Method Article

Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

DOI:

10.3791/51295

⸱

January 22nd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Akron

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyotinile füzyon proteinleri geliştirerek araştırma çeşitli alanlarda birçok potansiyel uygulamalar vardır. Yeniden birleştirici protein mühendisliği özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verim sağlayan, düşük maliyetli olan bir düz ön işlemdir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeniden birleştirici protein mühendisliği Escherichia coli (E. coli) sentezleme yaklaşık 4 yıldır sistemleri ve bugün kullanmıştır E. coli halen en yaygın olarak kullanılan konak organizmadır. Sistemin esneklik, (streptavidin etkileşimler için) bir biyotin etiketi olarak yarımlar ve yeşil fluoresan protein ya da kiraz, kırmızı proteini gibi daha büyük fonksiyonel proteinlerin eklenmesi için izin verir. Ayrıca, post-translasyonel modifikasyonlar kazandıran metal iyonu kenetleyiciler, eşsiz bir biçimde reaktif fonksiyonel grup, spektroskopik sondaları ve moleküller gibi doğal olmayan amino asitlerin protein entegrasyon özelliklerine sahiptir, daha iyi bir manipülasyon sağladı. Sonuç olarak, bu teknik, bir araştırma çeşitli alanları için anlamlı bir yarar sunan özelleştirilebilir füzyon proteinleri oluşturur. Daha özel olarak, biyotinile protein dizisi için avidin ve biotin streptavidin ile arasındaki yüksek afiniteli bir etkileşim çok hedef proteinler dahil edilmiştir. Bu ek etiketli proteinlerin tespiti ve arıtılmasını artırılması yanı sıra hücre sıralama gibi ikincil uygulamalar için önünü açarak destekli vardır. Bu nedenle, biyotin-etiketli moleküller bioindustrial ve biyomedikal alanlarda artan bir ve yaygın etkisini göstermektedir. Araştırmamız amaçla, sinir büyüme faktörünü (NGF) ve semaphorin3A (Sema3A) fonksiyonel bölgeler ihtiva eden yeniden birleştirici füzyon proteinleri biyotinile tasarladık. Bunların biyotinile füzyon proteinleri, diğer aktif protein dizileri ile birlikte, doku mühendisliği ve rejeneratif amacıyla Biyomalzemelere gergin nasıl daha önce bildirilmiştir. Bu protokol bir T7 lak uyarılabilir vektör ve E. kullanan miligram ölçeğinde mühendislik biyotinile proteinlerin temel özetliyor dönüşüm şekilde büyütülebilir-up ve arıtma için başlangıç ​​coli sentezleme ana.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinler sonuçta uygun doku oluşumu ve organizasyon açan, birçok biyolojik fonksiyon için sorumlu biyomoleküllerin geniş bir yelpazeyi kapsamaktadır. Bu moleküller, insan vücudu içinde bir denge sağlamak, düzenleme-yukarı ve / veya aşağı-regülasyonu gen ve proteinlerin kontrol sinyal yollarının binlerce başlatır. Tek bir protein bozulması yıkıcı bozukluklar ya da hastalıkların başlangıcı yol açabilir sinyallerin tüm bu ağ-etkiler. Laboratuarda bireysel protein mühendislik bu olumsuz etkileri ile mücadele için tek bir çözüm sunar ve küçük moleküllü ilaçlar için bir alternatif sunuyor. 1977 yılında, 14 amino asit sekansını kodlayan bir somatostatin gen E. ku....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Hedef Protein Tasarımı

  1. Biyoteknoloji Bilgi sitesi için Ulusal Merkezi'ni kullanma (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) dikkate ilgi ve herhangi bir ek yeri varyantları tür alarak hedef protein için bir amino dizisini elde. Proteinin ilgi aktif bölgesine karşılık gelen amino asit dizisini seçin.
    Not: Sema3A için, amino asitler 21-747 seçilmiştir. Bir füzyon proteini barstarın, bir amino asit, 1-90 dizisi, NGF amino asitler 122-241 'e eklendi NGF ile tasarlanmıştır.
  2. N-terminal dizileri takip eklemek için: arıtma için 6X His etiketi (HHHHHH), Tütün Etch Virüsü His etiketinin çıkarılması için (TEV) proteaz kesme bölgesi ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonlama ve ifade Testi

Kaplama düzgün yapıldığında, tek bir izole koloniler klonal transforme bakteriler hücreleri (Şekil 2A) koparma şansını artırmak için oluşturmalıdır. Çok sayıda hücre plakalanır, ancak plakalar 37 ° C ya da dönüşüm çok uzun inkübe edilir koloniler agar plaka kapak veya hücre daha büyük agregalar (Şekil 2B ve 2C) oluşturabilmektedir, sorgulanabilir. Test ifade sırasında NGF ve Sema3A ilk 37 ° C'de 4 saa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant protein mühendisliği birçok disiplinin yayılan çok güçlü bir tekniktir. Bu, özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verimle üretimini sağlayan, düşük maliyetli, ayarlanabilir ve nispeten basit bir işlemdir. Bu tasarımı ve hedef proteinleri ifade her zaman kolay değildir dikkat etmek önemlidir. Bazal ve rekombinant protein ekspresyon vektörü kararlılık, E. belirli seçenekler bağlıdır coli hücre suşları, peptit etiketi eklemeler ve yetiştirme parametreleri. Bizim özel tasarım kriteri de k.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu işi desteklenen finansman Akron Üniversitesi kabul etmek istiyorum.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Ditio-DL-treitol, DTT, %99,5Chem-Impex International127100 g
2-Hidroksietilmerkaptan ve beta;-MerkaptoetanolChem-Impex International642250 ml
Asetik asit, buzulEMDAX0073-92,5 L
AgarBioshopAGR001.500500 g
Ampisilin sodyum tuzu Sigma-AldrichA951825 g
Köpük Önleyici 204Sigma-AldrichA6426500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 ve mikro; g
BL21(DE3) Yetkin HücrelerNovagen694501 ml; İfade Ana Bilgisayar
Bradford reaktifiSigma-AldrichB6916500 ml
BugBusterNovagen70922-3100 ml
Jel filtrasyon standardıBio-Rad151-19016 şişe
GliserolBioshopGLY001.11 L
Guanidin hidrodiyorid amioformamidin hidroklorürChem-Impex International1521 kg
His-Pur Ni-NTA ReçineThermo Scientific88222100 ml
Hidroklorik asitEMDHX0603-32,5 L
İmidazol Chem-Impex International418250 g
IPTGChem-Impex International194100 g
Laemmli numune tamponuBio-Rad161-073730 ml
Lauril sülfat sodyum tuzu, Sodyum dodesil yüzeyChem-Impex International270500 g
LB Et suyu   Sigma-AldrichL30221 kg
NovaBlue Yetkin HücrelerNovagen698251 ml; Klonlama Ana
Bilgisayar Fosfat tamponlu salinSigma-AldrichP5368-10PAK10'lu paket
Potasyum KlorürChem-Impex International012471 kg
Sema3A-pET-21a (+)GenScript USA Inc.4 ve mikro; g
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC60601 L
Sodyum klorürSigma-AldrichS5886-1KG1 kg
Sodyum hidroksitFisher ScientificS318-500500 g
Sodyum fosfat diabazikSigma-AldrichS5136-500G500 g
Sodyum fosfat monobazikSigma-AldrichS5011500 g
Müthiş Et SuyuBioshop TER409.55 kg
Tetrasiklin hidroklorürChem-Impex International66725 g
Tris/Glisin/SDS Tamponu, 10xBio-Rad1610732 1 L
Trizma BaseSigma-AldrichT15031 kg
Tripton, pankreasEMD1.07213.10001 kg
Maya özü, granülEMD1.03753.0500500 g
  Ä KTApurifier10GE Healthcare28-4062-64Kitler ve aksesuarlar içerir
Masaüstü Orbital ÇalkalayıcıThermo ScientificSHKE4000MAXQ 4000
BirA500AvidityBirA500Enzimi, reaksiyon tamponları ve biyotin çözeltisi ile birlikte gelir
DiyalizKaseti Thermo Scientific66380Slide-A-Lyzer (Ekstra Güç)
Diyaliz TüpüSpektrum Laboratuvarları132127, 132129MWCO: 25.000 ve 50.000
Akış Saptırma Vanası FV-923GE Sağlık11-0011-70
FluoReporter Biyotin Miktar Tayin Test KitiInvitrogen1094598
Frac-950 Tüp Rafları, Raf CGE Sağlık18-6083-13
Fraksiyon Toplayıcı Frac-950GE Sağlık18-6083-00Kitler ve aksesuarlar dahildir
Isıtmalı/Soğutmalı Sirkülatör VWR13271-102Model 1156D
Isıtma Fırını FD SerisiBağlayıcıModel FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 sayfaGE Healthcare17-1069-01Durdurulan - Değiştirme Ürün: HiLoad 16/600 Superdex 200 sayfa
J-26 XPI Avanti SantrifüjBeckman Coulter393126
JA 25.50 RotorBeckman Coulter363055
JLA 8.1 RotorBeckman Coulter9693291 L poliporpilen şişe içerir
JS 5.3 RotorBeckman Coulter368690
Laminer AkışBaşlığı Themo Scientific1849Forma 1800 Serisi Temiz Tezgah
Mikroplaka OkuyucuTECANsonsuz M200
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-80044 jelli dikey elektroforez sistemi
Mini-PROTEAN TGX Prekast JellerBio-Rad456-9036Herhangi bir kDa, 15 oyuklu tarak
Ni-NTA KolonuBio-Rad737-251249 ml  hacim ECONO-Kolon
Plazmid Miniprep KitiOmega Bio-TekD6943-01
PowerPac HC Güç KaynağıBio-Rad164-5052250 V, 3 A, 300 W
Yuvarlak Tabanlı Polipropilen Kopolimer TüplerVWR3119-005050 ml  JA 25.50 rotor
Spin-X UF Konsantratörleriiçin borular Corning431488, 431483  20 ve 6 ml; MWCO: 10.000 Da Alt Klonlama
HizmetiGenScript USA Inc.Protein Hizmetleri
Ultrasonik İşlemci Cole-Parmer18910445AModel CV18
Vortex-Genie 2Bilimsel EndüstrilerSI-0236Model G560

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
  2. Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemic....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biotinylated ProteinsE coli ExpressionAffinity ChromatographyProtein PurificationNerve Growth FactorSemaphorin3ASDS Page AnalysisFPLC PurificationNative IsolationNon native Isolation

Related Articles