazlı deneyler ve / veya sitometrik yaklaşımlar en yaygın olarak farklı şekillerde, bir dizi gerçekleştirilebilir. Bu stratejilerin her biri farklı avantaj ve dezavantajları olan, ancak hepsi standardizasyon eksikliği, benzersiz, klinik ortamda içine giriş için bir zorunluluk. CellSearch sistemi (CSS) dolayısıyla floresan mikroskobu ve antikor bazlı teknikler 4-6 kullanılarak insan kanında nadir kapalı zaman eğrileri tespiti ve sayımı için standart bir yöntem temin etmek üzere geliştirilmiştir. Bu platform şu anda CTC numaralandırma altın standart kabul edilir ve klinikte 15 kullanılmak üzere ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanmış tek teknik olduğunu.

CSS iki bileşenli bir platformdur consistin olduğunug, insan kan numunelerinin hazırlanması ve bu tarar (bundan sonra analiz aracı olarak da adlandırılır) (2) CellTracks Analiz II, otomatik (bundan sonra hazırlama aracı olarak da adlandırılır) (1) CellTracks otoprep sistemi, Aşağıdaki örnekler, hazırlama. Lökositler hazırlık aleti karışmasını CTCS ayırt aracılı bir antikor, ferrofluid tabanlı manyetik ayırma yaklaşımı ve diferansiyel floresan boyama kullanır. İlk olarak, sistem demir nanopartiküllerinin konjuge anti-EpCAM antikor kullanılarak CTCS etiketler. Numune daha sonra, bir manyetik alan içinde inkübe edilir ve tüm etiketlenmemiş hücreler aspire edilir. Seçilen tümör hücrelerinin floresan-etiketli antikorlar ve nükleer boyama reaktif oluşan, farklı flüoresans leke içinde yeniden süspansiyona alınmış, ve inkübe edilir. Son olarak, numune, bir manyetik kartuş için (bundan böyle manyetik cihazı olarak anılacaktır) bir MagNest denir ve sc ediliranaliz aleti kullanılarak anned.

Bu analiz aleti, bir 10X objektif lens kullanarak, farklı floresan filtreler, uygun floresan parçacık için optimize her kullanılarak hazırlanan örnekleri taramak için kullanılır. Kapalı zaman eğrilerinin anti-EpCAM, anti-pan-CK-fikoeritrin (PE) ile bağlıdırlar hücreleri (CK8, 18 ve 19), ve nükleer leke 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) olarak tanımlanır. Bunun aksine, anti-kirletici lökosit CD45-Allophycocyanin (APC) ve DAPI ile bağlı hücreler olarak tanımlanır. Tarama sonra, bilgisayar tanımlanmış potansiyel tümör hücrelerinin kullanıcıya sunulmaktadır. Bu görüntülerden, kullanıcı olayları KTC olduğunu belirlemek için yukarıda tartışılan tanımlı parametreleri ve diferansiyel boyama kullanılarak kalitatif analizi istihdam etmek zorundadır.

CTC numaralandırma için standart bir yöntem sağlamaya ek olarak, CSS ilgi protein belirteçleri göre kapalı zaman eğrileri moleküler karakterizasyonu için izin verir. Bu sorgulama cbir CTC tanımlama 16 için gerekli olmayan bir floresan izotiyosiyanat (FITC) floresan kanalını kullanarak, tek hücre düzeyinde gerçekleştirilebilir. Bu platform moleküler karakterizasyonu için kapasite sağlamasına rağmen, protokol geliştirme ve optimizasyon detaylı süreci iyi tanımlanmış değildir. Üç ticari olarak temin edilebilen belirteçler, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) ve insülin benzeri büyüme faktörü reseptörü 1 (IGF-1 R) dahil olmak üzere, CSS ile kullanım için, üretici tarafından geliştirilmiştir. HER2 analizi, CSS ile birlikte, klinik karar verme bilgilendirmek ve potansiyel mevcut tedavi kuralları değiştirmek için CTC karakterizasyonu için potansiyel göstermek için çeşitli gruplar tarafından kullanılmıştır. Örneğin, Fehm et al. 17 HER2-primer tümörlü göğüs kanserli hastaların yaklaşık üçte biri HER2 + CTCS sahip olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, Liu et al.18 yakın HER + metastatik meme kanseri hastalarının% 50 kadar HER2 + CTCS yoktu bildirdi. Herceptin, büyük olan tümörler HER2 yeterli düzeyde ifade HER2 + primer tümörleri 19-21 olan hastalar için yaygın olarak kullanılan tedavi hastaların yararına göstermiştir monoklonal antikor müdahale HER2 reseptörü. Ancak bu çalışmalar Herceptin alt-optimal düzeyde kullanıldığı ve CTC karakterizasyonu tedavi yanıtını belirlemede yardımcı olabilir varlık olabileceğini düşündürmektedir. Sonuçta, CTC karakterizasyon kişisel bakım geliştirmek için potansiyeli olabilir.

Büyük ölçüde bir başucu-to-benchtop yaklaşımı kullanmış olmasıyla CTC araştırma benzersizdir. Bu yöntem, genellikle hasta bakımını etkileyecek yıl sürebilir benchtop-to-başucu araştırma, aksine, klinik ortamda içine KTC hızlı bir giriş sağladı. Ancak, hekimlerin hasta tedavi kararı-mak CTC analiz sonuçları kullanmak için tereddütlünedeniyle altta yatan biyolojinin anlayış eksikliği ing. Bu nedenle metastaz ve tamamlayıcı CTC analiz teknikleri, uygun klinik öncesi fare modelleri bu olağanüstü soruları araştırmak amacıyla kullanılmalıdır. Genel olarak, metastatik kademeli olarak tüm adımların çalışma için izin metastatik kaskad çalışma için kullanılan klinik öncesi modellerinin iki tür, (1) kendiliğinden metastaz modelleri vardır ve sadece izin verir (2) deneysel metastaz modelleri Böyle ekstravazasyonun ve ikincil tümör oluşumu 22 olarak metastatik süreçte adımlardan çalışma. Spontan metastaz modelleri uygun ortotopik yerle (prostat kanseri araştırması için prostat bezine prostat kanseri hücreleri, örneğin enjeksiyon) içine tümör hücre enjeksiyonu içerir. Hücreler daha sonra, birincil tümörler oluşturan ve kendiliğinden gibi kemik, akciğer, lenf düğümleri gibi ikincil bölgelere metastaz için zaman verilir. Içindekontrast, deneysel metastaz modelleri (belirli yerlere hücrelerini hedef kuyruk ven veya intrakardiyak enjeksiyon yoluyla örneğin) kan dolaşımına, tümör hücrelerinin doğrudan enjeksiyon içerir ve bu nedenle ikincil organlara 22 intravasation ve yaygınlaştırma ilk adımları atlayın. Bu zamana kadar in vivo model sistemlerinde de CTC analiz çoğunluğu sitometri tabanlı 23 ya da dönüştürülmüş insan merkezli CTC teknikler (örneğin AdnaTest) 24 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yararlı olsa da, bu tekniklerin hiçbiri yeterince altın standart CSS kullanarak CTC numaralandırma yansıtmaktadır. Sonuçlar kıyaslanabilir olacağı gibi klinik onayı, standart doğa ve CSS yaygın kullanıma göre, bir eşdeğer numune hazırlama, işleme kullanır in vivo modelleme için CTC yakalama ve algılama tekniği ve kimlik kriterleri geliştirme avantajlı olacaktır hasta örneklerinden elde edilmiştir. Bununla birlikte, hacim reqhazırlama aygıtının uirements bu otomatik bir platform kullanılarak kan küçük hacimli işlemek mümkün değildir. . Olarak fare skuamöz epitel hücrelerinin yanlış sınıflandırma yol açabilir - Ayrıca, Eliane ark 25 tarafından önceki çalışma (aynı zamanda standart CTC tanımını [EpCAM + CK + DAPI + CD45] karşılamak) fare epitel hücreleri ile numunelerin kontaminasyonu olduğunu göstermiştir KTC. Bu sorunlar, manuel izolasyon prosedürü ile birlikte CSS CTC kiti reaktiflerin kullanımı geliştirilen sağlayan bir uyarlanmış tekniği ele almak için. Tahlile bir FITC etiketli insan lökosit antijeni (HLA) antikor ilave insan tümör hücreleri, fare skuamöz epitel hücrelerden ayırt edilmesini sağlar.

Bu el yazması uyumsuzluğu dahil karşılaştı olabilir Hasta kan örnekleri ve ortak tuzaklar, işlenmesi için ticari olarak geliştirilen standart ve optimize CSS kuralını açıklarCTC yanlış sınıflandırma hatalara yol açabilir t ürün. Buna ek olarak, yakalanan kapalı zaman eğrileri ve metastaz klinik öncesi fare modellerinde kan küçük hacimlerinden kapalı zaman eğrileri zenginleşmesi ve saptanması için uyarlanmış izin veren karşılaştırılabilir bir CSS tekniğinin kullanıcı tanımlı protein özelliklerini incelemek için CSS tahlilinin özelleştirme açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu yazıda anlatılan tüm insan çalışmalarda Batı Üniversitesi İnsan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanan protokol çerçevesinde yürütülmüştür. Tüm Hayvan çalışmaları Western University Hayvan Kullanımı Alt Komitesi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde, Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tavsiyeleri doğrultusunda yapılmıştır.

1.. CSS kullanarak Hasta kan örnekleri standart CTC Numaralama

1.. Hazırlık Enstrüman İnsan Kan Örnek Toplama ve İşleme Hazırlık

  1. Standart aseptik flebotomi teknikleri kullanılarak, etilen diamintetraasetik asit (EDTA) ve özel bir hücre koruyucu madde içermektedir, (bundan sonra CTC koruyucu boru olarak da adlandırılır), bir 10 ml tüp içine CellSave insan kanı 8.0 ml 'lik bir minimum çizin. Pıhtılaşma kan önlemek için tüp 5x ters çevirin. Örnekler hemen işleme ya da en fazla 96 saat boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
  2. Remove CSS buzdolabı reaktifler ve onları kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
  3. Tek kullanımlık bir pipet 10 mi ve otomatik pipet kullanarak, CTC koruyucu boru kan 7.5 ml toplar ve yavaş yavaş bir şekilde etiketlenmiş hazırlama alet işleme tüp içine kan dağıtmak.
  4. Her bir örnek için seyreltme tamponu 6.5 ml ilave edilir. Örnek 5x ters çevirerek karıştırın. "Kapalı" konumunda freni ile 10 dakika boyunca 800 x g santrifüj örnek. Işleme sistemi üzerine tüm hasta numuneleri yüklemek için hazırlık enstrüman üzerinde ekrandaki yönergeleri izleyin. Örnekler hazırlama, 1 saat içinde işlenmelidir.

2. Hazırlık Instrument İşleme Kontrolü Hazırlama

  1. Yavaşça kontrol şişeyi vorteks ve karıştırmak için 5x ters.
  2. Dikkatle kontrol şişesi kapağını çıkarın ve kapağını açıp şişenin üstüne ters bir hazırlık enstrüman işleme tüp yerleştirin. Tek bir hareketle, tersşişe, kontrol ve işlem tüpe içeriğini dökün. Ters çevrilmiş olsa da, hafifçe geri kalan içeriği serbest bırakmak için kontrol şişe kenarlarını hafifçe vurun.
  3. Dikkatle, işleme tüp ters kontrol flakonun çıkarılması hiçbir sıvı kaybolur sağlamak ve bir kenara koyun. 1000 ul pipet kullanarak, şişe ve kapak kalan içeriğini toplamak ve yavaşça işlem tüp içine pipetle.
  4. Işleme sistemi üzerine denetimini yüklemek için hazırlık enstrüman üzerinde ekrandaki yönergeleri izleyin.

3. Analiz Instrument Numune Tarama

  1. Sistemin tüm örnekleri kaldırmak için hazırlık enstrüman üzerinde ekrandaki yönergeleri izleyin. Gevşek, her bir manyetik cihaz kartuşu kap ve kartuş kenarlarına yapışmış herhangi kabarcıkları serbest bırakmak için ellerini veya laboratuar tezgah kullanarak manyetik cihaz dokunun. Tüm kabarcıklar çıkarıldıktan sonra, sıkıca i kartuşu kap düz manyetik cihaz yatıyordu, ve, oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca karanlıkta ncubate. Örnekler hazırlama 24 saat içinde taranmalıdır.
  2. Analiz aracı açın ve lambayı başlatmak. Once (~ 15 dk) ısındı, analiz enstrümanı üzerine sistem doğrulama kartuşu yükleyin ve QC Testi sekmesini seçin. Gerekli kalite kontrol önlemleri gerçekleştirmek için ekrandaki talimatları izleyin.
  3. Analiz enstrümanı üzerine bir örnek Yük ve Hasta Testi sekmesini seçin. Hazırlık enstrüman kayıtlı tüm bilgiler ekrana gelecektir. Örnek taramayı başlatmak için Başlat düğmesini tıklatın. Sistem manyetik cihaz kartuş üzerindeki bir kaba odak ve kenar algılama yapacak.
  4. Yön tuşlarını kullanarak gerekli tüm kenarları ayarlayın. Seç. Sistem ince odak gerçekleştirmek ve örnek taramaya başlayacak.
  5. Sonuçları tarayarak aşağıdaki kontrol yüksek (CK + DA çivili hücreler için tanımlanmış kriterler kullanılarak valide edilmelidirPI + CD45 - APC +) ve düşük (CK + DAPI + CD45 - FITC +) konsantrasyonları. Sonuçları tarayarak aşağıdaki hasta numunesi tanımlanan CTC kriterleri (CK + DAPI + CD45 -) kullanılarak çekilen kapalı zaman eğrileri için gözden geçirilmelidir.

2. CSS kullanarak kullanıcı tanımlı Markers için CTC Karakterizasyonu

1.. Kullanıcı tanımlı Göstergeleri ve Enstrüman başlatması hazırlanması

  1. Çalışma konsantrasyonu örnek ile stok konsantrasyonu ilave sonra antikorun konsantrasyonu aşağıdaki formül kullanılarak bir işaretleyici reaktif bir kap içinde istenen konsantrasyona Bond birincil antikor seyreltici kullanılarak, ilgi konusu antikorun sulandırınız antikor konsantrasyonudur reaktif fincan. Birden örnekleri için, Tablo 1 'de tarif edildiği gibi antikor seviyesini ayarlamak. Reaktif kartuş ve l 1 konumuna işaretleyici reaktif fincan yerleştirinCSS üzerine kartuşu OAD.
    Stok Konsantrasyon = (Çalışılan Konsantrasyon x 850 ul) / 150 ul
  2. , Kan toplamak örnekleri hazırlamak ve CSS protokol kullanılarak hasta kan örnekleri arasındaki standart CTC Numaralama, yukarıda tarif edildiği gibi hazırlama aleti yükleyin. Hazırlık cihaz tarafından istendiğinde özel işaretleyici eklenmesini etkinleştirmek için, Kullanıcı Testi tanımlanmıştır. Girdi işaretleyici adı seçin ve Kaydet. Numuneler cihazın üzerine yüklenir gibi, operatör olarak gerekli Hayır Evet seçerek veya tarafından özel işaretleyici almalıdır hangi göstermek istenir.

2. Analiz Instrument Kullanıcı Tanımlı Markers örnek Tarama

  1. , Analiz enstrümanı açmak lambayı başlatmak ve CSS kullanarak Hasta kan örneklerinden Standart CTC Numaralama Bölüm 3.2 'de açıklandığı gibi kalite kontrol ve sistem doğrulama gerçekleştirmek protokolü.
  2. Analiz enstrümanı üzerine bir örnek yükleyin ve Kur sekmesini seçin. FITC kanalı başlatmak için, Test Protokolleri bölümünde Kit kimliği olarak CellSearch CTC seçin. Bu menüde, CTC Araştırma, Düzenle düğmesini tıklatın ve istediğiniz gibi pozlama süresini ayarlayın. Bu CTC tespiti için kullanılan diğer floresan kanallar içine akmalarını artırabilir gibi CSS CTC kitini kullanarak 1.0 saniye bir pozlama süresi aşılmamalıdır önerilir.

3. Klinik öncesi Fare Modelleri kullanılmak için Standart CSSProtocol adaptasyonu

** Veridex Fare / Rat CellCapture Kit uyarlanmıştır (artık piyasada mevcut)

1.. Fare Kan Toplama ve Saklama

  1. Önceki kan toplama için, 0.5 M EDTA, 30 ul EDTA merkezi olarak küçük bir miktar bırakarak geri ve ileri bir 22 G iğne ile ~ çalıştırın.
  2. Daha önce ortotopik, kuyruk ven veya kalp içi yolları ile insan tümör hücreleri ile enjekte edilmiş farelerden alınan fare kan 50 ul, en az toplayın. (Seri CTC analizi için) safen veninden veya (CTC terminali analizi için) ve kardiyak delik ile kan toplamak. İğneyi çıkarın ve 1 ml EDTA Microtainer kan toplama tüpüne kan akıtın. Pıhtılaşma kan önlemek için ters ya da hafifçe fiske tüp ile karıştırın. Kan CytoChex hücre koruyucu eşit hacimde ilave edildikten sonra en fazla 48 saat boyunca hemen işleme veya oda sıcaklığında saklanabilir.

2. CTC Zenginleştirme

  1. Buzdolabı CSS reaktifleri kaldırmak ve onları kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
  2. Tüp sitometrisi, bir 12 mm x 75 mm, tam kan akışı 50 ul eşdeğer aktarın. Tüp yanlarındaki kalan bir kan aşağı yıkama, her bir örnek için seyreltme tamponu içinde 500 ul ekleyin. Gerekirse, kısa bir santrifüj sıkmaKalan kan toplamak için kullanılabilir.
  3. Yavaşça anti-EpCAM ferrofluid girdap doğrudan numune içine pipet ucu koyarak her bir örnek için, 25 ul ekle. Hafifçe karıştırın Yakalama Geliştirme reaktif ve vorteks 25 ul ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. Mıknatısın örnek tüpleri içine yerleştirin ve 10 dakika için inkübe edilir. Örnek tüpleri mıknatıs hala birlikte, dikkatli bir şekilde bir sonraki mıknatısa tüpün duvarına dokunmadan kalan sıvı aspire ve atmak için cam pipet kullanın.

3. CTC Boyama

  1. Nükleik asit Boya, boyama reaktifi, anti-fare CD45-APC, anti-insan HLA-Alexa Fluor 488 ve 100 ul permeabilizasyon 5.0 ul 1.5 ul, 50 ul, 50 ul mıknatıs ve tekrar süspansiyon gelen numune tüpleri çıkarın Reaktif. Birden örnekleri için, bu maddeler önceden karıştırılmış olabilir ve karışım 206.5 ul, her bir tüpe ilave edilebilir. Hafifçe karıştırın Vortexve karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Mıknatısın içine yavaşça 500 ul seyreltme tampon maddesi, girdap, yeri örnek tüplerini ekleyin ve 10 dakika için inkübe edilir. Örnek tüpleri mıknatıs hala birlikte, dikkatli bir şekilde bir sonraki mıknatısa tüpün duvarına dokunmadan kalan sıvı aspire ve atmak için cam pipet kullanın. Mıknatıstan numune tüpleri çıkarın ve seyreltme tamponu içinde 350 ul içerisinde tekrar süspansiyon haline getirin. Vortex hafifçe karıştırın.

4. Manyetik Aygıt Yükleme

  1. Bir jel yükleme ucu kullanarak dikkatli bir şekilde manyetik bir cihazın bir kartuş içine örnek tüpten tüm hacmi aktarın. Kartuşun alt başlatın ve örnek dağıtılır yavaş yavaş ucu geri.
  2. Tüm numune aktarıldıktan sonra, gevşek manyetik cihaz kartuşunun kapak ve sezaryen açıklandığı gibi kartuşun kenarlarına yapışmış kabarcıkları serbest bırakmak için el ya da laboratuar tezgah kullanılarak manyetik cihaz dokununn CSS kullanarak Hasta kan örneklerinden Standart CTC Numaralama 3.1.
  3. Eğim ve kartuşun kenarı arasında onları yakalama tarafından steril bir 22 G iğne kullanarak herhangi kabarcıklar pop. Tüm kabarcıklar çıkarıldıktan sonra, sıkı bir şekilde, kartuş kapağı düz manyetik cihaz koymak ve en az 10 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. Örnekler hazırlama 24 saat içinde taranmalıdır.

5. Analiz Enstrüman üzerinde elle Ayrılmış Numune Tarama

  1. , Analiz enstrümanı açmak lambayı başlatmak ve CSS kuralını kullanarak Hasta kan örneklerinden Standart CTC Numaralama Bölüm 3.2 'de açıklandığı gibi kalite kontrol ve sistem doğrulama gerçekleştirmek.
  2. Analiz aracı üzerine örnek yükleyin ve Kur sekmesini seçin. Biçim Örnek düğmesini tıklayarak manyetik cihaz veri düğmeye üzerindeki mevcut verilerin temizleyin. FITC kanal a etkinleştirinCSS kullanarak Kullanıcı Tanımlı Belirteçleri için CTC Karakterizasyonu Bölüm 2.2 'de açıklandığı gibi nd 1.0 sn pozlama süresini ayarlayın.
  3. Hasta Testi sekmesini tıklayın ve girişine örnek bilgileri Düzen'i seçin. Testi Protokolü olarak Kit kimliği olarak CellSearch CTC CTC ve Araştırma seçin. Girdi Yıldızla olarak belirtildiği gibi kalan gerekli bilgi. Örnek bilgileri kaydedin ve Başlat düğmesini tıklatın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Standart CTC Sayım Deneyi

CSS duyarlılığı ve özgünlüğü de literatürde belgelenmiştir. Bununla birlikte, eşit CTC kurtarma doğrulamak için, çivili (1000 LNCaP insan prostat kanser hücreleri) ve sağlıklı gönüllü vericilerden Katkısız bir insan kan numuneleri, standart CSSCTC protokolü kullanılarak CSS işlenmiştir. Beklendiği gibi, Katkısız numuneler, 0.00 ± 0.00% kapalı zaman eğrileri ücretsiz vardı ve CTC kurtarma çivili numuneler (Şekil 1A) için 86.9 ± 4.71% olarak gösterilmişt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

2004 yılında CSS yana birçok yeni CTC teknolojilerin geliştirilmesine rağmen, bu teknik bugün piyasada sadece klinik onaylı bir teknolojidir ve bu nedenle CTC tespiti ve sayımı için geçerli altın standart olarak kabul edilir. Bu el yazması CSS sıkı kalite kontrol standartları olmasına rağmen bu yanlı yorumlanmasına tabi olacak ve hasta örneklerinde CTC kimlik çivili örneklerinde kimlik çok farklı olduğunu olduğunu göstermiştir. Yaygın olarak uyumsuz öğelerin altı kategoride CTC yanlış sınıflandırılması oluşmasına neden ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar (ALA) olan ana şirket Johnson & Johnson da bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Janssen Teşhis LLC, sahibi Janssen Onkoloji tarafından sağlanan fon aldı.

Teşekkürler

Bu çalışma Kanser Araştırma Ontario Enstitüsü (# 08NOV230), Yenilik için Kanada Vakfı (# 13199), Prostat Kanseri Kanada, Janssen Onkoloji, Londra Bölgesel Kanser Programı, ve John ve Donna Bristol donör desteği ile hibe tarafından desteklenmiştir (ALA) Londra Sağlık Bilimleri Vakfı. LEL bir Frederick Banting ve Charles Best Kanada Yüksek Lisans Bursu Doktora Ödülü tarafından desteklenmektedir. ALA CIHR Yeni Araştırmacı Ödülü ve Araştırma ve Yenilik Ontario Bakanlığı'ndan Erken Araştırmacı Ödülü tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 M EDTA
Anti-insan CD44-FITCBD Pharmigen555478
Anti-insan CD44-PEBD Pharmigen555479
Anti-insan HLA-Alexa Fluor 488BioLegend311415
Anti-fare CD45-APCeBioscience17-0451-82
Bond Birincil Antikor SeyrelticiLeicaAR9352
CellSave Koruyucu TüplerVeridex952820 (20 paket) 79100005 (100 paket)
CellSearch CTC Kontrol KitiVeridex7900003
CellSearch CTC KitiVeridex7900001
CellSearch CXC Kontrol KitiVeridex7900018RUO
CellSearch CXC KitiVeridex7900017RUO
Alet TamponuVeridex7901003
Streck Cell Koruyucu (diğer adıyla CytoChex)Streck213350
1 ml Şırınga
10 ml Serolojik pipet
1.000 ve mikro; l Pipet
1.000 ve mikro; l Pipet uçları
12 mm x 75 mm Akış tüpleri
200 ve mikro; l Jel yükleme uçları
200 & l Pipet
22 G İğne
5 3/4 Tek Kullanımlık Pastör pipetindeVWR14672-200
5 ml Serolojik pipet
Otomatik pipetleyici
Kılcal Kan Alma Tüpü (EDTA)BD Microtainer365974
CellSearch Analyzer IIVeridex9555Magnests ve doğrulama kartuşları içerir
CellSearch AutoPrep SystemVeridex9541
Santrifüj
MagCellect Mıknatısı Ar-Ge D SistemleriMAG997
Küçük Lateks AmpulVWR82024-550
Vorteks

Kaynaklar

  1. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. 63 (1), 11-30 (2013).
  2. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  3. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  4. Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
  5. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  6. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
  7. Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
  8. Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
  9. Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
  10. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  11. Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
  12. Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
  13. Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
  14. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
  15. Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
  16. Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
  17. Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
  18. Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
  19. Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
  20. Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
  21. Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
  22. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
  23. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
  24. Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
  25. Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
  26. White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
  27. Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
  28. Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
  29. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
  30. Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
  31. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
  32. Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
  33. Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
  34. Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
  35. Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
  36. Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
  37. Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
  38. Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Dola an T m r H creleriH cre Arama SistemiCTC Zenginle tirmeCTC KarakterizasyonuKullan c Tan ml Mark rlerFare Xenograft ModelleriEpCAM Pozitif Se imiDiferansiyel BoyamaAk Sitometrisi T pManyetik Cihaz Kartu u
Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.