Selüloz Fabrikası Atık Akışlarında Mikrobiyal Büyümeyi Kolaylaştırma Yöntemleri ve Kültürlenmiş Mikropların Biyolojik Bozunma Potansiyelinin Karakterizasyonu

Özet

Endüstriyel atıklar, mikrobiyal büyümeyi analiz etmek için toplanabilir ve değiştirilebilir. Lignoselüloz ekstraksiyon teknikleri, spesifik biyolojik bozunma kabiliyetini analiz etmek için bileşenler sağlar. Gaz kromatografisi-kütle spektrometresi, hamur atıkları üzerinde yetiştirilen mikroorganizmaların fermantasyon ürünlerini tanımlar. Bu yöntemler, mikroorganizmaların hamur atıklarını parçalamak için metabolik kapasitesini belirler.

Özet

Kraft işlemi, yüksek kaliteli bir kağıt üretecek kağıt hamuru için lignoselüloz içindeki polisakkaritlerden ligninin ayrılması için odun yongalarına uygulanır. Siyah likör, kraft işlemi tarafından üretilen ve aşağı akış biyodönüşüm potansiyeline sahip bir hamurlaştırma atığıdır. Bununla birlikte, lignoselüloz kaynaklarının inatçı doğası, siyah likör içindeki mevcut organik karbonun çoğunluğunu oluşturan kimyasal türevleri ve bazik pH'ı, bu atık malzemenin mikrobiyal biyolojik bozunması için zorluklar ortaya koymaktadır. Mikrobiyal büyüme için siyah likörün toplanması ve modifikasyonu için yöntemler, bu hamur atığının lignin, organik asitler ve polisakkarit bozunma yan ürünlerini değerli kimyasallara dönüştürmek için kullanılmasını amaçlamaktadır. Sunulan lignoselüloz ekstraksiyon teknikleri, kültürlenmiş mikroorganizmaların metabolik kapasitelerini anlamak için lignoselüloz büyüme substratlarının hazırlanması için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Gaz kromatografisi-kütle spektrometresinin kullanılması, hamurlaştırma atıkları üzerinde mikroorganizmaların büyümesinden kaynaklanan fermantasyon ürünlerinin tanımlanmasını ve miktarının belirlenmesini sağlar. Bu yöntemler birlikte kullanıldığında, kağıt hamuru sistemine daha fazla değer sağlayacak ve atık su atıklarını azaltacak fermantasyon ürünleri üretme potansiyeline sahip mikroorganizmaların metabolik aktivitesinin belirlenmesini kolaylaştırabilir, böylece potansiyel kağıt değirmenciliği karlarını artırabilir ve siyah likör için ek kullanımlar sunabilir.

Giriş

Ahşabın hamur haline getirilmesi, minimum atıkla bir sistem oluşturmak için uzun yıllar boyunca optimize edilmiş, kimyasal olarak yoğun bir süreçtir. Bununla birlikte, bu sürecin bazı çıktıları daha yüksek değerli ürün(ler) üretmek için kullanılabilir. Siyah likör böyle bir örnektir. Dünya lignin üretiminin %85'ini temsil eden baskın kimyasal hamurlaştırma yöntemi olan kraft işleminden üretilir¹. Kraft işlemi (Şekil 1), odun liflerinden^2,3 lignini çözmek için sıcaklık (160-200 °C), basınç (120 psig) ve beyaz likörde bulunan kimyasalları (sodyum hidroksit ve sodyum sülfür) kullanır. Siyah likör lignin, organik asitler ve polisakkarit bozunma yan ürünleri içerir⁴. Aşağı akış kağıt yapımı ve kağıt hamuru işlemleri için termal enerji sağlayan geri kazanım kazanında buhar üretmek ve kimyasalları geri kazanmak için yakılır. Hamur haline getirme ile üretilen siyah likörün hacmi, geri kazanım kazanının etkili bir şekilde işleyebileceği miktarı aşabilir. Siyah likörün atık su olarak atılması sucul flora ve faunayı olumsuz etkiler ve bu nedenle bir seçenek değildir. Büyüme için siyah likör kullanabilen mikrobiyal organizmaların uygulanması, kimyasal geri kazanımın artırılması ve hamurlaştırma sisteminin genel yaşam döngüsü analizini iyileştirecek katma değerli ürün(ler)in üretilmesi açısından faydalı olacaktır. Lignin türevi monomerlerin kimyasal ve biyolojik dönüşümü, gıda tatlandırıcıları ve koku katkı maddeleri olarak kullanılmak üzere vanilin ve sinnamik asit, plastik ve reçineler için kullanılan fenol ve yakıt⁵ için kullanılabilecek sikloheksan'ı başarıyla üretmiştir.

Bu hamur atığının biyolojik bozunması üzerine önceki çalışmalar lignin depolimerizasyonuna odaklanmıştı. Uluslararası Lignin Enstitüsü (ILI), her yıl 40-50 milyon ton arasında lignin üretildiğini bildirmektedir (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Bu ligninin sadece% 1.5'i ticari endüstriyel işlemler için kullanılmaktadır⁶. Fanerochaete ve Trametes cinslerinin beyaz çürüklük mantarları tarafından üretilen lakkaz ve peroksidaz enzimleri ile lignin depolimerizasyonu uzun uzadıya incelenmiştir⁷. Nocardia ve Rhodococcus⁸, Pseudomonas putida mt-2⁹ ve Streptomyces viridosporus T7A¹⁰ gibi aromatik bileşikleri parçaladığı bilinen toprak bakterilerinin de lignin bozunması yapabildiği gösterilmiştir. Kağıt hamuru atıklarının bakteriyel bozunması umut vericidir, çünkü bazı bakteriler hamurlaştırma atığı atıklarını karakterize eden tuzlu ve alkali (pH 10-14) koşullarda gelişebilir¹¹. Lignin, siyah likörün ana bileşeni olsa da, mikroorganizmalar siyah likörü oluşturan diğer bileşenleri de bozabilir. Bu teknikler yalnızca lignin parçalayıcı mikroorganizmaları tanımlamaz, ancak daha fazla işlenmiş bileşenleri yerine doğrudan hamur haline getirme atığı siyah likörüne uygulanabilen mikroorganizmaları tanımlamaya hizmet eder.

Siyah likör toplandı ve nötralizasyon ve filtre sterilizasyonu yoluyla mikrobiyal büyüme için modifiye edildi. Yeni bir lignoselüloz ekstraksiyon protokolü tarafından üretilen lignoselülozik bileşenler üzerinde minimal ortam büyüme deneyleri ile çevresel bir mikrobiyal izolat için mikrobiyal büyüme gereksinimleri tanımlanmıştır. Büyüme ortamı, tek karbon kaynağı olarak siyah likör üzerinde yetiştirildiğinde çevresel mikrobiyal izolatın metabolik ürünlerini belirlemek için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile analiz edildi. Bu tekniklerin kombinasyonu, siyah likör gibi kağıt hamuru değirmeni atıkları üzerinde yetiştirildiğinde bir mikroorganizmanın metabolik kapasitesini belirlemek için bir değerlendirme aracı sağlar. Bu tür tekniklerin kullanılması, yan ürünlerin üretilmesi için belirli mikroorganizmaların kağıt hamuru değirmeni atıklarına uygulanmasının değeri hakkında da fikir verir.

Protokol

1. Siyah Likörün Toplanması ve Büyüme Kültürleri için Siyah Likörün Hazırlanması

1. Steril bir cam şişede kraft çürütücüye bağlı çıkış valfinden siyah bir likör numunesi alın ve aşağıdaki adımlara geçmeden önce oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
   Nötralizasyon
2. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış 500 ml'lik bir behere 100 ml siyah likör örneği ekleyin.
3. Beheri bir karıştırma plakasına yerleştirin ve hızı orta seviyeye ayarlayın.
4. Siyah likör viskoz hale gelene kadar (gliserole benzer viskozite) yavaşça fosforik asit damlaları ekleyin.
Siyah
5. likör çözeltisinin tamamını 50 ml'lik konik tüplere yavaşça dökerek ve 9.300 x g'da 30 dakika santrifüjleyerek alikotlayın.
6. Süpernatanı behere yerleştirin ve pH test şeritlerini kullanarak pH'ı ölçün. Çökeltilmiş lignin peleti atılabilir ve tehlikeli olmayan katı atık olarak işlenebilir.
7. Fosforik asit eklemeye devam edin ve pH şeritleri süpernatantın nötr pH'ını gösterene kadar çözeltiyi santrifüjleyin.
   Sterilizasyon
8. Kirletici bakterileri gidermek için çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin ve filtrelenmiş çözeltiyi saklama için steril bir kaba koyun. Oda sıcaklığında saklayın.

2. Lignoselüloz Ekstraksiyonu

Karbonhidrat Ayrımı

1. 5 g şalt otu, çam veya Bermuda otu (1 mm veya daha küçük parçacık boyutuna öğütülmüş) 500 ml'lik bir Erlenmeyer şişesine yerleştirin. Daha sonra şişeye 200 ml damıtılmış veya deiyonize su, 7.5 g NaClO₂, 2.5 ml buzlu asetik asit ve bir karıştırma çubuğu ekleyin.
2. Şişeyi, 1 saat boyunca 80 ° C'de bir karıştırma plakasının üzerine yerleştirilmiş bir yağ banyosuna yerleştirin. Karıştırma plakasının hızını orta olarak ayarlayın.
3. Şişeye ilave 7.5 g NaClO2 ve 2.5 ml buzlu asetik asit ekleyin. 80 °C'de yağ banyosunda 30 dakika karıştırmaya devam edin.
4. Önceki adımı 2x tekrarlayın (Not: lignoselülozik biyokütle içeren şişeye toplam 30 g_NaClO2 ve 10 ml buzlu asetik asit eklenir). Çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun.
5. Bir Büchner hunisine bir yaprak filtre kağıdı yerleştirin. Huniyi bir yan kol şişesinin üzerine yerleştirin ve bir elektrikli süpürgeye takın.
6. Çözeltiyi yavaşça huniye dökün.
7. Katı malzemeyi 3x 100 ml damıtılmış veya deiyonize su ile yıkayın. Katı malzemeyi yıkadıktan sonra süzüntüyü atın.
8. 1 g katı malzeme ayırın ve temiz bir filtre kağıdına yerleştirin.
9. Bu katı malzemeyi gece boyunca 50 °C fırında kurutun. Numuneyi fırından çıkardıktan sonra, 'holoselüloz' etiketli bir saklama kabına yerleştirin.
10. Kalan katı maddeyi 500 ml'lik bir Erlenmeyer şişesinde 250 ml %10 NaOH (h/h) içine ekleyin. Şişeyi bir tıpa ile kapatın.
11. Çözeltiyi 70 °C'de 1 saat boyunca 250 rpm'de çalkalayarak bir inkübatöre yerleştirin.
12. Çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika soğutun.
13. Filtre kağıdı ve bir yan kol şişesine bağlı Büchner hunisini kullanarak katı malzemeyi çıkarın.
14. Katı malzemeyi temiz bir filtre kağıdı tabakasına 50 °C'lik bir fırına aktarın ve gece boyunca kurumasını bekleyin.
15. Kalıntı kuruduktan sonra, bir saklama kabına koyun ve 'selüloz' olarak etiketleyin.
16. Süzüntüyü adım 2.13'ten 500 ml'lik bir Erlenmeyer şişesine aktarın ve 30 ml asetik asit ve 250 ml izopropil alkol ekleyin. Şişeyi kapatın ve çözeltiyi oda sıcaklığında en az 8 saat tezgah üstüne yerleştirin.
17. Çözeltinin tamamını 50 ml'lik konik tüplere aktarın ve çözeltiyi 30 dakika boyunca 9.300 x g'da santrifüjleyin. Çözeltiyi dikkatlice konik tüpten pipetleyin ve atın.
18. Peletleri 30 ml damıtılmış veya deiyonize su içinde girdaplama ile yeniden süspanse edin.
19. Peleti iyice yıkamak için 2.17-2.18 15 adımlarını tekrarlayın.
20. Süpernatanı çıkarın ve peleti dondurarak kurutma için saklayın. Dondurularak kurutulduktan sonra numuneyi toplayın ve 'hemiselüloz' etiketli bir şişeye koyun.
    Lignin ayrımı
    Karaaslan ve ark. ¹²
21. 500 ml 0.25 M NaOH ve% 30 etanol çözeltisine 5 g şalt otu, çam veya Bermuda otu (1 mm veya daha küçük parçacık boyutuna öğütülmüş) ekleyin. Bulamacı 75 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin ve 250 rpm'de 2 saat çalkalayın.
22. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun.
23. Bir Büchner hunisine bir yan kol şişesinin üzerine bir yaprak filtre kağıdı yerleştirin. Bir vakuma takın ve çözeltiyi yavaşça huniye dökün.
24. Katı malzemeyi atın.
25. Süzüntüyü içeren şişeye bir karıştırma çubuğu ekleyin ve şişeyi orta hıza ayarlanmış bir karıştırma plakasının üzerine yerleştirin. 2.0'lık bir pH elde edilene kadar (yaklaşık 20 ml) çözeltiye damla damla konsantre hidroklorik asit ekleyin.
26. Asitlenmiş çözeltinin gece boyunca oda sıcaklığında oturmasına izin verin.
27. Çözeltiyi konik tüplerde 30 dakika boyunca 9.300 x g'da santrifüjleyin. Solüsyonu konik tüpten dikkatlice pipetleyin ve atın.
28. Peletleri 30 ml damıtılmış veya deiyonize su içinde girdaplama ile yeniden süspanse edin.
29. Peleti iyice yıkamak için 2.27-2.28 15x adımlarını tekrarlayın.
30. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti dondurarak kurutma için saklayın. Dondurularak kurutulduktan sonra, numuneyi 'lignin' etiketli bir şişeye yerleştirin.

3. Mikrobiyal Büyüme Kültürlerinin Hazırlanması

Agar Plakaları

1. Plakaları dökmeden önce M9 minimal media¹³ agar'a %0,2 (a/h) steril lignoselüloz ekstraksiyon ürünleri ekleyin.
Yaklaşık
2. 2.0 OD ile M9 minimal ortamında büyütülen yaklaşık 200 ul bakteri kültürüne sahip çizgili katılaşmış plakalar.
3. Plakaları 37 °C'de inkübe edin ve büyümeyi izleyin.
   Sıvı Kültürler
4. Steril 125 ml'lik bir şişeye 50 ml steril Luria-Bertani (LB) ortamı¹³ veya M9 minimal ortamı¹³ ekleyin. Lignoselüloz ekstraksiyon ürünlerinin %10 (h/v) veya %0.2'si (a/h) oranında siyah likör ekleyin.
5. Ortamı, yaklaşık 2.0'lık bir OD'de% 0.1 (h / h) bakteri kültürü ile aşılayın.
6. Kültürleri 37 ° C'de 200 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
7. Optik yoğunluğu (λ = 600 nm) ölçerek kültürleme döneminde her 6 saatte bir büyümeyi değerlendirin. Kültürün 1 ml'lik bir alikotunu bir küvete yerleştirin. Aşılanmamış ortama karşı köreltilmiş kültürün optik yoğunluğunu belirleyin.
8. Bakterileri orta log fazında anaerobik bir serum şişesine aktarın.
   1. Anaerobik serum şişesini hazırlamak için: serum şişesini aerobik koşullar ve otoklav altında bir bütil kauçuk tıpa ve alüminyum kıvrımlı bir üst kısım ile kapatın. Sterilizasyondan sonra serum şişesindeki üst boşluğu değiştirmeyin.
   2. 50 ml'lik kültürün tamamını 125 ml'lik şişeden bir şırınga kullanarak kapalı steril serum şişesine aktarın.
   3. 200 rpm'de çalkalanarak 37 °C'de inkübe edin.

4. GC-MS için Numune Hazırlama

Örnekleri Raj, Reddy ve Chandra^14'e göre hazırlayın. Karşılaştırma için kullanılan negatif kontrol, %10 siyah likörlü M9 minimal ortamdan oluşur ve aynı zamanda aşılanmamış numune olarak da adlandırılır.

1. Aşılanmamış ve aşılanmış bakteri kültürlerini (50 ml) 450 saatlik inkübasyondan sonra 30 dakika boyunca 9.300 x g'da santrifüjleyin.
2. 10 ml süpernatanı bir cam test tüpüne aktarın. (Not: Plastik, aşağıdaki adımlarda yer alan kimyasallarla uyumlu değildir.)
3. Süpernatanı konsantre HCl ile pH 1-2'ye asitleştirin.
4. 3 hacim etil asetat (30 ml) ekleyin, tüpün kapağını kapatın ve 4-6x ters çevirerek karıştırın.
5. Temiz bir cam test tüpüne az miktarda susuz Na_2S04 (1-2 g) koyun.
6. Tek kullanımlık bir cam Pasteur pipeti ile pipetleyerek etil asetat çözeltisinden organik tabakayı (üstte) dikkatlice toplayın.
7. Organik tabakayı susuz_Na2S04ile test tüpüne yerleştirin.
8. Karıştırmak için test tüpüne hafifçe vurarak organik tabakayı susuz Na_2S04 üzerinde susuzlaştırın. Yavaş yavaş az miktarda susuz_Na2S04ekleyin ve büyük topaklar kalmayana kadar karıştırın.
9. Bir vakuma bağlı bir yan kol şişesinin üstündeki bir Büchner hunisine bir filtre kağıdı yaprağı yerleştirin.
10. Çözeltiyi huniye dökün. Katı malzemeyi atın.
11. Çözeltiyi bir buharlaşma şişesine aktarın ve süzüntüyü döner bir buharlaştırıcı kullanarak buharlaştırın.
12. 3 mg etil asetat ekstraksiyon kalıntısını 2 ml'lik bir amber kromatografi şişesine yerleştirin.
13. Kalıntıyı 100 μl 1,4-dioksan ve 10 μl piridin ilavesiyle çözün.
14. Trimetilkolorsilan% 99: 1 (BSTFA) ile 50 μl N, O-Bis (trimetilsilil) trifloroasetamid ekleyin. Daha sonra 60 °C'de 15 dakika çalkalayarak bir inkübatöre koyun.
15. Numuneleri kullanana kadar 4 °C'de saklayın.

5. GC-MS

Bir kütle spektrometresi (MS) ile arayüzlü gaz kromatografını (GC), polar olmayan bir kılcal kolon ve taşıyıcı gaz olarak 1 ml/dk akış hızına sahip helyum ile donatın.

1. Fırın sıcaklığı 50 °C'de stabilize edildikten sonra, 1/50 bölme oranında 1 μl numune enjekte edin.
2. Kolonu 50 °C'de 5 dakika tutun ve 5 °C/dk'da 280 °C'ye yükseltin. 280 °C'lik son sıcaklığı 20 dakika koruyun.
3. Gaz kromatografı ile kütle spektrometresi arasındaki transfer hattını 300 °C'de tutun.
4. 15 dakikalık bir çözücü gecikmesi seçin.
5. 70 eV elektron enerjisinde 10-500 (m/z) aralığı arasında elektron iyonlaşma kütle spektrumlarını kaydedin.
6. Yukarıdaki gibi standart türevlendirin ve kromatograf yapın. Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) kütle spektral veritabanındaki satın alınan standartların veya verilerin bekletme sürelerini karşılaştırarak bileşikleri tanımlayın.

Sonuçlar

Kraft hamurlaştırma işleminde üretilen siyah likörün toplanması ve modifikasyonu (Şekil 1), tek bir bakteri izolatının veya karışık kültürün biyolojik bozunma kapasitesini belirlemek için bu hamurlaştırma atığının kullanılmasına izin verecektir. Şekil 2, tek başına LB ortamında kültürlenen mikrobiyal çevresel izolatın ve nötralize siyah likör ile desteklenmiş LB ortamının optik yoğunluğu ile ölçülen aerobik büyümeyi göstermektedir. Bu sonuçlar, bu bakterinin nötralize edilmiş siyah likö...

Tartışma

Bu protokol, kağıt hamuru atıklarını bozabilecek mikroorganizmaları, kağıt hamuru atıklarında büyüme sırasında kullanılan karbon kaynaklarını ve kağıt hamuru atıkları üzerinde yetiştirildiğinde üretilen mikrobiyal metabolik ürünleri tanımlamayı amaçlayan tekniklerin bir kombinasyonunu açıklamaktadır. Bu protokolün başarısını mikrobiyal çevresel izolatla gösterdik: %10 siyah likör üzerinde büyüyebilen ve lignoselüloz ekstraksiyon bileşenlerini büyüme için tek karbon kaynağı olarak kullanabilen fakültatif bir anaerob. Bu p...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,4-Dioksan (Sertifikalı ACS)	Fisher	D111	Yanıcı, önceden oksitlenebilir kimyasal
Siyah Likör	North Carolina Eyalet Üniversitesi Orman Biyomalzemeleri Bölümü	N/A	pH 12.72, %13.67 katı madde
Etanol (mikrobiyoloji sınıfı)	Fisher	BP2818
Etil Asetat (ACS reaktif sınıfı)	EMD	EX0240-9	Yanıcı
Buzlu asetik asit (Sertifikalı ACS)	EMD	AX0073	Aşındırıcı
Guaiacol	Sigma Aldrich	PHR1136	Yutulduğunda zararlı, aşındırıcı
HP-5 kılcal kolon	Agilent	19091J-577	60 m x 0,18 mm iç çap, 0,18 & mu; m kalınlık
Hidroklorik asit (sertifikalı ACS)	EMD	HX0603P
N, O-Bis (trimetilsilil) trifloroasetamid ile trimetilkolorsilan% 99: 1 (BSTFA)	Fluka	15238	Yanıcı, temas ile cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur
Na < sub > 2 < / sub > SO < sub > 4 < / sub> (FCC sınıfı)	VWR	BDH8026
NaClO2< / sub> (% 80)	Sigma Aldrich	244155	Yanıcı, toksik
NaOH (sertifikalı ACS)	EMD	1.06498.1000	Aşındırıcı
Alkacid pH test şeritleri	Fisher	A979
Fosforik Asit (sertifikalı ACS)	Fisher	A242
Polaris Q kütle spektrometresi	Thermo Electron Corporation
Piridin (% 99)	Alfa Aesar	A12005	Yanıcı, cilt ile temasında toksik
Switchgrass	Kiraz Araştırma Çiftliği Goldsboro, NC	/A	Hasat Ağustos 2011
Thermo Finnigan eser gaz kromatografı	Thermo Electron Corporation
Whatman no. 1 filtre kağıdı	Whatman	1001-150