Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Summary

Hepatit C Virüsü (HCV), siroz ve kanser dahil olmak üzere karaciğer bozukluklarına neden olan önemli bir insan patojenidir. HCV enfeksiyöz hücre kültürü sistemi, HCV replikasyonunun moleküler mekanizmasını anlamak ve yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek için gereklidir. Burada, HCV replikasyon döngüsünün çeşitli aşamalarını araştırmak için bir protokol açıklıyoruz.

Abstract

Hepatit C Virüsü (HCV) dünya nüfusunun% 3 etkiler ve kronik hepatit, siroz ve hepatosellüler karsinom gibi ciddi karaciğer rahatsızlıkları olur. HCV, Flaviviridae ailesine ait zarflı bir RNA virüsüdür. Mevcut tedavi, tam etkili değildir ve istenmeyen yan etkilere neden olur. Hiçbir HCV aşısı yoktur. Bu nedenle, devam eden bir çaba bir aşı ve daha iyi bir tedavi geliştirmek için gereklidir. HCV bir hücre kültür sistemi viral girişi, genom replikasyonu, paketleme, ve çıkış da dahil olmak üzere HCV gelişmesinin çeşitli aşamalarında çalışmaları için önemlidir. Sunulan mevcut prosedüründe, bir vahşi tip intragenotype 2a kimerik virüs, FNX-HCV ve virüs çoğaltma incelemek için bir Renilla lusiferaz haberci genini taşıyan bir rekombinant virüs FNX-Rluc kullanılır. Bir insan hepatoma hücre hattı (Huh-7 göre) in vitro transfeksiyonu için kullanılmıştır HCV genomik RNA transkripsiyonu. Hücresiz kültür üst sıvıları, protein lizatlan ve tla m HCV RNA büyümeyi değerlendirmek için post-transfeksiyon işaret çeşitli zaman hasat edilmiştir. HCV genomu, çoğaltma durum nicel RT-PCR ve HCV varlığının görüntülenmesi iki-şeritli RNA tarafından değerlendirildi. HCV protein ekspresyonu HCV NS3 ve NS5A proteinleri için spesifik antikorların kullanıldığı Western blot ve imüno deneyleri ile doğrulanmıştır. Kültür yüzer ve viral titresi olarak bulaşıcı parçacıklar serbest HCV RNA transfekte edilmiş hücreler ölçülmüştür. Lusiferaz deneyleri, raportör HCV'nin replikasyon seviyesi ve enfeksiyon riskini değerlendirmek için kullanılmıştır. Sonuç olarak, HCV replikasyon döngüsünün farklı aşamalarında karakterize etmek için çeşitli virolojik ölçümlerde mevcut.

Introduction

Hepatit C virüsü (HCV), siroz ve karaciğer kanserine neden olur. Bu 350,000 kişi yılda ^1-3 ölüyor, dünya çapında 170 milyon kişiyi etkilemektedir. HCV 9.6 kb'lik bir genom boyutuna sahip bir pozitif iplikli bir RNA virüsüdür. HCV genomu, proteolitik olarak 10 polipeptitlere çeşitli hücresel ve viral proteazlar tarafından yarılır ~ 3000 amino asit kalıntıları tek bir poliprotein olarak tercüme edilir. HCV cinsi Hepatit C virüs in prototip virüsüdür ve Flaviviridae familyası ⁴ aittir. Maruz kalması üzerine, HCV bireylerin% 80, kronik enfeksiyon oluşturur. Enfeksiyon tanısı karaciğer bozulmasını önlemek için terapötik müdahaleye izin v....

Protocol

Protokolün genel hatları Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1.. Hücreler

1. 10-15% fetal sığır serumu (FBS), 10 mM esansiyel olmayan amino asitler, 10 mM Hepes, penisilin (100 birim / ml), streptomisin (100 mg / ml) ve 2 mM L-glutamin içeren tam büyüme ortamı hazırlayın.
2. Hepatit C viral replikasyon döngüsünün in vitro analizi için, yukarıdaki takviyeleri ihtiva eden tam bir büyüme ortamı içinde Huh-7.5.1 hücreleri ¹³ koruyun.
3. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de belirtilen desteklenmiş büyüme ortamı ile Huh-7.5.1 hücrelerinde kültür viral suşları.

Results

Hepatit C virüs, bir RNA virüsüdür. Bu nedenle, genetik manipülasyon amaçla, HCV genomik cDNA bakteriyel bir plasmid vektörüne klonlanmıştır. A T7 RNA polimeraz promotörü sekans, HCV genomunun 5 'ucuna hemen önce başlandı. HCV analiz akışı bir genel hatları Şekil 1 'de sunulmuştur. Tam 3' ucuna sahip HCV genomik RNA oluşturmak için, plazmit ihtiva eden HCV genomu, Xba I kısıtlama enzimi ile oluşturulan tek sarmallı çıkıntı mung fasulye nükleaz sindirim ile köreltildi edildi ile kesilir . Doğrus.......

Discussion

Bu şekilde, hepatit C virüs çoğaltma döngüsü analiz etmek için bir yöntem tarif eder. HCV insan patojen ve öngörülen biyogüvenlik protokolü kesinlikle takip edilmesi gerekir. Bulaşıcı HCV hücre kültür sistemleri, daha önce ^11-13,16,17 tarif edilmiştir. Resimli protokolü takip ederken biz uygulamak birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, alt çalışmalar için olduğu gibi tam uzunlukta viral genomik RNA'nın iyi kalitede olması için büyük önem taşımaktadır. Viral cDNA'yı taşıyan plazmid girişi lineerize ed.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Esansiyel olmayan amino asit	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Yaşam Teknolojileri	15630080
Glutamax	Yaşam Teknolojileri	35050061
Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı, Fenol Yok Kırmızı Yaşam Teknolojileri		11058-021
Huh-7.5.1	Scripps Araştırma Enstitüsü		arasında yürütülen MTA kapsamında Dr. Francis Chisari tarafından Dr. Arumugaswami'ye nazikçe sağlandı
.	Cedars-Sinai Tıp Merkezi		HCV plazmitleri, üst üste binen oligo-nükleotidler kullanılarak Dr. Arumugaswami tarafından sentezlendi.
XbaI	New England Biyolaboratuvarlar A.Ş.	R0145S Maş Fasulyesi
Nükleaz	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Büyük Ölçekli RNA Üretim Sistemi	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Elektroporasyon Küveti (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gen Pulser Xcell Toplam Sistem	Bio-Rad	165-2660
fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2	İngilizce & Bilimsel Danışmanlık Kft.
Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 488	Yaşam Teknolojileri	A11008
Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594	Yaşam Teknolojileri	A11020
PVDF membran paketi	Bio-Rad	162-0263
Kurutma Sınıfı Engelleyici Yağsız Kuru Süt	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anti-Hepatit C Virüsü NS3 antikoru [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anti-Hepatit C Virüsü NS3 antikoru [H23]	Abcam	ab13830
Yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge keçi anti-fare IgG	Jackson İmmüne Araştırma Laboratuvarları A.Ş.	115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Tespit Reaktifleri	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Yaşam Teknolojileri	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX, ROX Yaşam	Teknolojileri	11744500
ViiA 7 gerçek zamanlı PCR sistemi	Yaşam Teknolojileri	NA
Renilla Lusiferaz Test Sistemi kiti	Promega	E2810
RNaz İçermeyen DNase	Promega	M6101
GloMax-Çoklu Algılama Sistemi (Luminometre)	Promega