Yöntem makalesi

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi

61.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51312

⸱

1 Eylül 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, American University, 2Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute, NIH

Bu makalede

Özet

Tüp formasyonu deneyi in vitro olarak anjiyojenezi ölçmek için bir hızlı, ölçülebilir bir yöntemdir. Endotel hücreler, koşullu ortam ile bir araya yerleşen ve bazal zar özü ekilir. Tüp oluşumu saat içinde meydana gelir ve yeni oluşan tübülleri kolayca ölçülebilir.

Özet

Anjiyogenez normal doku gelişimi ve yara iyileşmesi için önemli bir işlem, aynı zamanda bir çok patolojik durum ile ilişkili bulunmuştur. Bu protokol kullanılarak, anjiyogenez hızlı, ölçülebilir bir şekilde in vitro ölçülebilir. Birincil veya Ölümsüzleştirilmiş endotel hücre koşullu ortam ile karıştırılır ve taban membran matrisi üzerinde plakalanır. Endotel hücreler, koşullu ortam bulunan anjiyojenik sinyallerine yanıt olarak benzeri yapılar kılcal oluştururlar. Tüp oluşumu endotel hücreleri 1 saat ve lümen içeren tübüller 2 saat içinde görünmeye başlıyor içinde kendilerini hizaya başlayan hızlı bir şekilde gerçekleşir. Tüpler, zıt fazlı bir ters mikroskop kullanılarak görüntülenebilir, veya hücreler floresan veya konfokal mikroskobu ile görüntülenir ve borular deneyi öncesinde kalsein AM ile tedavi edilebilir. Şubeleşmiş / düğümleri, sayısı döngüler / kafes ya da numara veya tüplerin oluşan uzunluğunu kolayca vitr içinde bir ölçü olarak tayin edilebilirO anjiyojenez. Özet olarak, bu deney, genler ve hızlı, tekrarlanabilir ve nicel olarak promosyon veya anjiyojenezin inhibisyonuna dahil yolların belirlenmesi için kullanılabilir.

Giriş

Anjiyojenez, önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının gelişimi, 1-3 iyileşmesi, organ büyüme, embriyonik gelişme ve yara da dahil olmak üzere çeşitli işlemler için hayati önem taşımaktadır. Yeni dokulara endotel hücreleri, tedarik oksijen ve besin sıralandığı kan damarları, geliştirilen, hematopoetik hücreler tarafından immün gözetim teşvik ve atık ürünleri 2,4 çıkarın. Anjiyogenesis embriyonik ve fetal gelişim sırasında kilit öneme sahiptir. Bununla birlikte, bu işlem, yara iyileşmesi, iskelet gelişimi, gebelik zamanlarında dışında veya 1-3 adet döngüsü sırasında yetişkinde çıkamamaktadır.

Son iki yılda, anjiogenezisi düzenleyen önemli moleküler mekanizmalar ortaya çıkmaya başladı. Anjiyogenezis integrinler, kemokin, anjiyopoietinlerin, oksijen algılama ajanlar, kavşak moleküller ve endojen inhibitörleri 5 içeren pro ve antianjiogenik sinyalleri ile dengeli bir sıkı düzenlenmiş olaydır. Proang kezBu tür bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), platelet türevli büyüme faktörü (PDGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi sinyalleri IOGENIC endotelyal hücre endotel hücreleri, temel zara inerek proteazlar serbest reseptörleri aktive eder. Daha sonra endotel hücreleri günde 6,7 ila birkaç milimetre arasında bir oranda lahanası oluşturan çoğalır ve göç eder.

Anjiyogenez, kanser, sedef hastalığı, diyabetik retinopati, artrit, astım, otoimmün hastalıklar, enfeksiyöz hastalıklar ve ateroskleroz da dahil olmak üzere, 8-10, çeşitli patolojik durum ile bağlantılıdır. Nın çeşitli hastalıklarda anjiyojenez önemi, bu işlem daha iyi tedavi edici ilaçların tasarımları için kritiktir düzenleyen genler ve anlamak için yollar.

Tüp tahlili, angiogenesisin oluşumu için gerekli olan genleri veya açık alanlarının belirlenmesi için hızlı ve nicel bir yöntemdir. Üretim 1988 de tarifBu testte oluşturan prensipler endotel hücreleri bölünür ve anjiyojenik sinyal 11-13 yanıt olarak hızlı bir şekilde geçirmek için koruyabilenlerdir bulunmaktadır. Bundan başka, endotel hücrelerinin farklılaşmasına ve bazal zar özü (BME) ihtiva eden bir matris üzerinde kültürlenmiş boru benzeri yapılar oluşturmak için indüklenir. Bu borular bağlantı komplekslerinde yoluyla birbirine bağlanmaktadır ve endotel hücreleri tarafından çevrelenmiş bir lümen içerir. Tüp formasyonu en çok boru miktar ve angiogenik stimuli tipine bağlı olarak 2-6 saat içinde, bu deneyde oluşturan hızlı bir şekilde gerçekleşir.

Endotelyal hücrelerin çeşitli tipleri pil ve ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri 14,15 her iki dahil olmak üzere bu deney için kullanılabilir. Bu makale için kullanılan hücre çizgisi, fare 3B-11, ama aynı yöntemi kullanılarak, HUVEC (insan) hücreleri gibi SVEC4-10 (fare) gibi endotelyal hücre hatları veya primer endotel hücreleri ile uygulanabilir. Hangi bağlı hücre çizgisi kullanılır ve endotel ce oluprf dönüştürülmüş veya non-transforme edilir, optimizasyon uygun tüp oluşumu için gerekli ideal bir zaman belirlemek için yapılan gerekecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Koúullanmıú Medya 1. Toplama Anjiyogenik Potansiyel için Test

  1. Doğal ya da düşük serum ortamında anjiyojenik veya anti-anjiyojenik potansiyeli için test edilecek olan primer ya da ölümsüzleştirilmiş hücrelerin büyümesine ve koşullu ortam toplanır.
    1. Seçenek olarak ise, kullanım anında ortamla veya numune alınır ve birkaç ay boyunca -80 ° C'de saklanır. Bir negatif kontrol olarak, doğal ya da nonconditioned düşük serum ortamı kullanın ve bir pozitif kontrol olarak sigara durumunu tam büyüme ortamı (% 10 FBS, ya da uygun bir konsantrasyonunu) kullanır. Seçenek olarak ise, angiogenesisin potansiyel uyarıcıları test etmek için ve söz konusu spesifik proteinlerin bilinen konsantrasyonları ile ek büyüme faktörlerini de eksik karakalem sıyrılmış ortam, tek başına büyüme faktörü içermeyen ortam ile karşılaştırın.

Testi öncesinde Endotel Hücreleri 2. Hazırlık

  1. Tahlil etmek için iki gün önce, yeni bir T-75 balon içine pasaj 3B-11 hücreleri. Geçiş hücre sayısı önemlidir. Hücreler, ikinci ve altıncı geçiş arasında olduğunda bu deney, en iyi şekilde çalışır. Tahlil endotel hücreleri, ikinci önce veya onuncu geçişinden sonra kullanıldığında eğer iyi çalışmaz.
  2. DMEM içinde 24 saat boyunca büyütün hücreleri,% 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiştir.
  3. Aşağıdaki gibi bir gün deneyden önce serum 3B-11 hücreleri açlıktan öldürmek:
    1. 3B-11 hücrelerinden medya aspire.
    2. DMEM ekleme olmaksızın düşük serum ortamında% 0.2 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiştir.
    3. Ek bir 24 saat daha hücrelerin büyümesine.

Assay önce Ayıraçların 3. hazırlanması

NOT: BME konsantrasyonları çok bağlıdır oldukça değişkendir. Konsantrasyon ml / nedenle BME üretici sağlamak için satın alınmasından önce içindeki sokulması gerekir 10 mg'dan az ise, BME iyi çalışmazBir yeterince konsantre sürü edinimi.

  1. Defrost buzdolabında büyüme faktörü BME azalır. Ilık BME katılaşır, bu yüzden kullanımdan önce, soğuk tutulmalıdır. BME, birkaç hafta içinde, soğutma altında depolanabilir ya da parçalara ayrılmış ve -80 ° C de dondurulabilir.
  2. Bir azaltılmış büyüme faktörü BME geleneksel BME'de tercih edilir. BME'de anjiyojenik faktörlerin eksikliği daha kolay klimalı ortam tüp oluşumu üzerindeki gelen faktörler etkisini gözlemlemek için yapacaktır.
  3. Çözülme medya test edilecek.

Assay hemen önce Endotel Hücreleri 4. hazırlanması

  1. Yıkama 3B-11, DPBS hücreler.
    1. Flüoresan veya konfokal mikroskobu ile görselleştirme isteniyorsa, 3B-11 hücreleri yıkanmasından önce, 2 ug / ml 'lik bir son konsantrasyonda medya endotel hücrelerine kalsein AM ekleyin. Deneyin başlamasından önce, 37 ° C ve% 5 CO2 de karanlıkta kalsein ile etiketlenmiş hücreler yerleştirin. Stok kalsein çözülürKalsein DMSO içinde ve bir kez% 0.1 PM geçmemelidir DMSO ortam nihai konsantrasyona seyreltilir. Hücrelerden 30-45 dk yıkama Calcein AM sonra (yukarıda 4.1 adım) ve deney takip ile devam edin.
  2. T-75 balonuna 1 ml tripsin-EDTA ekleyerek Hücreleri tripsinize edin.
  3. Tripsinizasyon tamamlandıktan sonra, 100 ug / ml streptomisin, bir son 10 ml DMEM hacmi,% 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 E / ml penisilin yeniden süspansiyona alınmasıyla tripsin nötralize ve.
  4. 100 mikron hücre süzgecinden Filtre hücreleri kümeleri kaldırmak için.
  5. 7.5 x 10 6 DMEM hücre / ml,% 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin nihai bir konsantrasyona kadar hücreleri ve süspansiyon hücreleri sayın ve 100 ug / ml streptomisin.

5. Tüp Oluşumu Testi

  1. Önce BME Prem etmez, böylece plaka yükleme 20-30 dakika boyunca buzdolabında ya da buz üzerinde 24 oyuklu bir plaka ve 1 mi uçlarınıaturely katılaşır.
  2. Pipet, 24 oyuklu plakanın her oyuğuna indirgenmiş gelişme faktörü BME 250 ul. Dağıtım sırasında nihai durağı pipet karartıcı değil kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Yeterli BME kuyunun merkezine menisküs formları kalır özen; matrisin çok ince olması durumunda, hücreler, sadece bir tek tabaka oluşturacaktır.
  3. CO BME katılaşmaya 2 30 dk için 37 ° C 'de 24-yuvalı plaka inkübe ve% 5.
  4. BME kurduğunda, yeniden süspanse 3B-11 hücreleri (yaklaşık 75.000 hücreleri) 10 ul ile klimalı ortamın yaklaşık 300 ul karıştırın.
    1. Klimalı ortam ve kullanılan endotel hücre tipine bağlı olarak kaplama hücrelerinin sayısının sesini ayarlayın ve aktivite göstermek için klimalı ortamın seri dilüsyonlarını test edin. Karşılaştırırken hücreler farklı şartlarda yetiştirilmiş, ortamı koşullandırılması için kullanılan hücre sayısına koşullu ortam hacmi normale.
  5. Tüpler will 2-4 saat içinde oluşmaya başlar. Şartlanmış ortam anjiyojenik faktör konsantrasyonuna bağlı olarak, tepe tüp oluşumu saat ve tahlilin zamanlama 3 ile 12 arasında optimize edilmesi gerekir oluşabilir. Bunun yerine, ölümsüzleştirilmiş hücre primer endotel hücreleri ile çalışan, ilk tüp oluşumu birkaç saat geciktirilebilir.
    1. Borular, genellikle apoptoza uğrayacak 18 saat karıştırıldı ve endotelial hücreler içinde bozulmaya başlar.
  6. Tepe tüp oluşumu sırasında, dikkatli bir şekilde kuyudan aspire ortam BME üzerinde boru ağı bozmamak için.
    1. 1 mi DPBS, daha sonra her bir kuyucuğa aspiratı ile yıkayın.
      1. Anında görüntüleme için, hücreler 4.1.1 gibi kalsein AM ile boyanmıştır Bir dijital kamera veya flüoresans / konfokal mikroskop bağlı içbükey bir mikroskop kullanarak her bir göze ve görüntü boru ağına 1 ml taze DPBS ekleyin.
      2. Daha sonra görselleştirme için tüp ağı düzeltmek ve her 4% paraformaldehid eklemek içiniyi aspire edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
        1. , Paraformaldehid kaldır DPBS ile iki kere yıkayın, sonra her bir oyuğa 1 ml taze DPBS ekleyin.
        2. Birkaç tüpleri Bu işlem sırasında kırılabilir olarak önceden tespit için mikroskobik görüntü.

Tüp Ağı 6. Kantitasyonu

  1. Araştırmacının tercihe bağlı olarak çeşitli şekillerde boru ağı sayısal olarak ve çeşitli bilgisayar programları, aşağıdaki parametrelerin ölçülmesi için yeteneğine sahip: Boru sayısı; döngüler / kafes sayısı; şubelerdeki / düğüm sayısı; boruların uzunluğu.
  2. Bu tür tüp ağların ölçümü için Anjiyogenezis Analyzer eklentisi 16 Image J gibi temsil eden bilgisayar programı kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fare 3B-11, endotel hücreleri, büyüme faktörü, katılaşmış düşük BME üzerine serpildi - Bu deneyde, ürünün Matrigel kullanıldı - ve zaman içinde takip etti. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, her iki fare veya keratinositler, fibroblastlar tarafından salgılanan anjiyojenik faktörler, zaman içinde tüp oluşumunu sağlama yeteneğine sahiptirler. Endotel hücreleri göç ve kaplama 1-2 saat içinde küçük dalları oluşmaya başlar. Maksimum tüp oluşumu önceden keratinositlerinden elde edilen koşullandırılmış medyayı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Anjiyogenesis fizyolojik ve patolojik süreçlerde hem de yer almaktadır. Angiogenesis ile ilişkili mekanizmaların incelenmesi anjiyojenezde büyük adımlar özetlemek tahlillerin kullanımını gerektirir. Endotel hücre tüp oluşumu tahlil diğer deneylerde fazla birkaç avantaj sunar. Bu, ayarlama kolaydır nispeten pahalı olmayan, birkaç saat içinde tübülleri üretir ve nicelleştirilebilmektedir. Bundan başka, 24 ya da 96 oyuklu plakalar içinde tamamlanabilir ve bu şekilde teşvik faktörleri tanımlamak veya anjiyogenezin inhibe ed...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenen ve NCI tarafından UA5CA152907 hibe edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Costar 24 oyuklu doku kültürü ile tedavi edilmiş plakaCorning3524
BD Matrigel bazal membran matrisi, büyüme faktörü azaltılmışBD Biosciences354230
Gibco %0.05 tripsin-EDTAYaşam Teknolojileri25300-054
Gibco L-glutamin 200 mM (100x)Yaşam Teknolojileri25030-081
Gibco kalem strepLife Teknolojiler15140-122
Gibco DMEM (1x)Yaşam Teknolojileri11965-092
Gibco DPBS (1x)Yaşam Teknolojileri14190-144
Fetal Sığır Serumu AtlasBiyolojikleriF-0500-A Calcein
Yaşam TeknolojileriC3100MP
DMSOATCC4-X

Kaynaklar

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
  2. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
  3. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
  4. Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
  5. Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
  6. Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
  7. Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
  8. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
  9. Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
  10. Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
  11. Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
  12. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
  13. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
  14. Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
  15. Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).
  16. Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

In Vitro AnjiyogenezBazal Membran MatrisiKondisyonlu BesiyeriFloresan MikroskopiKonfokal MikroskopiCalcein AM BoyamasT p A KantifikasyonuAnjiyojenik Fakt rlerH cre pasaj Optimizasyonu

İlgili makaleler