Method Article

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

DOI:

10.3791/51362

⸱

June 26th, 2014

 ,  , 
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit C Virüsü (HCV), siroz ve kanser dahil olmak üzere karaciğer bozukluklarına neden olan önemli bir insan patojenidir. HCV enfeksiyöz hücre kültürü sistemi, HCV replikasyonunun moleküler mekanizmasını anlamak ve yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek için gereklidir. Burada, HCV replikasyon döngüsünün çeşitli aşamalarını araştırmak için bir protokol açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit C Virüsü (HCV) dünya nüfusunun% 3 etkiler ve kronik hepatit, siroz ve hepatosellüler karsinom gibi ciddi karaciğer rahatsızlıkları olur. HCV, Flaviviridae ailesine ait zarflı bir RNA virüsüdür. Mevcut tedavi, tam etkili değildir ve istenmeyen yan etkilere neden olur. Hiçbir HCV aşısı yoktur. Bu nedenle, devam eden bir çaba bir aşı ve daha iyi bir tedavi geliştirmek için gereklidir. HCV bir hücre kültür sistemi viral girişi, genom replikasyonu, paketleme, ve çıkış da dahil olmak üzere HCV gelişmesinin çeşitli aşamalarında çalışmaları için önemlidir. Sunulan mevcut prosedüründe, bir vahşi tip intragenotype 2a kimerik virüs, FNX-HCV ve virüs çoğaltma incelemek için bir Renilla lusiferaz haberci genini taşıyan bir rekombinant virüs FNX-Rluc kullanılır. Bir insan hepatoma hücre hattı (Huh-7 göre) in vitro transfeksiyonu için kullanılmıştır HCV genomik RNA transkripsiyonu. Hücresiz kültür üst sıvıları, protein lizatlan ve tla m HCV RNA büyümeyi değerlendirmek için post-transfeksiyon işaret çeşitli zaman hasat edilmiştir. HCV genomu, çoğaltma durum nicel RT-PCR ve HCV varlığının görüntülenmesi iki-şeritli RNA tarafından değerlendirildi. HCV protein ekspresyonu HCV NS3 ve NS5A proteinleri için spesifik antikorların kullanıldığı Western blot ve imüno deneyleri ile doğrulanmıştır. Kültür yüzer ve viral titresi olarak bulaşıcı parçacıklar serbest HCV RNA transfekte edilmiş hücreler ölçülmüştür. Lusiferaz deneyleri, raportör HCV'nin replikasyon seviyesi ve enfeksiyon riskini değerlendirmek için kullanılmıştır. Sonuç olarak, HCV replikasyon döngüsünün farklı aşamalarında karakterize etmek için çeşitli virolojik ölçümlerde mevcut.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit C virüsü (HCV), siroz ve karaciğer kanserine neden olur. Bu 350,000 kişi yılda 1-3 ölüyor, dünya çapında 170 milyon kişiyi etkilemektedir. HCV 9.6 kb'lik bir genom boyutuna sahip bir pozitif iplikli bir RNA virüsüdür. HCV genomu, proteolitik olarak 10 polipeptitlere çeşitli hücresel ve viral proteazlar tarafından yarılır ~ 3000 amino asit kalıntıları tek bir poliprotein olarak tercüme edilir. HCV cinsi Hepatit C virüs in prototip virüsüdür ve Flaviviridae familyası 4 aittir. Maruz kalması üzerine, HCV bireylerin% 80, kronik enfeksiyon oluşturur. Enfeksiyon tanısı karaciğer bozulmasını önlemek için terapötik müdahaleye izin verebilir çoğunlukla asemptomatik ve zamanında. Güncel Tedavinin yetersiz olduğunu ve hiç aşı 5,6 mevcuttur.

Hepatit C etyolojisi ilk 1989, 7 'de tarif edilmiştir. HCV replikasyonu incelenmesi hepatit C aşısı ve tedavi araştırmalar için önemlidir, ancak bu olmuştuuzun süre etkili bir viral kültür sisteminin olmaması nedeniyle engellenmektedir. HCV'nin moleküler klon intrahepatik, aşılamadan 8 üzerine şempanzelerde enfeksiyon olduğu gösterilmiştir. Daha sonra, HCV alt-genomik replikonlar, bir hücre kültür sistemi 9,10 viral genom çoğaltma aşamasını incelemek için izin verilmiş olan, tarif edilmiştir. Bir genotip 2a HCV Discovery JFH-1 (Japon fulminan hepatit-1) izole, hücre kültürü enfekte edebilen HCV çoğaltma araştırma 11-13 için yeni yollar açtı. Genotip 2a gerginlik JFH-1 arası ve içi genotipik kimerik virüs ve genotip 1 HCV bazlı bazlı bulaşıcı kültür sistemleri de 14-18 vardır.

Biz başarıyla protein alanları ve sis etkili RNA elemanlarının 19,20 yüksek çözünürlüklü fonksiyonel profil haritasını elde etmek JFH-1 suşu ve HCV intragenotype 2a kimerik virüs kullandık. Buna göre, burada biz olanak rutin kullanılan etkili bir kültür sistemi açıklanmaktadırHCV çoğaltma döngüsü ve konak-patojen etkileşimi çeşitli aşamaları okuyor. Bu viral genomun replikasyonu ve intragenotype 2a HCV ve bir Renilla lusiferaz raportör göre HCV de novo enfeksiyon değerlendirmek virolojik ölçümlerde mevcut.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün genel hatları Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1.. Hücreler

  1. 10-15% fetal sığır serumu (FBS), 10 mM esansiyel olmayan amino asitler, 10 mM Hepes, penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 mg / ml) ve 2 mM L-glutamin içeren tam büyüme ortamı hazırlayın.
  2. Hepatit C viral replikasyon döngüsünün in vitro analizi için, yukarıdaki takviyeleri ihtiva eden tam bir büyüme ortamı içinde Huh-7.5.1 hücreleri 13 koruyun.
  3. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de belirtilen desteklenmiş büyüme ortamı ile Huh-7.5.1 hücrelerinde kültür viral suşları.

2.. Virüs ve Plasmid yapılar

  1. HCV RNA'nın tamamlayıcı DNA (cDNA) formunu oluşturmak ve genetik manipülasyon kolaylığı için bir plazmid vektörü içine klonlamak. Not: Japon fulminant hepatit 1 keşfi, JFH-1 (genotip 2a HCV), HCV araştırma için kritik olan ve olduğunu sahiptir izolatöncelikle HCV çoğaltma döngüsü 11-13 incelemek için kullanılır. JFH-1 HCV göre arası ve intragenotypic kimerik virüsler genellikle 14-18 araştırma kullanılır. Sentetik intragenotype 2a kimerik virüs, FNX-HCV, ve bir monosistronik kimerik muhabir gerginlik İnşaat önceden 19 ve yapı detayları bu protokol kapsamı dışındadır tarif edilmiştir.
  2. O (nükleotidler 1-2878) J6CF ana suş (NCBI erişim no. AF177036), yanı bir 5'NTR, yapısal bölgeleri ve P7, NS2 ve yapısal olmayan bölgelerin bir parçası içerdiği pFNX-HCV intragenotype 2a virüsü kullanarak de JFH-1 virüs suşu (NCBI erişim no. AB047639) 'in yapısal olmayan bileşenler olarak. Not: FNX-HCV Jc1 intragenotype 2a kimerik HCV'nin sekansına göre sentezlendi önce 15 bildirdi.
  3. Bir R takarak (adım 2.2 yukarıda) pFNX-HCV gerginlik dayalı bir monosistronik kimerik muhabir viral yapıyı, pFNX-Rluc, üret5 've NTR (nt 388 ve 389 arasında) Çekirdek geni arasındaki enilla lusiferaz gen. Daha sonra, bölünme sinyali olarak çalışacak bir ayak ve ağız hastalığı virüsü 2A (F2A) peptid dizisi kullanılarak lusiferaz geni ve bu yapının çekirdek gen bağlayın.
  4. PFNX-HCV veya pFNX-Rluc viral bir arka plan kullanarak RNA polimeraz null (Pol-) viral yapı mühendisi. , AAG amino asit tortuları ile, bu viral omurgaların birinin, NS5B polimeraz katalitik kalıntıları, GDD (nt 8615-8623 aa 2759-2761) değiştirin.

3.. In Vitro HCV RNA transkripsiyon

  1. Bir intragenotype 2a kimerik virüs FNX-HCV ve HCV-FNX Pol, null viral replikasyon (Şekil 2A) değerlendirilmesi için (Pol-) HCV kullanın.
  2. Xbal kısıtlama enzimi ile linearize plazmid, viral ve sonra kör uçlar elde etmek için mung fasulye nükleaz ile muamele. Anyon değişim kromatografisi ile sindirilmiş plazmid arındırın. O bütünlüğünü doğrulayınf jel elektroforezi (Şekil 2B) agaroz DNA tabi tutulması ile doğrusallaştırılmış plasmid.
  3. T7-RNA polimerazı kullanılarak doğrusallaştırılmış viral plazmid uyarlamak.
  4. Bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak yeni sentezlenmiş DNase ile muamele edilmiş RNA arındırın.
  5. , Agaroz jel elektroforezi (Şekil 2C) ile RNA üretimini kontrol edin.
  6. Spektrofotometresi ile RNA niceliğini.
  7. 10 ug çalışma alikotlar içinde -80 ° C 'de üretilen RNA saklayın. Not: Aynı anda her viral numune ve kontrol için tüm RNA transkripsiyonu ile her bir deney tasarımı içinde RNA kalitesi varyasyonu en aza indirmek için.

4. HCV RNA Transfeksiyonu ve Örnek Toplama

  1. Tripsin kullanılarak Huh-7.5.1 hücreler hasat.
  2. Hücreler, santrifüj yıkayın ve soğuk düşük serum ortamı ile iki kez süspansiyon tekrar süspansiyon. Ml başına 1 x 10 7 hücre düşük serum medya hücreleri tekrar süspansiyon.
  3. 10 & # toplam Mix956, bir 0,4 cm'lik bir elektroporasyon küveti içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler (4 x 10 6 hücre) 400 ul ile transkribe viral RNA g. , 270 V de elektroporasyon ile 100 Ω ve 950 uF hücreleri transfekte.
  4. % 15 FBS, 10 ml tam büyüme ortamı içinde elektroporasyona hücrelerin yeniden süspanse edin. Not: Huh-7.5.1 hücreleri% 15 Fetal Bovine Serumu kültürlendiğinde Elektroporasyona tabi tutulan hücrelerin artan hayatta kalma görülmektedir.
  5. 4, 48 ve 96 saat: her ikisi de T-25 şişelerinde (kap basma 1.2 x 10 ~ 6 hücreleri) ve 48 kuyucuklu plaklar içinde, aşağıdaki zaman noktalarında her biri için (oyuk başına 1 x 10 4 hücreleri) hücrelerin Plate.
  6. Kültür şişelerinden ve levhalardan ölü hücre kalıntılarını uzaklaştırmak üzere,% 10 FBS katkılı taze büyüme ortamı ile 4-8 saat post-transfeksiyon ile Ortamı değiştirin.
  7. 48, 96 saat zaman noktalarında, ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüj ile hücreler toplandı örnekleri hücre tortularını çıkarmak hücre kültürü süpernatanları hasat º C
  8. -80 ° C de hücresiz süpernatantlar Mağaza Lyse Western blot ile protein ve RNA analizi için ve belirtilen zaman noktalarında transkripsiyon-nicel PCR ters hücreleri.

5.. HCV genom kopyalarının değerlendirilmesi için Transkripsiyon-kantitatif PCR (RT-qPCR) Ters

  1. HCV genomik RNA kopya sayısını belirlemek için iki adımlı bir RT-qPCR gerçekleştirin.
  2. Ters uyarlamak 1 ters transkriptaz ve 5'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') bağlanan HCV duyu şeridi için spesifik bir primer kullanılarak toplam hücresel RNA ug veya temizlik gen Peptidilprolil izomeraz G (PPIG R, için özel bir primer : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Ayrıca, HCV sense iplik primeri kullanılarak bilinen genom kopyalarının (10 1 9 standart 10) (Kademe 3 de üretilen) FNX-HCV RNA nın ters transkripsiyonunu.
  3. (JFH RT spesifik HCV primerler kullanılarak elde edilen transkripsiyonu cDNA 50 ng kullanılarak qPCR yürütmekQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') ve DNA qPCR süper karışımını içeren yeşil boya bağlayıcı. Hem de temizlik gen PPIG için qPCR yapın (primerler PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Not: örnekleri arasında, doğru hücre HCV RNA seviyesini hesaplamak için, cep temizlik geni PPIG kullanımı , normalleşme için ekspresyon seviyesi (Ct çevrimi). Kopya sayısının saptanması için standart olarak FNX-HCV genomunun kopya numarasını kullanın.
  4. 15 saniye için 95 ° C ve 60: qPCR çalışan HCV RNA kopya sayısını belirlemek için, aşağıdaki koşulları kullanarak   Gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılarak 30 saniye (40 devir) için C numara yerine.
  5. Genom replikasyonu için sonuçları Şekiller 3A ve 3B bakınız.

6.. Western Blot Analizi HCV Protein İfadesi (Şekil 3C) algılama için

  1. Hücre lizatları, fr kullanınom viral RNA protein, western blot analizi için 96 saat sonrası transfeksiyon transfekte.
  2. SDS-PAGE ve poliviniliden difluorür (PVDF) membran transfer kullanılarak hücre lizatı giderin.
  3. % 5 kaymağı alınmış süt, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde% 0.2 Tween 20 ihtiva eden bir blokaj çözeltisi kullanılarak membran bloke eder.
  4. Primer fare monoklonal antikoru NS3 ile membran (1 1000 sulandırma) ve beta-aktin (1 5000 sulandırma) inkübe edin.
  5. Turp peroksidaz (1 5000 sulandırma) konjuge keçi anti-fare IgG'si ilave edin ve kimyasal-ışıma ile tespit.

7. İmmünofloresan Deneyi (IFA)

  1. Imüno-flüoresan deneyi için -20 ° C'de 30 dakika boyunca metanol kullanılarak HCV-enfekte edilmiş ve transfekte hücreler düzeltildi.
  2. PBS ile üç kez yıkanır ve hücre IFA bloklama tamponu ile bloklayın.
  3. Tavşan poliklonal veya fare monoklonal anti-DSR (lütfen Dr Dasgupta'yı, UCLA tarafından sağlanan), anti-NS5A öncelikle antikor kullanınNA antikoru 1:200 (1 ug / ml) içinde bir seyreltmede J2 ve 5 saat için bir gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin º C
  4. Üç kez birincil antikor ardından hücrelerin PBS ile yıkayın.
  5. • Keçi anti-tavşan IgG-488, poliklonal antikor veya ikincil bir 1:1000 seyreltmesi (1 ug / ml) keçi anti-fare IgG-594 poliklonal ikincil antikor ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
  6. PBS floresan mikroskop (Şekil 3D) kullanarak Hoechst boyası ve görünümü kullanarak üç kez ve leke çekirdekler hücreleri yıkayın.

8. Ölçüm Virüs titresi

  1. Levha naif Huh-7.5.1 hücreler yaklaşık 3 x 10 3 hücre / oyuk, 96 oyuklu bir plaka kullanılmıştır. Ertesi gün, büyüme ortamı kullanılarak HCV RNA transfekte edilmiş hücrelerin hasat hücresiz kültür yüzer 10-kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek ve Huh-7.5.1 hücreler üzerine, üç kopya halinde inoküle.
  2. -20 ° C'de 30 dakika boyunca metanol (kullanarak 72 saat sonrası enfeksiyon hücreleri saptamak .
  3. NS5A pozitif odak saymak ve mililitre başına odak noktası oluşturan birimin ortalama sayısı (FFU) hesaplamak için yüksek seyreltme kullanın. HCV titresi için Şekil 4'e bakınız.

Viral genom replikasyonu ve enjeksiyon için 9. Renilla Lusıferaz Muhabir Deney

  1. Viral genomun replikasyonu, 48 oyuklu plakalarda üç kere levha HCV RNA-elektroporate Huh-7.5.1 hücreleri (1 x 10 4 hücre / çukur) değerlendirilmesi için.
  2. Lyse 6 saat sonra pasif lizis tamponu 75 ul, 48 saat ve 96 saat post-transfeksiyon ile hücreler.
  3. -80 ° C, oda sıcaklığı ve mağazada, 15 dakika boyunca yavaşça plakaları sallayın
  4. , Renilla lusiferaz enzim aktivitesinin ölçülmesi, oda sıcaklığına kadar protein lisat ve Renilla lusiferaz deney reaktif çözülme için.
  5. , 96 wel oyuk başına protein lizat 20 ul ekle l beyaz ışıldama plakası ve bir luminometre içerisinde plaka yerleştirilir.
  6. Renilla lusiferaz analiz ayıraçı (coelenterazine + alt-tabaka tamponu) ile kaplanır ve 2 saniye ön okunan bir süre sonra, 100 ul koyun; 10 saniye boyunca yayılan ışık entegre.
  7. Biyolojik üçlü lusiferaz değerleri her bir numune için ortalama ve standart sapmayı hesaplayın ve istatistik analiz için verileri (Şekil 5) tabi tutulması.
  8. Enfeksiyon değerlendirmek için, 48-çukurlu plakalarda naif Huh-7.5.1 hücreler üzerine üç kopya olarak belirtilen zaman noktalarında (48 saat ve 96 saat) için HCV RNA-transfekte edilmiş hücrelerden elde edilen hücre içermeyen yüzer 500 ul inokülasyon.
  9. De sonra 6 saat sonrası enfeksiyon başına taze orta 500 ul ile viral aşının değiştirin.
  10. Lyse 8,2-8,7 (Şekil 5) adımda tarif edildiği gibi Renilla lusiferaz deneyi için 48 saat post-enfeksiyon ve konuya hücreler.
itle "> 10. İstatistiksel Analiz

  1. Grafiklerde hata çubukları standart sapmalar (SD) gösterir. P değerleri, eşleştirilmemiş t testi ile hesaplanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit C virüs, bir RNA virüsüdür. Bu nedenle, genetik manipülasyon amaçla, HCV genomik cDNA bakteriyel bir plasmid vektörüne klonlanmıştır. A T7 RNA polimeraz promotörü sekans, HCV genomunun 5 'ucuna hemen önce başlandı. HCV analiz akışı bir genel hatları Şekil 1 'de sunulmuştur. Tam 3' ucuna sahip HCV genomik RNA oluşturmak için, plazmit ihtiva eden HCV genomu, Xba I kısıtlama enzimi ile oluşturulan tek sarmallı çıkıntı mung fasulye nükleaz sindirim ile köreltildi edildi ile kesilir . Doğrus...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu şekilde, hepatit C virüs çoğaltma döngüsü analiz etmek için bir yöntem tarif eder. HCV insan patojen ve öngörülen biyogüvenlik protokolü kesinlikle takip edilmesi gerekir. Bulaşıcı HCV hücre kültür sistemleri, daha önce 11-13,16,17 tarif edilmiştir. Resimli protokolü takip ederken biz uygulamak birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, alt çalışmalar için olduğu gibi tam uzunlukta viral genomik RNA'nın iyi kalitede olması için büyük önem taşımaktadır. Viral cDNA'yı taşıyan plazmid girişi lineerize ed...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huh-7.5.1 hücre hattını sağladığı için F. Chisari'ye teşekkür ederiz. Makaleyi düzenlediği için Justine Ho'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cedars-Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Programatik Araştırma Ödülü ve Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi, V.A.'ya UL1TR000124 tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
Esansiyel olmayan amino asitFisher ScientificMT25025CI
HEPESYaşam Teknolojileri15630080
GlutamaxYaşam Teknolojileri35050061
Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı, Fenol Yok Kırmızı Yaşam Teknolojileri11058-021
Huh-7.5.1Scripps Araştırma Enstitüsüarasında yürütülen MTA kapsamında Dr. Francis Chisari tarafından Dr. Arumugaswami'ye nazikçe sağlandı
.Cedars-Sinai Tıp MerkeziHCV plazmitleri, üst üste binen oligo-nükleotidler kullanılarak Dr. Arumugaswami tarafından sentezlendi.
XbaINew England Biyolaboratuvarlar A.Ş.R0145S Maş Fasulyesi
NükleazNew England Biolabs Inc.M0250S
T7 RiboMAX Express Büyük Ölçekli RNA Üretim SistemiPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Elektroporasyon Küveti (4 mm)BioexpressE-5010-4
Gen Pulser Xcell Toplam SistemBio-Rad165-2660
fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2 İngilizce & Bilimsel Danışmanlık Kft.
Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 488Yaşam TeknolojileriA11008
Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594Yaşam TeknolojileriA11020
PVDF membran paketiBio-Rad162-0263
Kurutma Sınıfı Engelleyici Yağsız Kuru SütBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
Anti-Hepatit C Virüsü NS3 antikoru [8 G-2]Abcamab65407
Anti-Hepatit C Virüsü NS3 antikoru [H23]Abcamab13830
Yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge keçi anti-fare IgG Jackson İmmüne Araştırma Laboratuvarları A.Ş.115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Tespit Reaktifleri GE Sağlık Yaşam BilimleriRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Yaşam Teknolojileri18080085
SYBR QPCR SUPERMIX, ROX YaşamTeknolojileri11744500
ViiA 7 gerçek zamanlı PCR sistemiYaşam TeknolojileriNA
Renilla Lusiferaz Test Sistemi kitiPromegaE2810
RNaz İçermeyen DNasePromegaM6101
GloMax-Çoklu Algılama Sistemi (Luminometre)Promega
Hücre hattı, Scripps Araştırma Enstitüsü ile Cedars-Sinai Tıp Merkezi Plazmidleri (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc ve pFNX-Rluc Pol null) 10010200 Fuar

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
  4. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  5. Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
  6. Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
  7. Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
  8. Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
  9. Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
  10. Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
  11. Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
  12. Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
  13. Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
  14. Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
  15. Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
  16. Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
  17. Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
  18. Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
  19. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
  20. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  21. Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
  22. Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
  23. Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
  24. Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
  25. Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
  26. Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
  27. Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis C VirusHCV ReplicationViral RNA TransfectionQuantitative RT PCRWestern BlotImmunofluorescence AssayViral Titer MeasurementLuciferase AssayCell Culture SupernatantHuh 7 Cells

Related Articles