Yöntem makalesi

Sürekli Akış Microspotter kullanma Modifiye yüzeye hücrelerin Batık Baskı

DOI:

10.3791/51273

⸱

22 Nisan 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wasatch Microfluidics, 2Department of Mechanical Engineering, University of Utah

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu 3D mikroakışkan baskı teknolojisi, hücre dizilerini batık yüzeylere yazdırır. Hücre dizilerinin 3D akış hücrelerinde mikroakışkan olarak batık yüzeylere nasıl iletildiğini açıklıyoruz. Batık yüzeylere baskı yapılarak, çok sayıda alanda ilaç taraması ve sitotoksisite değerlendirmesine izin veren hücre mikrodizileri üretildi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodizi uygulamaları için hücrelerin basılması, baskıdan sonra fizyolojik olarak ilgili hücre fenotipini koruma sorunu, istenen hücrelerin zayıf organizasyonu ve dağılımı ve dizi içinde hedeflenen alanlara ilaç ve/veya besin sağlayamama gibi önemli zorluklara sahiptir. 3D mikroakışkan baskı teknolojimiz, hücre dizilerini otomatik ve çoğullanmış bir şekilde batık yüzeylere benzersiz bir şekilde sızdırmaz hale getirme ve yazdırma yeteneğine sahiptir. Mikroakışkan hücre dizisi (MFCA) 3D akışkanların tasarımı, yazıcı kafası ucunun sıvı dolu bir kuyuya veya tabağa indirilmesini ve bir sızdırmazlık oluşturmak için bir yüzeye sıkıştırılmasını sağlar. Baskı kafasının yumuşak silikon ucu bir conta gibi davranır ve basınç uygulayarak veya geri çekilerek ters çevrilebilir bir conta oluşturabilir. Pin veya mürekkep püskürtmeli yazıcılar gibi diğer hücre yazdırma teknolojileri, batık uygulamalarda yazdırma yapamaz. Batık yüzey baskısı, hücrelerin fenotiplerini korumak ve bu hücreleri, malzeme yüzey özelliklerini bozmadan bir yüzey üzerinde izlemek için gereklidir. Batık yüzeylere baskı yaparak, kanser, diyabet, iltihaplanma, enfeksiyonlar ve kardiyovasküler hastalık dahil olmak üzere çok sayıda alanda ilaç taraması ve sitotoksisite değerlendirmesine izin veren hücre mikrodizileri üretilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilaç endüstrisinde son gelişmeler, ilaç tarama ve cytotoxicological analiz 1,2,3 için ilaç keşfi sürecinde hücresel mikrodiziler kullanarak artan ilgi yol açmıştır. Hücre mikrodizileri kullanılarak in vitro yüksek verimli tarama deneyleri ve yöntemlerinin geliştirilmesi, hızlı ve düşük maliyetli bir ilaç adaylarının gelişimi hem de önceden hücrenin 1,4 temel anlayışı kolaylaştıracaktır. Hücreleri ile tarama için geleneksel yaklaşım, geleneksel iyi-plaka platformları kullanır; Ancak bu yaklaşım nedeniyle yüksek maliyet, sınırlı verim ve hücre fonksiyonu 1,5 nicel bilgi için sınırlı yeteneği sınırlıdır. Bu sınırlamalar nedeniyle, hücresel mikroarray teknolojileri araştırma moleküler biyolojik karakterizasyonu, doku mühendisliği ve ilaç tarama 1,6 için gelişen edilir. Hücresel microarrays avantajları küçük bir örnek kullanımı, minimal etkilerini içerirhücresel fenotip heterojenite bilgi maskeleme ve daha yüksek hacimli uygulamalar 1,7,8 için tahliller otomatikleştirmek için en önemlisi yetenek.

Farmasötik sanayi şu anda mikrotiter yuvalı plakalar 9 ilaç taraması için 2B hücre tek-tabakalı kültürler ile yüksek yayılmalı hücre bazlı bir tarama tahlilleri kullanır. Mikrotitre plakalara çoğullama hücreleri özgün deney seçenekleri ile daha yüksek verim için potansiyel sunmaktadır. Bundan başka, hücre mikrodizilerinde mevcut teknolojiler, hücreler, in vivo önemli ölçüde 10,11 gelen hücrelerin fenotipinin değiştirebilir ki kurumaya bırakın. Bu sorunların üstesinden gelmek için, MFCA tasarlanmış ve Şekil 1 'de gösterilmiştir. MFCA 3D akışkansal tasarımı bir banyoya daldırılır ve bir yalıtım oluşturmak için bir yüzeye karşı sıkıştırılmak üzere, Şekil 1' deki baskı kafası ucu sağlar. Kafasının yumuşak silikon ucu gibi davranırConta ve geri dönüşümlü bir mühür oluşturur. MFCA teknolojisi, özellikle, hücre kültürleri, doku dilim sistemler için gerekli olan batık yüzeyleri ile arabirim oluşturmak için uygun, ve diğer yaklaşımlar ile zor veya imkansız olur. Pimleri veya mürekkep püskürtmeli baskı çalışmaz, ve 2D mikroakışkan cihazlar birikimi veya ayrık noktalar büyük diziler ile arabirim için uygun değildir. Bundan başka, deney minyatürleştirme ve lokalize ile - hücresel mikro-dizi - MFCA, yüksek yayılmalı hücre bazlı tarama deneyleri ile ilgili önemli problemlerin üstesinden gelmektedir.

CFM bir yüzey 12,13 mikroskobik nokta yerlerine bisikletle küçük hacimli sıvı örneklerinin 3D kanal ağlarını kullanır. Akış ile baskı ile, biyomoleküller, hücreler ve diğer reaktifler, mevcut hücre baskı teknikleri engellemektedir hava, maruz kalmadan hassas biyomoleküllerin ve hücrelerin baskı sağlayan, baskı işlemi boyunca sıvı bir ortamda muhafaza edilir. Bu dizi yüzeyde bir yakalama mekanizması vardır örneğin, hibridoma süpernatanları ya da sağlanan gibi ham malzeme doğrudan baskı için de mümkündür. Bu yazının amacı, bir yüzey üzerine ayrıntılı olarak, iki hücre tiplerinin batık baskı açıklamaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Kültür HAZIRLIĞI Hücre

  1. Kullanıma hazır olana kadar sıvı azot içinde NIH/3T3 hücre stokları saklayın.
  2. 50 ug / ml streptomisin,% 10 fetal sığır serumu, 10 mM HEPES tampon maddesi, 50 birim / ml penisilin, ve ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kullanılarak NIH/3T3 hücreleri için tam ortam hazırlayın.
  3. 37 ° C 'de çalkalayıcı bir su banyosu içinde 2-3 dakika için hücreler Çözülme
  4. 3 dakika boyunca 1,500 x g de tam ortam ve santrifüj içinde 5 ml içinde süspanse hücreler.
  5. Hücre topaklarını bozmadan hücre süpernatantı.
  6. Medya 5 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
    1. Bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu ve yerine 10 ul çıkarın.
    2. Hücre süspansiyonuna Trypan Blue 10 ul ilave edin ve pipet ucu ile karıştırın.
    3. Pipet bir hemositometre odasına boyanmış hücrelerin 10 ul.
    4. 10x hemositometrede hücreleri saymakbüyütme.
      1. 9 büyük kareler 4 için canlı hücreleri (küçük, beyaz top) saymak. Sadece Tripan Mavi leke koyu mavi görünmüyor canlı hücreleri saymak.
      2. Hücreler orijinal hücre süspansiyon içinde 4 x 10 hücre / ml sayısının sonuçlanan büyük kare başına hücrelerin ortalama sayısını hesaplayın.
      3. 1 x10 her bir T25 şişesi içinde, 5 ml toplam 5 hücre / ml bir yoğunlukta tohum hücreleri.
    5. Başlamadan deneylerden önce,% 70 ve% 80 confluency arasına Kültür hücreleri. Gerektiğinde her 2-3 gün medya Yenile ya.

2.. Baskı Yüzey Hazırlama

  1. Mark, bir doku kültürü ile muamele edilmiş polistiren (TCTPS) 12 çukurlu levha altındaki işaretleyici ile bir dikdörtgen baskı kafası (19 mm x 7 mm) boyutudur.
  2. Pipet 50 dikdörtgen alanı içine fetal sığır serumu ul ve ucu ile tüm bölge üzerine yayıldı.
  3. Petri kabı bırakınSteril bir biyogüvenlik kaput O / N serum nokta tamamen kuruması için. Bu plakalar kullanmak için en fazla 2 gün önce hazırlanmalıdır.

3.. Batık Baskı

  1. Distile su ile baskı kafasını durulayın.
    1. Damıtılmış su ile bir 60 mm Petri kabı doldurmak ve yüzey üzerine baskı kafası rıhtım.
    2. Pnömatik bir pompa kullanılarak 150 ul / dakika ile 2 dakika boyunca çizgilerin her birinden damıtılmış su akış.
    3. Petri kabı suyu atmak ve temiz su ile doldurun.
    4. Su yukarı ve aşağı 3 kez baskı kafasını hareket ettirin.
  2. Önceden hazırlanmış 12 oyuklu bir plaka içerisinde serum kaplı nokta üzerinde baskı kafası merkezi olarak yerleştirir.
  3. Başbakan önceden ısıtılmış eksiksiz bir medya, kanal başına 300 ul ile baskı kafası.
  4. Baskı, bir yüzey üzerine 50,000 hücre / ml 'lik konsantrasyon ile 60 ul / dk, kanal başına 100 ul süspansiyon hücreleri.
  5. Karşı demirledi sol baskı kafasını, yerleştirinyüzey ve bir hücre kültürü inkübatöründe manifold 2 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C olarak ayarlanır.
  6. 2 saat inkübasyondan sonra, baskı kafası çıkarın ve kültür çanağı üzerindeki kapağı yerleştirin. Yazıcı kafası kaldırıldı hangi süre 0 saat zaman noktası olarak kabul edilir.

4. Standard Hücre Kültürü

  1. Aşama 2'de hazırlanan serum benekli TCTPS 12 oyuklu plaka birine önceden ısıtılmış ortam 1 ml ilave edilir.
  2. Bir 12-yuvalı plaka TCTPS tek bir kuyuya pipetle adım 2 ve geri kalan hücre süspansiyonu 1 ml al. Bu tabak içinde 50,000 hücre ihtiva eden bir kültür üretecektir.
  3. 2 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatör içinde, hücre kültürü plakası yerleştirin.
  4. 2 saat kuluçka zamanlaması başladıktan sonra; baskılı ve tohum örnekleri arasındaki tutarlılık için, bu 0 hr zaman noktası olarak kabul edilir.

5. Kültür Görselleştirme

  1. 0, 2, 24, ve iki yöntemlerin her biri 48 saat sonra, germe hücre dStandart bir ters mikroskop kullanılarak, yukarıda ve görüntü TANIMLANMIŞ.
    1. Propidyum iyodür, sadece ölü hücre çekirdeği içine dahil edilen kırmızı bir floresan boya kullanarak hücreleri Leke.
      1. Yavaşça kalsiyum ve pislikleri kaldırmak magnezyum (PBS + +) ile fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml ile hücreler 3 kez yıkayın.
      2. Her bir kültür teknesine, önceden ısıtılmış PBS + + 1 ml ilave edilir.
      3. Her bir kültür teknesine propidyum iyodür stok çözeltisi (1 mg / ml) 1 ul ekle.
      4. 10 dakika boyunca 37 ° C 'de propidyum iyodürle boyanan hücreleri inkübe edin.
    2. Görüntü ters bir 10x ve 40x büyütme mikroskop kullanarak hücreleri.
  2. Uygun bir biohazard konteyner hücreleri atın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibroblast hücre hattı NIH/3T3 hücreler, bir dalgıç yüzey üzerine basılı veya ekilmiştir. Hücreler, ml başına 5 x 10 4 hücre yoğunluğuna kadar büyütülmüştür. Hücreler, geleneksel hücre kültürü teknikleri kullanılarak ekilmiştir. Hücreler, geniş ebatlı, kanal proteinleri ve diğer biyomoleküllerin için kullanılan daha CFM (~ 500 um) daha büyük olan on iki akış hücresi baskı kafası kullanılarak basıldı. Hücreler serum kaplı yüzey üzerine basılı veya ekilmiştir. Baskı işlemi Şekil 1 de gösterilmi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada anlatılan 3D mikroakışkan baskı teknolojisi, iyi doldurulmuş bir sıvının içine hücre microfluidically baskı dizilerin benzersiz yeteneğine sahip bir batık yüzeyini yani. Batık yüzeyleri üzerine baskı ile, hücre mikroarray'ler hücrelerin fizyolojik olarak ilgili hücre fenotipi hem de tek bir iyi Şekil 4'ün alt hücreleri multiplex yeteneğini korumak üretilebilir. Microfluidically hücreleri sonuçlar baskı Bu çalışmanın sonuçları, karşılaştırılabilir hücre morfolojisi ve canlılığı il...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar reaktifler ve / veya bu metinde kullanılan aletleri üreten Wasatch Microfluidics çalışanı ve hissedarları vardır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, teknik yardım için Chris Morrow kabul etmek istiyorum. Finansman NIH SBIR (R43) tarafından sağlanan 1R43GM101859-01 (MPİ) GRANT10940803 vermek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sürekli akışlı mikrospotterWasatch Mikroakışkanlar
NIH/3T3 hücreleriATCCCRL-1658
Dubbleco'nun Modifiye Eagle MediumInvitrogen11965-092Hücreler için temel ortam
HEPES tamponuInvitrogen15630-080Hücre ortamı katkı maddesi (kontrol pH)
Sodyum piruvatInvitrogen11360-070Hücre ortamı katkı maddesi
Penisilin-streptomisin InvitrogenHücre ortamı katkı maddesi
Tripan mavisiInvitrogen15250-061Leke hücresi sayımı için
HemositometreFisher267110Hücreleri saymak için hücre odası
Nikon Eclipse TS100NikonHücreleri kontrol etmek için kullanılır
Nikon Eclipse TE2000-UNikonGörüntü toplamak
için kullanılırFosfat tamponlu salin (kalsiyum ve magnezyum ile)Invitrogen14040-133Hücrelerin pasajdan önce ve PI TrypLE Express ile boyamadan önce durulanması
 InvitrogenA12177-01Hücreleri yüzeyden çıkarmak için kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
  2. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
  3. Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
  4. Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
  5. Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
  6. Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
  7. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
  8. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  9. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
  10. Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
  11. Liu, R., Lee, A. P. Integrated Biochips for DNA Analysis. , Springer. (2008).
  12. Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
  13. Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
  14. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , Summer 2011. Drug Discovery World Online at: http://www.ddw-online.com/p-149288 (2011).
  15. Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
  16. Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107(1993).
  17. Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
  18. Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
  19. Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
  20. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
  21. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
  22. Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
  23. Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Submerged Cell PrintingContinuous Flow MicrospotterCell MicroarrayFluorescence MicroscopyPropidium Iodide StainNIH 3T3 FibroblastsSerum Coated SurfaceCell Viability AssessmentDrug Screening ApplicationCell Density Analysis

İlgili makaleler