Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lipid Nanotüpler Kan Pıhtılaşma Faktör VIII Sarmal Organizasyonu

11.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51254

⸱

3 Haziran 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, University of Texas Medical Branch, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Medical Branch, 3Sealy Center for Structural Biology and Molecular Biophysics, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İnsan ve domuz: İki yüksek ölçüde homolog FVIII formlarının zara-bağlı yapısını çözmek için uygulanan Cryo-elektron mikroskobu, lipid nanoteknoloji, ve yapı analizleri bir arada mevcut. Helezonik negatif yüklü lipid nanotüpler (LNT) üzerine iki fonksiyonel rekombinant FVIII formları düzenlemek için laboratuvarda geliştirilen metodoloji açıklanmıştır.

Özet

Kriyo-elektron mikroskobu (Cryo-EM) 1 bir hidratlı eyalet ve zar ortamı 2 protein ve komplekslerinin fonksiyonel yapısını araştırmak için güçlü bir yaklaşımdır.

Pıhtılaşma Faktör VIII (FVIII) 3 bir çok etki alanı, kan plazma glikoproteinidir. Ciddi bir kanama hastalığıdır - kusur veya FVIII eksikliği Hemofili A tipi için nedenidir. Proteolitik aktivasyonu üzerine, Faktör VIII, normal kan pıhtılaşması 4 için kritik olan, negatif yüklü trombosit membran ilgili serin proteaz Faktör IXa bağlanır. FVIII koagülasyon oynadığı önemli rolüne rağmen, zar bağlı devlet için yapısal bilgiler eksik 5'tir. Yeniden birleştirici FVIII konsantre Hemofili A tipi karşı en etkili bir ilaçtır ve ticari olarak temin edilebilen FVIII insan ya da domuz, insan Faktör IXa 6,7 ile her oluşturan işlevsel kompleksleri olarak ifade edilebilir. "> Bu çalışmada, Cryo-elektron mikroskopisi (Cryo-EM) oluşan bir kombinasyon mevcut, lipid nanoteknoloji ve yapı analizleri, iki yüksek ölçüde homolog FVIII formlarının zara-bağlı yapısını çözmek başvuran. İnsan ve domuz laboratuarımızda gelişmiş metodoloji Sarmal olarak negatif yüklü lipid nanotüpler (LNT) üzerindeki iki fonksiyonel yeniden birleştirici FVIII formları düzenlemek için tarif edilmektedir. temsil eden sonuçlar yaklaşım sırası de yüksek ölçüde homolog iki (% 86 sekans özdeşliği arasındaki sarmal kuruluşta farklılıkları tanımlamak için yeteri kadar hassas olduğunu göstermektedir ) proteinleri. helezoni örgüt, Cryo-EM ve elektron tomografi (ET) veri toplama için ayrıntılı protokolleri., iki boyutlu (2B verilir) ve üç boyutlu (3D) yapı analizleri, insan ve domuz 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için uygulanır FVIII-LNT tartışılmaktadır. sunulan insan ve domuz FVIII-LNT yapılar önerilen yöntemin potansiyel calculat göstermekYüksek çözünürlükte kan pıhtılaşma faktörü VIII e fonksiyonel, zara bağlı organizasyonu.

Giriş

Kan pıhtılaşması, Faktör VIII (FVIII) altı alanda düzenlenmiş 2332 amino asitlerin büyük bir glikoproteindir: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Trombin aktivasyon FVIII zara bağlı Tenase kompleksi içinde faktör IXa kofaktörünün olarak hareket üzerine. Bir zar-bağlı şekilde aktive FIXa FVIII (FVIIIa) bağlanması, FIXa proteolitik verimliliği etkili kan pıhtılaşmasının 4 için çok önemlidir 10'dan fazla 5 kez, geliştirir. FVIII koagülasyon ve Tenase kompleks oluşumunda oynadığı önemli rolüne rağmen, fonksiyonel membran-bağlı FVIII yapı çözülecek henüz.

Bu adres için, yüksek afiniteli 8, 9, FVIII bağlayıcı ve aktif trombosit yüzeyi benzeyen edebilen fosfatidilserin (PS) zengin bir lipid iki katmanlı nanotüpler (LNT), 10 geliştirilmiştir. LnT bağlı FVIII'ünün Ardıl sarmal örgütü effecti olduğu kanıtlanmıştırCryo-EM 5 ile FVIII membran bağlı devlet yapısının belirlenmesi için ettik. Fonksiyonel LNT Cryo-EM, 11, 12 yolu ile protein-protein ve helisel şekilde düzenlenmiş zara bağlı proteinler, protein-membran etkileşimi incelemek için ideal bir sistem bulunmaktadır. Numune fizyolojik bir ortamda (tampon, membran, pH) en yakın olarak korunur gibi Cryo-EM katkı maddeleri ve izotoplar olmadan, örneğin X-ışını kristalografisi ve NMR yapı gibi geleneksel yöntemlere göre bir avantaja sahiptir. LNT boyut, şekil ve bileşimin Tenase kompleksler in vivo monte aktif trombositlerin pseudopodia yakından benzer olarak FVIII durumunda, bu teknik ile zara-bağlı yapısını inceleyerek daha da daha fazla fizyolojik olarak önemlidir.

Kusur ve FVIII neden Hemofili A, insan nüfusu 4, 6 1 5,000 erkekleri etkileyen ciddi bir kanama bozukluğu eksikliği. Çoğu eHemofili A için etkili oldukları tedavi rekombinant insan FVIII'ünün (hFVIII) yaşam boyu uygulanmasıdır. Rekombinant FVIII Hemofili A tedavisinin önemli bir komplikasyon Hemofili A hastalarının 13 yaklaşık% 30 etkileyen insan formuna engelleyici antikorların gelişmedir. Bu durumda, domuz FVIII (pFVIII) konsantre FVIII insan ve insan FIXa 7 ile form fonksiyonel kompleksleri karşı inhibitör antikorlar ile domuz FVIII görüntüler, düşük çapraz reaktiflik olarak kullanılır. Domuz ve insan FVIII formları hem de zara bağlı örgüt kurma FVIII kofaktör fonksiyon ve kan hemostaz için etkileri yapısal temelini anlamak önemlidir.

Bu çalışmada, lipid nanoteknoloji, Cryo-EM, ve iki son derece homolog FVIII formlarının zara bağlı organizasyon çözmek için tasarlanmış bir yapı analizi bir arada tarif eder. Helezonik organize porci için sunulan Cryo-EM veri ve 3D yapılarınegatif yüklü Int üzerinde ne ve insan FVIII FVIII yapı tayini ve zara bağlı pıhtılaşma faktörleri ve fizyolojik bir ortamda zar kompleksleri için temel olarak kullanmak için önerilen nanoteknoloji potansiyelini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Numune Hazırlama

  1. Tampon değişimi, insan Faktör VIII-BDD 14 ve HBS-Ca tampon maddesine karşı domuz FVIII-BDD 15 (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH = 7.4) ve 1.2 mg / ml 'ye konsantre edilir. -80 ° C de, protein çözeltisi Ol
  2. 01:04 w / kloroform w oranı en galactosylceramide (GC) ve fosfatidiliserin (PS) karıştırılması ile lipid nanotüpler (LNT) hazırlayın. , Argon altında, kloroform buharlaştırın ve 1 mg / ml 'ye HBS tampon maddesi içinde lipitleri çözünebilir. 4 ° C'de LNT çözüm tutun

FVIII-LnT 2. Cryo-elektron Mikroskopi

  1. Cryo-EM Numune Hazırlama
    1. 300 50 W da 10 saniye boyunca 2 ve O 2 H gaz karışımı içinde Quantifoil R2 / 2 bakır ızgaralar (C tarafı) ağ akıntı Glow
    2. 01:01 su / çimento oranı ağırlık olarak HBS-Ca tamponu içinde FVIII ve LNT çözüm karıştırınız ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
    3. 2.5 ul bir damlaVitrobot Mark IV nemlendirilmiş bir odada (% 100 nem) 'de hidrofil elektron mikroskobu, şebekeye FVIII-LNT numunenin.
    4. Leke ve flaş sıvı C 2 H 6 ızgara (3,5 saniye için bir leke, leke kuvvet 1) donma, amorf buz elde etmek için sıvı N 2 ile soğutulur.
    5. Sıvı N 2 (LN2) altında saklama kutuları saklayın ızgaraları.
  2. Cryo-EM Veri Toplama
    NOT: JEM2100-LaB6 (yıl 2010) elektron mikroskobu, vakum sistemi, aydınlatma sistemi, HT, lens akımları ve böylece-okuma pencereleri ile bir ekrana, ve iki bağlı bir bilgisayardan oluşan bir TEMCON işletim sistemi ile donatılmıştır paneller: SOL ve SAĞ, sütunun her iki tarafına yerleştirilir. Kiriş vardiya X, Y düğmeleri (SHIFT Y, ELEMEK Y) ve çok fonksiyonlu (DEF / Stig) topuzlar hem paneller vardır. SOL panelinde aydınlatma (Lümen Parlaklık) topuzu. SAĞ panelde bulunmaktadır: büyütme (MAG / CAM BOYU) ve odaklama (FOCUS) topuzlar ve üç IMAGing (MAG1, MAG2, LOWMAG) ve kırılma (FARK) modları düğmeleri. Biz alfa 2 de MAG1 bizim veri elde. Cryo-EM veri toplama için gerekli minimum doz aydınlatma koşulları (MDS) SAĞ panelde F6 düğmeleri, üst satır ile F1 ile ayarlanır. Bu protokolde genel ayarları kullanılır: F1 - yükseltmek / düşük ekran, F2 - ARAMA modu, F3 - FOCUS modu, F4 - FOTO modu, F5 - MDS ON / OFF ve F6 - LEVENT BOŞ, radyasyon örneği korumak için kullanılan ışın saptırma tarafından zarar.
    1. Cryo-istasyonuna Cryo-tutucu yerleştirin ve tutucu ve LN2 ile kriyo-istasyonunun Dewar doldurun. Sıcaklık -192 ° C, tutucu ucu açık deklanşöre ulaştığında, yeri önceden belirlenmiş yerine Cryo-EM ızgara dondurulmuş ve bir halka kelepçe ile sabitleyin.
    2. Elektron mikroskobu içine cryo-tutucu yerleştirin. Cryo-tutucu ve LN2 ile, anti-contaminator odasının Dewar doldurun. Tutucu, 30-60 dakika boyunca stabilize etmek için bekleyin. Basın üzerinde F6 vefilamanı açın. ızgara görüntülemek için tutucuya filaman doymuş, F6 tuşuna basın kapalı ve açık deklanşör.
    3. Basın Low Mag / alfa 1 (200X kadir ayarlanır) ve ızgara üzerinde ince buz alanları bulun.
    4. Minimum doz (MDS) modu ayarlayabilir ve numune zarar vermeden, düşük elektron dozlarda Cryo-EM veri elde etmek MAG 1/alpha 2'ye geçmek.
      1. F2 tuşuna basın arama modunu ayarlamak için. 40.000 x at büyütme ayarlayın. / Å 2 · s - minimal elektron doz brigtness topuzu ~ 0.04 e kirişi büyütün. Basın FARK kırılma moduna geçmek için. MAG / CAM BOYU topuzu ile 120 cm'ye kadar kamera uzunluğunu ayarlayın. Karbon film delikleri lipid nanotüpler var LOWMAG olarak önceden seçilmiş alanlarda ızgara üzerinde alanları bulun.
      2. F4 tuşuna basın 40,000 X büyütmede Fotoğraf modunu ayarlayın ve 16-25 e dozlarda PARLAKLIK topuzu ile aydınlatma ayarlamak için - / Å 2 · s. Z-yüksekliğini ayarlayarak odak koşullarını ayarlamak için basın Standart Odak butonunaZ YUKARI / AŞAĞI düğmeleri (SAĞ kontrol paneli) ile numune. -1.5 Ile -2.5 um arasında ayarlayın odaksızlık.
      3. FOTO modunda yansıması için alana gelen ARAMA modunda dijital kamera monitörde LIVE VIEW penceresinde bir kare çizerek ARAMA ve FOTO modu hizalayın.
      4. F3 tuşuna basın 100.000 X büyütmede Odak modunu ayarlamak için. FOTO modunda yansıması için bölgeyi ışın değil - (5 cm yarıçap ~ 4) ve eksen dışı CCD çipi kapsayacak şekilde aydınlatma odaklanın. FOCUS düğmesi ve DEF / STIG düğme ile görüntü astigmatizma için doğru olan ~ -1.5 ve -2.5 um bulanıklaştırma ayarlayın.
    5. Dijital kamera monitörde LIVE VIEW penceresinde canlı görüntü elde ARAMA modunda yansıması için FVIII-LNT seçin. LIVE VIEW penceresinde çizilen meydanında FVIII-LNT merkezle.
    6. Fotoğraf moduna geçiş ve Acquir tıklayarak 52.000 X etkin büyütme ve 0.5 sn pozlama CCD kamera, bir dijital görüntü kayıtDijital mikrograf kamera monitörde E düğmesine basın. Görüntü elde etme koşulları gibi görüntü FOTO modunda satın yalnızca açık ışın boş (KEPENK) olarak ayarlanır.
    7. Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) elde etmek için CTRL-F tuşlarına basarak elde edilen görüntünün kalitesini ve bulanıklaştırma edin.

3.. 3D İmar

NOT: 2D ve 3D analiz için kullanılan görüntü analiz yazılımı: EMAN2 ve IHRSR serbestçe kullanılabilir. EMAN2 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install indirebilirsiniz. Egelman@virginia.edu: IHRSR Yazılım Profesör Egelman elde edilebilir. Nihai IHRSR iyileştirmeler Teksas üzerinde çalıştırılan merkezi cluster computing gelişmiş: http://www.tacc.utexas.edu/ Texas Üniversitesi, Austin. Şekil 1'de gösterilen 3 boyutlu rekonstrüksiyon algoritması iki ana adımdan oluşur: Birinci 2D referans ücretsiz alignme ile sarmal kesimleri (partiküller) homojen bir dizi seçerkennt (RFA) algoritmaları ikinci IHRSR dahil sarmal parametreleri ve arka projeksiyon algoritmalara dayalı bir 3D yeniden elde, Eman 2. uygulanmaktadır. Http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2: İlk adım Tek Parçacık SPA EMAN2 özel olarak geliştirilen ve dağıtılan edildiği için (algoritmalar) ile 3 boyutlu rekonstrüksiyon için homojen partikül kümelerinin seçilmesi için geliştirilen programlar kullanır. Bu adım, Cryo-EM verilerine adapte edilmiştir. İkinci adım, özellikle yeniden birleştirme Faktörü VIII formları ile elde edilen sarmal düzeneklerinin tipi için tasarlanmıştır IHRSR algoritması ile elde edilir. Bu algoritma, bilimsel literatürde kapsamlı olarak 12 ile belgelenmiştir.

  1. Homojen parçacık sarmal yeniden inşası için (sarmal segment) takımları seçmek için http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16: EMAN2 bilimsel görüntü-işleme suite ile 2D görüntü analizi yapın.
    1. Straig ile Cryo-EM mikrograflannı seçinht ve dijital kamera yazılımı ve görselleştirme araçları ile helezonik tüpler iyi organize.
    2. Invert, normalleştirmek ve e2workflow.py GUI X-ray piksel, tek parçacık rekonstrüksiyonu (SPR) seçeneği için filtre: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. E2helixboxer.py GUI, ters normalize ve X-ışını piksel filtreli görüntüleri içe. Kullanılarak% 90 örtüşme ile 256 x 256 piksel (2.9 Å / pix) de FVIII-LNT sarmal tüpler ve segmentini seçin: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. Orijinal mikrografiklerinden bulanıklaştırma değerlendirmek ve e2workflow.py dahil e2ctf.py seçeneği ile aynı mikrografiklerinden sarmal kesimleri kontrast transfer fonksiyonunu (CTF) düzeltme (sadece faz düzeltme) geçerlidir: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
    5. İlk parçacıklar (sarmal kesimleri) oluşturmak e2workflow.py GUI setleri - SPR seçeneği: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
    6. Iter = 8 - 'e2refine2d.py: e2refine2d.py algoritması komut aşağıdaki, aynı çap LnT ve sarmal düzenin derecesi (Şekil 2) ile homojen veri setleri seçmek için referans ücretsiz k-ortalama sınıflandırma uygulayarak 2D sınıf ortalamaları hesaplamak - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - yolu = r2d_001 - input = INPUT.hdf - ncls = 51 - simcmp = nokta - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = nokta - classraligncmp = faz - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = ortalama - normproj-classkeepsig ', buna göre ncls değerinin değiştirilmesi.
      1. Sınıf ortalamasının daha az% 80 benzerliği ile parçacıkların belirli bir sınıfın dışındadır, yani 'classkeep = 0,8' 8 yineleme üzerinde 150 sınıfların '= 151 NCIS' ayarlanan ilk verileri sınıflandırmak. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. Sınıf ortalamaları partikülleri birleştirmeara veri kümesi oluşturmak için e2display.py içinde belirgin sarmal sapması ile.
      3. Düzenin aynı çap ve derecesi ile sınıfları ayırt etmek için 50 sınıfların '= 51 NCIS'e' ayarlanan ara veri sınıflandırır.
      4. Http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector: üç boyutlu rekonstrüksiyon için nihai veri seti oluşturmak için e2display.py düzenin aynı çap ve derecesi ile sınıflardan parçacıkları birleştirme.
  2. Egelman 17, 18 anlatıldığı gibi, iteratif Helisel Gerçek Uzay Rekonstrüksiyon (IHRSR) algoritması ile sarmal yeniden gerçekleştirin.
    1. Yükselişi tahmin, birleştirilen Fourier FVIII-LNT sarmalın Δz (A), son veri setinde parçacıkların dönüşümü.
    2. 5 ila ΔΦ artan, sabit Δz ile paralel IHRSR refinements çalıştırarak azimuthal açısını ΔΦ (º) tanımlayın76; 5 ° artışlarla 60 °.
    3. Bir başlangıç ​​hacminin bir özelliği olmayan silindir ve 3.2.1 'de tarif edildiği gibi başlangıç ​​parametreleri sarmal Δz ve ΔΦ seti, her son veri 100 ardışık IHRSR döngüleri çalıştırın. ve 3.2.2.
    4. Sınıf nihai veri setinin 2D sınıflandırmadan ortalamalar ve nihai IHRSR yeniden gelen projeksiyonlar arasındaki sarmal parametreleri ve yazışma yakınsama için son hacimleri kontrol edin.
    5. Nihai asimetrik 3B hacminde görülen asimetrik birim dağılımına karşılık gelen nihai 3B rekonstrüksiyon simetri empoze: insan FVIII-Int 4-kat ve domuz FVIII-Int boyunca 5 kat. Son bir simetriklestirilir 3D yeniden oluşturmak için başka bir 100 arıtma döngüleri çalıştırın.
    6. 'E2proc2d.py - bölünmüş = 2 '. 3.2.3 'de tarif edildiği gibi O 100 IHRSR ardışık iyileştirmeler çalıştırın. Tek ve çift veri setlerinden oluşturulan 3D hacimlerinin FSC hesaplayın: 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
  3. Ucsf kimerada FVIII-LNT hacimleri görselleştirmek ve Segment.
    1. Adım 3.2.5 den son hacimleri açın. UCSF Chimera ve ARAÇLAR> SES DATA> SES İZLEYİCİ seçeneğinde 0.005 kontur seviyesini ayarlayın.
    2. ARAÇLAR> SES DATA> BÖLÜMLERE MAP, MAP BÖLÜMLERE sekmesinde seçin hacmi ve segmentinde ses segment tıklayın.
    3. Grup kesimleri CTRL + SHIFT ve tıklayarak grup ile seçerek bir birim hücreye karşılık.
    4. Birim hücre tarafından segmentleri renk ve yapısal özelliklerini vurgulamak için EYLEMLER> RENK seçeneği ile helix.

4. Elektron Tomografi

  1. Olumsuz Vitray FVIII-LNT Numune Hazırlama
    1. Cryo-EM deneyler gibi FVIII-LNT örnekleri hazırlayın.
    2. Kriyo-EM deneyleri için 50 ° W olarak, O, 2 ila 10 saniye boyunca 2 H gaz karışımı içinde, karbon kaplı 300 meşlik bakır ızgara (C tarafı üstte) tahliye Glow.
    3. Şebekeye 6-nm koloidal altın nano partiküller ile 2.5 ul FVIII-LNT süspansiyonu bir damla, fazla sıvıyı leke ve negatif 2 dakika boyunca 5 ul% 1 uranil asetat çözeltisi uygulayarak leke. Izgara kuru aşırı sıvı ve havayı kurulayın.
  2. Elektron Tomografi Veri Toplama
    1. Tek eğim tutucu içine ızgara aktarın.
    2. Elektron mikroskobunda tutucu aktarın.
    3. 52.000 X etkili büyütmede bir CCD kamera ile +60 ° ve kayıt görüntüleri -60 ° 'lik bir açı aralığında 2 ° artışlarla SerialEM yazılımı 19 otomatik eğim serisi toplamak, -6 -10 mikron flulaştırmayla ve 150 elektron doz - 170 electrons / Å 2 · s tomografisinde başına.
  3. FVIII-LnT Elektron Tomografi İmar
    Not: 4.2 edinilen pFVIII-LNT ve hFVIII-LNT eğik serisini yeniden yapılandırma. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html: öğretici aşağıdaki IMOD yazılımın ETomo seçeneği ile
    1. Bir terminal penceresini kullanarak, 3DMOD yılında tomogram açın. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
    2. Bin IMOD BINVOL ile 4 ile tomogram tomografisinde boyutunu azaltmak için emrediyorum.
    3. IMOD ROTATEVOL komutunu kullanarak binned tomografisinde Y-ekseni boyunca lipid nanotüp döndürmek için doğru açıyı seçin.
    4. IMOD ROTATEVOL komutu ile tam tomogram döndürün.
    5. IMOD CLIP RESIZE komutu ile Y-ekseni boyunca yönlendirilmiş seçilen lipid nanotüp kırpın.
    6. 3DMOD ile kırpılmış alt tomogram açın.
    7. Boyunca Faktör VIII moleküllerin düzenleme görselleştirmek için tomografisinde tıklayınZ-ekseninde ve alt tomogram hacminde Y ekseni boyunca dilimleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Rekombinant insan ve domuz FVIII başarılı bir şekilde negatif olarak aktive edilmiş trombosit yüzeyi benzeyen, bir iki-tabaka LNT şarj helezon şeklinde düzenlenmiştir., Insan ve domuz-FVIII Int sarmal düzenleme (Şekil 2), toplanan dijital mikrograflar ile tutarlıdır. Kontrol LNT ve insan ve domuz-FVIII LNT sarmal borular seçilir ve e2helixboxer.py GUI ve e2workflow.py GUI, tek parçacık seçeneği (Tablo 1) ile oluşturulan ilk veri setleri ile sınıflandırılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, bir yöntem son derece homolog proteinlerin iki zara bağlı kuruluşlar arasında ayırt etmek için sunulmuştur: İnsan ve domuz FVIII kendini monte insan vücudunda karşılaşılan koşullarda lipid nanotupler on.

Açıklanan prosedür, insan ve domuz FVIII başarıyla en kritik adımdır, lipid nanotüpler helozonik düzenlenmektedir. Sonraki kritik adım yakınındaki sıvı N 2 sıcaklıkta flaş donma sonucu ince amorf buz örnek korumaktır. Amorf ve buz LN2 sıca...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali ilgi var ve onlar bu yazının yayınlanmış işlemlerin herhangi ilgili olarak doğrudan temasa geçilebilir beyan.

Teşekkürler

10SDG3500034 ve UTMB-NCB SSM'ye fonları başlatmak: Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Ulusal Bilim Geliştirme hibe ile desteklenmektedir. Yazarlar Sealy UTMB Structural Biyoloji Merkezi'nin (en Cryo-EM ve Bilimsel Hesaplama tesisleri kabul www.scsb.utmb.edu ) yanı sıra, Dr. 2D ve 3D sarmal rekonstrüksiyon algoritmaları ile yardım Steve Lüdtke ve Ed Egelman.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
LaB6JEOL Ltd. ile JEM2100.JEM-2100200 kV'da çalıştırıldı
.
Gatan626 Kriyo tutucuGatan, Inc.626.DH-175 dereceye kadar soğutuldu;
Sıcaklık kontrol ünitesi Gatan, Inc.
Gatan 4K x 4K CCD kameraGatan, Inc.US40004,096 x 4,096 piksel, 15 &mu'da; m/piksel fiziksel çözünürlük
Solarus Model 950 plazma temizleyiciGatan, Inc.
Vitrobot Mark IVFEI
Karbon kaplı 300 gözenekli 3 mm bakır ızgaraTed Pella01821plazma yüksek güçlü
Quantifoil R2/2 300 gözlüElektron Mikroskobu BilimleriQ225-CR2Karbon kaplı 300 gözlü Cu ızgaralar, 2 mm çapında delikler 
Uranil asetat dihidratTed Pella19481% 1 çözelti, filtrelenmiş
Galaktosil seramidAvanti Polar Lipids Inc.
Dioleoil- sn< / em>-glisero-fosfo-L-serinAvanti Polar Lipids Inc.
EM yazılımı Digital MicrographGatan, Inc.http://www.gatan.com/DM/
EM yazılımı EMANücretsiz indirmehttp://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
>EM yazılımı Örümcekücretsiz indirmehttp://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EM yazılımı IHRSRücretsiz indirmeEdward H. Egelman'dan edinilebilecek programlar http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EM yazılımı (IMOD)ücretsiz indirmehttp://bio3d.colorado.edu/imod/ 
>EM yazılımı (SerialEM)ücretsiz indirmeftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimeraücretsiz indirmehttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html
, TEMCON yazılımı JEOL Ltd. ile ile C860546840035

Kaynaklar

  1. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
  2. Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
  3. Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
  4. Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
  5. Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. , (2013).
  6. Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
  7. Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
  8. Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
  9. Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
  10. Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
  11. Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
  12. Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
  13. Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
  14. Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
  15. Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
  16. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
  17. Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
  18. Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  20. Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
  21. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kriyo EMHelikal Rekonstr ksiyonElektron Tomografisinsan Domuz FVIIIMembran Ba l YapYap sal Biyoloji3B Rekonstr ksiyon
Lipid Nanotüpler Kan Pıhtılaşma Faktör VIII Sarmal Organizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.