Sürekli Akış Microspotter kullanma Modifiye yüzeye hücrelerin Batık Baskı

Summary

Bu 3D mikroakışkan baskı teknolojisi, hücre dizilerini batık yüzeylere yazdırır. Hücre dizilerinin 3D akış hücrelerinde mikroakışkan olarak batık yüzeylere nasıl iletildiğini açıklıyoruz. Batık yüzeylere baskı yapılarak, çok sayıda alanda ilaç taraması ve sitotoksisite değerlendirmesine izin veren hücre mikrodizileri üretildi.

Abstract

Mikrodizi uygulamaları için hücrelerin basılması, baskıdan sonra fizyolojik olarak ilgili hücre fenotipini koruma sorunu, istenen hücrelerin zayıf organizasyonu ve dağılımı ve dizi içinde hedeflenen alanlara ilaç ve/veya besin sağlayamama gibi önemli zorluklara sahiptir. 3D mikroakışkan baskı teknolojimiz, hücre dizilerini otomatik ve çoğullanmış bir şekilde batık yüzeylere benzersiz bir şekilde sızdırmaz hale getirme ve yazdırma yeteneğine sahiptir. Mikroakışkan hücre dizisi (MFCA) 3D akışkanların tasarımı, yazıcı kafası ucunun sıvı dolu bir kuyuya veya tabağa indirilmesini ve bir sızdırmazlık oluşturmak için bir yüzeye sıkıştırılmasını sağlar. Baskı kafasının yumuşak silikon ucu bir conta gibi davranır ve basınç uygulayarak veya geri çekilerek ters çevrilebilir bir conta oluşturabilir. Pin veya mürekkep püskürtmeli yazıcılar gibi diğer hücre yazdırma teknolojileri, batık uygulamalarda yazdırma yapamaz. Batık yüzey baskısı, hücrelerin fenotiplerini korumak ve bu hücreleri, malzeme yüzey özelliklerini bozmadan bir yüzey üzerinde izlemek için gereklidir. Batık yüzeylere baskı yaparak, kanser, diyabet, iltihaplanma, enfeksiyonlar ve kardiyovasküler hastalık dahil olmak üzere çok sayıda alanda ilaç taraması ve sitotoksisite değerlendirmesine izin veren hücre mikrodizileri üretilir.

Introduction

Ilaç endüstrisinde son gelişmeler, ilaç tarama ve cytotoxicological analiz ^1,2,3 için ilaç keşfi sürecinde hücresel mikrodiziler kullanarak artan ilgi yol açmıştır. Hücre mikrodizileri kullanılarak in vitro yüksek verimli tarama deneyleri ve yöntemlerinin geliştirilmesi, hızlı ve düşük maliyetli bir ilaç adaylarının gelişimi hem de önceden hücrenin ^1,4 temel anlayışı kolaylaştıracaktır. Hücreleri ile tarama için geleneksel yaklaşım, geleneksel iyi-plaka platformları kullanır; Ancak bu yaklaşım nedeniyle yüksek maliyet, sınırlı verim ve hücre fonksiyonu ^1,5 nicel bilgi için sınırlı yeteneği sınırlıdır. Bu sınırlamalar nedeniyle, hücresel mikroarray teknolojileri araştırma moleküler biyolojik karakterizasyonu, doku mühendisliği ve ilaç tarama ^1,6 için gelişen edilir. Hücresel microarrays avantajları küçük bir örnek kullanımı, minimal etkilerini içerirhücresel fenotip heterojenite bilgi maskeleme ve daha yüksek hacimli uygulamalar ^1,7,8 için tahliller otomatikleştirmek için en önemlisi yetenek.

Farmasötik sanayi şu anda mikrotiter yuvalı plakalar ⁹ ilaç taraması için 2B hücre tek-tabakalı kültürler ile yüksek yayılmalı hücre bazlı bir tarama tahlilleri kullanır. Mikrotitre plakalara çoğullama hücreleri özgün deney seçenekleri ile daha yüksek verim için potansiyel sunmaktadır. Bundan başka, hücre mikrodizilerinde mevcut teknolojiler, hücreler, in vivo önemli ölçüde ^10,11 gelen hücrelerin fenotipinin değiştirebilir ki kurumaya bırakın. Bu sorunların üstesinden gelmek için, MFCA tasarlanmış ve Şekil 1 'de gösterilmiştir. MFCA 3D akışkansal tasarımı bir banyoya daldırılır ve bir yalıtım oluşturmak için bir yüzeye karşı sıkıştırılmak üzere, Şekil 1' deki baskı kafası ucu sağlar. Kafasının yumuşak silikon ucu gibi davranırConta ve geri dönüşümlü bir mühür oluşturur. MFCA teknolojisi, özellikle, hücre kültürleri, doku dilim sistemler için gerekli olan batık yüzeyleri ile arabirim oluşturmak için uygun, ve diğer yaklaşımlar ile zor veya imkansız olur. Pimleri veya mürekkep püskürtmeli baskı çalışmaz, ve 2D mikroakışkan cihazlar birikimi veya ayrık noktalar büyük diziler ile arabirim için uygun değildir. Bundan başka, deney minyatürleştirme ve lokalize ile - hücresel mikro-dizi - MFCA, yüksek yayılmalı hücre bazlı tarama deneyleri ile ilgili önemli problemlerin üstesinden gelmektedir.

CFM bir yüzey ^12,13 mikroskobik nokta yerlerine bisikletle küçük hacimli sıvı örneklerinin 3D kanal ağlarını kullanır. Akış ile baskı ile, biyomoleküller, hücreler ve diğer reaktifler, mevcut hücre baskı teknikleri engellemektedir hava, maruz kalmadan hassas biyomoleküllerin ve hücrelerin baskı sağlayan, baskı işlemi boyunca sıvı bir ortamda muhafaza edilir. Bu dizi yüzeyde bir yakalama mekanizması vardır örneğin, hibridoma süpernatanları ya da sağlanan gibi ham malzeme doğrudan baskı için de mümkündür. Bu yazının amacı, bir yüzey üzerine ayrıntılı olarak, iki hücre tiplerinin batık baskı açıklamaktır.

Protocol

1.. Kültür HAZIRLIĞI Hücre

1. Kullanıma hazır olana kadar sıvı azot içinde NIH/3T3 hücre stokları saklayın.
2. 50 ug / ml streptomisin,% 10 fetal sığır serumu, 10 mM HEPES tampon maddesi, 50 birim / ml penisilin, ve ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kullanılarak NIH/3T3 hücreleri için tam ortam hazırlayın.
3. 37 ° C 'de çalkalayıcı bir su banyosu içinde 2-3 dakika için hücreler Çözülme
4. 3 dakika boyunca 1,500 x g de tam ortam ve santrifüj içinde 5 ml içinde süspanse hücreler.
5. Hücre topaklarını bozmadan hücre süpernatantı.
6. Medya 5 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
   1. Bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu ve yerine 10 ul çıkarın.
   2. Hücre süspansiyonuna Trypan Blue 10 ul ilave edin ve pipet ucu ile karıştırın.
   3. Pipet bir hemositometre odasına boyanmış hücrelerin 10 ul.
   4. 10x hemositometrede hücreleri saymakbüyütme.
      1. 9 büyük kareler 4 için canlı hücreleri (küçük, beyaz top) saymak. Sadece Tripan Mavi leke koyu mavi görünmüyor canlı hücreleri saymak.
      2. Hücreler orijinal hücre süspansiyon içinde ⁴ x 10 hücre / ml sayısının sonuçlanan büyük kare başına hücrelerin ortalama sayısını hesaplayın.
      3. 1 x10 her bir T25 şişesi içinde, 5 ml toplam ⁵ hücre / ml bir yoğunlukta tohum hücreleri.
   5. Başlamadan deneylerden önce,% 70 ve% 80 confluency arasına Kültür hücreleri. Gerektiğinde her 2-3 gün medya Yenile ya.

2.. Baskı Yüzey Hazırlama

1. Mark, bir doku kültürü ile muamele edilmiş polistiren (TCTPS) 12 çukurlu levha altındaki işaretleyici ile bir dikdörtgen baskı kafası (19 mm x 7 mm) boyutudur.
2. Pipet 50 dikdörtgen alanı içine fetal sığır serumu ul ve ucu ile tüm bölge üzerine yayıldı.
3. Petri kabı bırakınSteril bir biyogüvenlik kaput O / N serum nokta tamamen kuruması için. Bu plakalar kullanmak için en fazla 2 gün önce hazırlanmalıdır.

3.. Batık Baskı

1. Distile su ile baskı kafasını durulayın.
   1. Damıtılmış su ile bir 60 mm Petri kabı doldurmak ve yüzey üzerine baskı kafası rıhtım.
   2. Pnömatik bir pompa kullanılarak 150 ul / dakika ile 2 dakika boyunca çizgilerin her birinden damıtılmış su akış.
   3. Petri kabı suyu atmak ve temiz su ile doldurun.
   4. Su yukarı ve aşağı 3 kez baskı kafasını hareket ettirin.
2. Önceden hazırlanmış 12 oyuklu bir plaka içerisinde serum kaplı nokta üzerinde baskı kafası merkezi olarak yerleştirir.
3. Başbakan önceden ısıtılmış eksiksiz bir medya, kanal başına 300 ul ile baskı kafası.
4. Baskı, bir yüzey üzerine 50,000 hücre / ml 'lik konsantrasyon ile 60 ul / dk, kanal başına 100 ul süspansiyon hücreleri.
5. Karşı demirledi sol baskı kafasını, yerleştirinyüzey ve bir hücre kültürü inkübatöründe manifold 2 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C olarak ayarlanır.
6. 2 saat inkübasyondan sonra, baskı kafası çıkarın ve kültür çanağı üzerindeki kapağı yerleştirin. Yazıcı kafası kaldırıldı hangi süre 0 saat zaman noktası olarak kabul edilir.

4. Standard Hücre Kültürü

1. Aşama 2'de hazırlanan serum benekli TCTPS 12 oyuklu plaka birine önceden ısıtılmış ortam 1 ml ilave edilir.
2. Bir 12-yuvalı plaka TCTPS tek bir kuyuya pipetle adım 2 ve geri kalan hücre süspansiyonu 1 ml al. Bu tabak içinde 50,000 hücre ihtiva eden bir kültür üretecektir.
3. 2 saat boyunca 37 ° C'de bir inkübatör içinde, hücre kültürü plakası yerleştirin.
4. 2 saat kuluçka zamanlaması başladıktan sonra; baskılı ve tohum örnekleri arasındaki tutarlılık için, bu 0 hr zaman noktası olarak kabul edilir.

5. Kültür Görselleştirme

1. 0, 2, 24, ve iki yöntemlerin her biri 48 saat sonra, germe hücre dStandart bir ters mikroskop kullanılarak, yukarıda ve görüntü TANIMLANMIŞ.
   1. Propidyum iyodür, sadece ölü hücre çekirdeği içine dahil edilen kırmızı bir floresan boya kullanarak hücreleri Leke.
      1. Yavaşça kalsiyum ve pislikleri kaldırmak magnezyum (PBS + +) ile fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml ile hücreler 3 kez yıkayın.
      2. Her bir kültür teknesine, önceden ısıtılmış PBS + + 1 ml ilave edilir.
      3. Her bir kültür teknesine propidyum iyodür stok çözeltisi (1 mg / ml) 1 ul ekle.
      4. 10 dakika boyunca 37 ° C 'de propidyum iyodürle boyanan hücreleri inkübe edin.
   2. Görüntü ters bir 10x ve 40x büyütme mikroskop kullanarak hücreleri.
2. Uygun bir biohazard konteyner hücreleri atın.

Results

Fibroblast hücre hattı NIH/3T3 hücreler, bir dalgıç yüzey üzerine basılı veya ekilmiştir. Hücreler, ml başına 5 x 10 ⁴ hücre yoğunluğuna kadar büyütülmüştür. Hücreler, geleneksel hücre kültürü teknikleri kullanılarak ekilmiştir. Hücreler, geniş ebatlı, kanal proteinleri ve diğer biyomoleküllerin için kullanılan daha CFM (~ 500 um) daha büyük olan on iki akış hücresi baskı kafası kullanılarak basıldı. Hücreler serum kaplı yüzey üzerine basılı veya ekilmiştir. Baskı işlemi Şekil 1 de gösterilmi...

Discussion

Burada anlatılan 3D mikroakışkan baskı teknolojisi, iyi doldurulmuş bir sıvının içine hücre microfluidically baskı dizilerin benzersiz yeteneğine sahip bir batık yüzeyini yani. Batık yüzeyleri üzerine baskı ile, hücre mikroarray'ler hücrelerin fizyolojik olarak ilgili hücre fenotipi hem de tek bir iyi Şekil 4'ün alt hücreleri multiplex yeteneğini korumak üretilebilir. Microfluidically hücreleri sonuçlar baskı Bu çalışmanın sonuçları, karşılaştırılabilir hücre morfolojisi ve canlılığı il...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sürekli akışlı mikrospotter	Wasatch Mikroakışkanlar
NIH/3T3 hücreleri	ATCC	CRL-1658
Dubbleco'nun Modifiye Eagle Medium	Invitrogen	11965-092	Hücreler için temel ortam
HEPES tamponu	Invitrogen	15630-080	Hücre ortamı katkı maddesi (kontrol pH)
Sodyum piruvat	Invitrogen	11360-070	Hücre ortamı katkı maddesi
Penisilin-streptomisin	Invitrogen		Hücre ortamı katkı maddesi
Tripan mavisi	Invitrogen	15250-061	Leke hücresi sayımı için
Hemositometre	Fisher	267110	Hücreleri saymak için hücre odası
Nikon Eclipse TS100	Nikon		Hücreleri kontrol etmek için kullanılır
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		Görüntü toplamak
için kullanılırFosfat tamponlu salin (kalsiyum ve magnezyum ile)	Invitrogen	14040-133	Hücrelerin pasajdan önce ve PI TrypLE Express ile boyamadan önce durulanması
	Invitrogen	A12177-01	Hücreleri yüzeyden çıkarmak için kullanılır