Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

İşlenmiş nanomaddeler günümüzde biyomedikal ¹ potansiyel uygulamalar için yaşam bilim adamlarının ilgisini ilham edilir. Inorganik ve organik maddelerin çok çeşitli fiziksel farklı şekil ve kimyasal özellikleri ile oluşturulan nano üretmek için kullanılabilir. Bu yapılar arasında, küre şeklinde tasarlanmıştır nanopartiküller tanı ve translasyon tıp ² için büyük bir potansiyel göstermiştir. Onların çekirdek ve yüzey tasarım olası bir uygulama tarafından tahrik edilir ve nanoparçacık temas ve etkileşimi aşağıdaki hedef hücre yanıtlarının derin bir çalışma anlamına gelir. Kasıtlı insan deneklere uygulanabilir düşünülen Nanoparticles bağışıklık hücrelerinin çeşitli ile doğrudan temas edecektir. Vücut bütünlüğünü korumak için kendi sorumluluk onları nanotıpta ³ soruşturmanın önemli bir konu yapar.

Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin hücresel bölümü esas olarak phago ile temsil edilircytes. Bunlar arasında, monosit / makrofaj soyu, merkezi sinir sistemi de dahil olmak üzere elde edilen yerleşik mikroglia hücreleri, bağışıklık savunma ^4,5 önemli bir rol oynamaktadır. Bunlar yabancı cisimlerin ile karşılaştıktan sonra birkaç saat içinde koruyucu tepkileri tetiklemek için edebiliyoruz. Ayrıca, monositik hücreler koordine ve sitokin salınımı yoluyla edinilmiş bağışıklık yanıtı talimat. Tüm bu olaylar da büyük ölçüde bağışıklık sistemi tarafından ⁶ "kendinden olmayan" olarak algılanan işlenmiş malzemelerin mevcudiyetinde meydana gelir.

Tarihsel hücre analizi için immünoloji kullanılan yöntemler arasında, en güçlü araçlardan birini temsil akım sitometri. Bundan başka, (genellikle tutulmasına ya da tek bir zar proteini varlığını istismar) spesifik bir bağışıklık alt popülasyonun tanımlanmasında veya saflaştırma teknolojileri durumuna izin veren belirli bir birincil ce belirli bir nanoparçacık etkilerinin kesin bir incelemell tipi ^7. Ancak, hücre nanopartiküller maruz kaldıktan sonra fizyolojik ve morfolojik değişiklikler ortaya çıkabilir. Yanı sıra, nanopartiküller elde edilen sonuçları ⁸ etkileyen, tanımlanan dalga boylarında bu tür ışığın emilmesi veya emisyon olarak özel optik parametreleri, engel olabilir. Bu nedenle, kullanım ve yeni malzemelerin çalışma klasik immünolojik deneylerde nihai uyarlamalar limitleri dikkate alınmalıdır.

Bu çalışma, akış sitometresi ile birincil bir bağışıklık hücreleri ile etkileşimleri nanopartikül saptanmasını ilgilidir. Bu sorunu gidermek için, 50 nm FITC-SiO ₂ nanopartikülleri yöntemini açıklamak için bir model nanomateryal olarak istihdam edildi. Silika parçacıkları nano ölçekli metrik çok hassas bir şekilde üretilebilmektedir. Bu tür ücret veya hidrofobisiteyi gibi boyut, şekil ve yüzey özellikleri, ince onların biyouyumluluk ⁹ artırmak için ayarlanmış olabilir. ₂ nanopartiküller onları bir olarak kullanılmasına izin SiO birçok özelliğiİlaç vermek için örnek ^10, parçacıklar. Ayrıca, flüoresan boyalar ya da kuantum nokta tutulabilir veya görüntüleme amaçları için yararlı ¹¹ nano-araçlar sunan bu parçacıklara bağlanabilir.

ETİK BEYANI

İnsan ve hayvan örnekleri İtalyan Sağlık Bakanlığı yönergeleri izleyerek işlendi, kanun 116/92 ve Avrupa Toplulukları Konsey Direktifi 86/609/EEC.

1.. Monosit Hücre Kültürleri

1. % 10 insan serumu, 50 U / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin,% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de 0.05 mM β-merkaptoetanol ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı ihtiva eden T-75 kültür şişelerinde insan THP-1 hücreleri,.
2. Bölünmüş kültürler zaman Konfluent (her 3-5 gün).

2. Bufi katlarından Periferik Kan Mononükleer Hücreleri (PBMC) izolasyonu

1. Izolasyon protokolü başlamadan önce, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.2 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın, 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), tampon (1 durulama 95 ml 5 ml BSA stok çözeltisi ekleme,% 0.5 sığır serum albümini (BSA): 20 seyrelti). Tampon Degas ve 2-8 (soğuk tutmak° C).
   ÖNEMLİ: kabarcıklar izolasyon sütunu (adım 3.2) engelleyebilir çünkü tampon daha iyi daha sonuçlarının neden olabilir degas Başarısızlık.
   Not: Antikoagülan sitrat dekstroz formül-A (ACD-A) veya sitrat fosfat dekstroz (CPD) alternatif olarak kullanılabilir. Bunun tersine, diğer türlerden diğer albümin proteinleri veya sera BSA yerini alabilir. Ca ^{2 +} veya Mg ^{2 +} içeren tamponlar kullanmayın.
2. (20-60 yaş arası), sağlıklı donörlerden buffy kat edinin.
3. Yoğunluk gradyanlı santrifüj boyunca 50 ml konik tüp hazırlayın. Kan işleme (her boru seyreltilmiş kan 35 ml işleyebilir) ve her bir boş tüpe Ficoll-Paque 15 ml eklemek için gerekli olan tüplerin sayısını belirler.
4. PBS / BSA / EDTA solüsyonu (1:04 seyreltme) 24 ml kan 8 ml seyreltin.
5. Dikkatle (yoğunluk = 1.077 g / ml) 50 ml konik tüp, her biri Ficoll-Paque üzerine seyreltilmiş çözelti katman. Karıştırmayınkan ve Ficoll-Paque.
   ÖNEMLİ: Kan ve Ficoll-Paque karışımını engellemek için, 45 ° açıyla tüpü tutun ve yavaş yavaş kan karışımı katman.
6. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje Mononükleer hücreler (MNC) granülositler ve eritrositler tortu ise nedeniyle Ficoll-Paque ozmotik basıncı daha yüksek yoğunluğa kadar, plazma-Ficoll-Paque arayüzünde kalır.
7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 xg'de PBS / BSA / EDTA ve santrifüj ile dolu yeni bir 50 ml tüp interfaz hücreleri (periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, PBMC'ler) transferi
8. Trombositleri çıkarmak için PBS / BSA / EDTA ile iki kez pelet yıkayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 200 xg'de Spin
9. % 10 insan serumu ve antibiyotik veya monositler saflaştırma devam tam RPMI-1640 içinde kültür hücreleri.

3. PBMC'lerden Primer Monositler saflaştırılması

1. Hum kullanarak manyetik boncuk ayırma ile PBMC'lerden izole monositlerBir Pan monosit izolasyon kiti:
   1. Olası hücre kümeleri kaldırmak için 30 mikron naylon örgü (ön ayırma filtreler, 30 mikron) aracılığıyla hücrelere geçerler.
   2. Hemasitometre kullanarak hücre sayısını belirlemek.
   3. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. Aspire tamamen yüzer.
   4. 10 ^7, toplam hücre başına PBS / EDTA / BSA tamponu 30 ul içinde süspanse hücre topağı.
   5. 10 ⁷ toplam hücre başına Engelleme Reaktif 10 ul FcR ekleyin.
   6. 10 ⁷ toplam hücre başına Biotin-Antikor Kokteyli 10 ul ekleyin.
   7. İyice karıştırın ve 2-8 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe
   8. 10 ⁷ toplam hücre başına tampon 30 ul ekleyin.
   9. 10 ⁷ toplam hücre başına Anti-Biotin mikro, 20 ul ekleyin.
   10. İyice karıştırın ve 2-8 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe
   11. PBS / EDTA / BSA tampon maddesi içinde 500 ul hücre 10 ⁸ kadar yeniden süspanse edin.
2. Manyetik separtirme
   1. Buna göre toplam hücre sayısına uygun bir MACS Sütun ve MACS ayırıcı (MACS Sütun veri tablosuna bakınız) seçin.
   2. Ayırıcı MACS manyetik alanı sütunu yerleştirin.
   3. PBS / EDTA / BSA tamponu uygun miktarı ile durulanarak sütun hazırlayın (MS sütun: 500 ul; LS sütun: 3 mi.)
      Not: Kolonlar "akış durdurma" ve kuru çalıştırmayın.
   4. Kolona hücre süspansiyonu uygulanır. Zenginleştirilmiş monosit fraksiyonunu temsil eden, etiketsiz hücrelerini içeren flow-through toplayın.
   5. PBS / EDTA / BSA tamponu (500 ul MS ve yıkama başına LS 3 mi) ile sütun 3x yıkayın.
   6. Zenginleştirilmiş monosit hücreleri temsil geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak ve bölüm 3.2.4 gelen akış yoluyla eklemek.
      Not: Sütun deposu boş olduğunda PBS / EDTA / BSA tampon alikot eklenerek sütun yıkayın.
   7. (İsteğe bağlı) gelen sütun çıkarınayırıcı ve uygun bir toplama tüpü üzerine yerleştirin. Kolona tampon pipet (1 mi; LS sütun: MS sütun 5 ml). Hemen sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik etiketli nonmonocyte hücreleri yıkayın.
   8. Kültür,% 10 insan serumu ve antibiyotikler ile tam RPMI-1640 içinde monositler arıtıldı.

4. Tüm kan Primer Monositler saflaştırılması

1. Üreticinin talimatlarına göre, tam kan monositten izolasyon kiti kullanılarak bütün kan monositleri arındırın.

5. Kan Lökositleri ve Arıtılmış Monositlerinde Nanoparçacık içselleştirilmesi

1. 12 oyuklu bir plaka içerisinde izole edilmiş PBMC'ler veya saflaştırılmış CD14 pozitif monositlerin Plate 5 x 10 ⁵ hücre / ml (1 ml / çukur).
2. 100 nM'lik bir çalışma konsantrasyonda komple ortam içinde Vortex FITC-SiO ₂ nanoparçacık stok çözeltisi ve tekrar süspansiyon.
3. Çalışma nanop 10 ul ekle1 nM'lik bir nanopartikül nihai konsantrasyon elde etmek üzere muamele edilmiş numuneler için madde süspansiyonu (100 nM). Her bir oyuğa, tedavi edilmeyen kontroller için tam ortam aynı hacim.
4. 1 saat içselleştirme 1.5 mi polipropilen tüp içinde örnekleri toplamak ve oda sıcaklığında 6000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj sonra bunları.
5. Oda sıcaklığında 6000 x g'de tampon 3 dk çalışan 1 ml pelet yıkayın.
6. Çalışan tampon 200 ul pelet tekrar. Hücreler artık akış sitometri okumak için hazırız.

6. Primer karma Glial Kültürlerin izolasyonu (Bertero bakınız et al. ⁷⁾

7. Karışık Glial Konfluant Hücre Kültürü replating

1. Daha sonra 10 ml Versene ekleyin ve 5-7 dakika için 37 ° C'de inkübe, (w / ^{Ca2 +} / ^{Mg2 +} o) 10 ml PBS ile bir kez, bir T-75 balon içinde yıkayın.
2. T-75 yüzeyinden hücreleri ayırmak ve çözünmesi için yukarı ve aşağı birkaç kez üstte yüzen madde pipetHücre agrega.
3. Bir 15 ml polipropilen bir tüp içinde hücre süspansiyonu aktarın. Bir hemasitometre ile hücreleri saymak için hücre süspansiyonu, az miktarda toplayın.
4. Oda sıcaklığında 300 x g'de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu santrifüj.
5. Süpernatantı ve glial tam kültür ortamı içinde 5 x 10 ⁵ hücre / ml 'lik bir son konsantrasyonda pelletini.
6. , 24 oyuklu bir plaka içerisinde, 0.5 ml / oyuk Plate ve hücreler, nanopartikül tedavi öncesi 2-4 saat razı sağlar.

8. Mikroglialar'da Nanoparçacık içselleştirilmesi

1. Her bir oyuğa (muamele edilmemiş kontroller için) tam bir glial kültür ortamı içinde 500 ul veya (muamele edilmiş örnekler için) tam bir glial kültür ortamı içinde bir 2x Rhodamine-SiO ₂ nanoparçacık süspansiyonu 500 ul ekleyin.
2. Seçilen zaman noktalarında nonrapid-yapışan hücrelerin ayrılmasına izin verir ve 2 ml polipropilen tüpleri içinde bunları toplamak için hücrelerin Pipet.
3. 500 ul ekleVersene of her oyuğa ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin, daha sonra geri kalan hücre fraksiyonu ayırmak ve önceki aşamada elde edilen karşılık gelen yapışmamalı hücreleri ile her numune.
4. Oda sıcaklığında 300 xg'de 3 dakika için örnekleri santrifüjleyin.
5. Tampon Koşu autoMACS 100 ul pelletini.

9. CD11-VioBlue ile boyanarak

1. Tampon çalışan hücre süspansiyonu (1:11 oranı), 100 ul VioBlue-CD11b, insan / fare antikorunun 10 ul ilave edin ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe
2. Tampon çalışan 1 ml ilave edilir ve hücre süspansiyonu karıştırılır.
3. 300 x g, 3 dakika boyunca santrifüj her bir örnek.
4. Süpernatantı atın ve tampon çalışan 100-150 ul pelletini.
5. Sitometre için örnekleri Oku (son iki kademe arasındaki 4 ° C'de saklayın örnekleri).
   ÖNEMLİ: örnekleri analiz etmeden önce, üst üste sinyalleri tazminat devam in emisyon spektrumları farklı fluorochromes (florokrom-eşlenik nanopartiküller ya da antikorlar) ile saptanmıştır.

10. Kompanzasyon spektral Kirliliği

1. "Cihaz ayarları" kutusu (tüm alet yazılım programları mevcut) açın.
   Not: Malzeme Tablo bildirilen farklı bir enstrüman kullanıyorsanız, satın alma detayları için araç özel kılavuzuna başvurun.
2. Düşük akışkan hızı (cihaz tarafından izin veriliyorsa) de (nanopartikülleri olmadan) işlenmemiş örneği edinin. Satın alma sırasında, manuel voltaj kanalları düzenleyerek ileri ayarlayın ve yan saçılma (sırasıyla FSC ve SSC,).
   Not: En iyi arsa tam hücre popülasyonu görselleştirmek amacıyla SSC ve FSC eksen ölçekleri değiştirin. Ilgi her hücre tipi için şablon ayarı bir alet, oluşturulan kaydedilir ve gelecekteki satın alma için de kullanılabilir.
3. Özel açıkYazılım "bölge" sekmesi. İstenen nüfus etrafında uygun ve geniş bir bölgeyi ("kapı") çizin.
   Not: nanopartiküllerin İçselleştirilmesi hücre SSC kayması neden olur. Kapı çok yakından ilgi hücre nüfusunun yaklaşık sınırlanmışsa, elde edilen veriler, büyük tespit edilecek olan hücrelerin bir kısmını kaçırmaz.
4. İki boyanmamış örnekleri, boş numune olarak kullanılmak üzere bir ve PI boyama (isteğe bağlı) karşı tazminat birini telafi edilecek her floresan kanal için uygun fluorokrom ile tek lekeli örnek kullanın.
   Not: Deney etiketleme kullanılmak üzere her bir florokrom-konjuge antikor için başka bir örnek 1.5 ml bir tüp kullanın.
5. "Cihaz ayarları" kutusuna "Tazminat sekmesini" açın. Artış veya dağıtma kanal flüoresans yoğunluğu florokrom pos için hemen hemen aynı olduğu kadar satın alınması sırasında dengeleme faktörünü azaltmakitive ve negatif nüfus.
6. Kompanzasyon ayarlandıktan sonra nanopartikül ile tedavi edilen örnekleri elde edin.

Sitometrisi farklı hücreleri belirlemek ve karakterize etmek için bir araçtır ve bu tür monositler, granülositler, T hücreleri, B hücreleri, doğal katil (NK) hücreleri, dendritik hücreler (DC) gibi özel bağışıklık hücrelerini belirlemek için tercih edilen bir tekniktir Akış, ve lökositlerin diğer subpopülasyonunun.

Daha iyi nanopartiküller tepki olarak beyaz kan hücreleri davranışını karakterize etmek için bir çaba olarak, (THP-1 hücreleri, Şekil 3), sağlıklı donörlerin kan (Şekil 1 ve 2) için, insan monosit hücre hattı izole primer lökositler ile içselleştirme tahlilleri gerçekleştirilmiştir .

Şekil 1A de belirtildiği gibi, üç ana kan lökosit alt-popülasyonları bulunduğunu açıkça PBMC izolasyonundan sonra ön ve yan saçılma ile belirlenmiştir. Ayrıca, FITC-SiO 2 tedaviden sonra, lenfositler (gri), monositler (mavi) ve granülositler (kırmızı) farklı bir n varyeşil floresan yoğunluğu (Şekil 1 B) ile gösterilen anoparticle içselleştirme hızı. Açıklanan protokol PBMC'lerden birinci CD14 pozitif monositlerin saflaştırılması. Şekil 2A FITC-SiO 2 varlığında CD14 + monosit nokta arsa sitometri akışı bildirir sağlar. Şekil 2B, aynı hücrelerde miktarı olarak ifade edilmiştir ve FITC-SiO 2 içselleştirme logaritmik ölçek histogram.

Benzer deneyler içselleştirme FITC-SiO 2 nanopartiküllerin artan konsantrasyonları ile muamele edilmiş THP-1 monosit üzerinde gerçekleştirilmiştir. İşlem yapılmamış hücreler negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Şekil 3A, THP-1 hücre hattı saçılma değişmeyen ileri yan saçılması doza bağımlı bir artış göstermektedir. Şekil 3B'de, birlikte test edilen her bir FITC-SiO 2 nanoparçacık konsantrasyonda SSC ve FSC histogramlar ile, ortalama floresans yoğunluğu (MFI) miktar sunulmuştur. Bu veriler, FITC-SiO 2 nanopartiküller ile tedavi, hücre içi parçalı arttırılması (yan saçılma) ve flöresanlı (yeşil kanalı) ile öne monositlerinde doza bağımlı içselleşmesini uyarır düşündürmektedir.

Bağışıklık sistemi hücreleri, nano-tanecikleri arasındaki etkileşim tipine içine daha fazla bilgi edinmek için, primer karma glial kültürleri izole edildi ve mikroglia, merkezi sinir sistemi yerleşik bağışıklık hücreleri, saflaştırılmıştır. Yeşil floresan mikroglia eksprese eden transgenik bir fare modelinin kullanımı, farklı nöro-enflamatuar mekanizmalar görselleştirme izin verir. Bu çalışmada kullanılan transjenik fare B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J CX3CR1 12 promotör kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade eder. In vitro (DIV) 7 gün sonra, floresan mikroskobu astrositlerin, çok sayıda (GFP negatif yapışık hücre ile karışık bir birinci glial kültür gösterirs) ve bazı yeşil hücreleri (GFP pozitif, Şekil 5A). GFP - - (astrositler ve glial hücreleri), mikroglial CD11b + GFP + hücrelerinin bir ikinci ayrı bir grup, ve bir ilk CD11b Bu fare modelinde, üç glial altgrupları tek-CD11b antikor lekelemesi ile akış sitometrisi ile ayırt edilebilir Üçüncü CD11b + GFP - alt popülasyonu (Şekil 4A). Analizi (Şekil 4B) flow sitometri tarafından gösterildiği gibi, bu iki son subpopülasyonunun, hem (CX3CR1 destekçisinin transkripsiyonu ile devriye olgunlaşmamış mikroglianın temsil eden) GFP + nüfusun hafif bir artış verimlilik ile nanopartıküllerıni içselleştirmek edebiliyoruz. Meydana içselleştirme ayrıca Şekil 5B'de gösterildiği gibi, Rhodamine-SiO 2 nanopartiküllerin aynı nihai konsantrasyon kullanılarak konfokal mikroskopi ile doğrulanabilir.

karşı (FSC) saçılma FITC-SiO 2 nanoparçacık CD14 içinde içselleştirme + saflaştırılmış monositler. A) Örnek ileri (SSC) saflaştırılarak CD14 pozitif monositlerin nokta arsa akış sitometrisi. B) yeşil floresan histogram plot 1nM FITC-SiO 1 saat 2 nanopartikülleri (+45 mV). , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,. THP-1 hücreleri yan scatterin karşı (FSC) saçılma. A) Temsilcisi ileriye üzerine FITC-SiO 2 nanoparçacık içselleştirme Etkilerig (SSC) ileri (FSC) ve yeşil saçılma, yan saçılma konsantrasyonu. B) Konsantrasyon bağımlı varyasyon (SSC) artan FITC-SiO 2 nanopartikülleri 1 saat kaldıktan sonra, THP-1 monosit hücre hattının nokta arsa akış sitometri FITC-SiO 1 saat 2 nanopartikülleri (+45 mV) varlığında floresan. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. Pr nokta arsa sitometri CD11-VioBlue akış karşı rodamin-SiO B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J farelerden izole primer mikrogliada içine 2 nanoparçacık içselleştirilmesi. A) Yeşil Floresan Protein (GFP)B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J farelerinden izole imary karışık glia. CD11 + GFP + ve CD11 + GFP -. Nüfusu 30 için sırasıyla sağ üst ve sağ alt kadranda, B) 1 nM Rodamin-SiO 2 nanopartiküller (+45 mV) varlığında mikrogliya Altgrupları Kırmızı floresan bindirme histogram grafiği gösterilmiştir dk kontrolü (gri histogram) karşı (kırmızı histogram). , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 5,. 7 DIV ve (B) mikroskopisi GFP +-mikrogliya görselleştirme. (A) Floresan mikroskopiRodamin-SiO 2 nanoparçacık içselleştirilmesi GFP +-mikroglialar'da (kırmızı oklar). , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Yazarlar Miltenyi Biotech GmbH bu yazının teslim sponsor olduğunu beyan ederim. HiQ-Nano Şirketi ( http://www.hiq-nano.com/index.html ) bir nanoteknoloji İİT kaynaklanan şirket off spin olduğunu.