Yöntem makalesi

Bir In vivo Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

16.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51387

⸱

23 Nisan 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

Bu makalede

Özet

Çok bileşenli protein kompleksleri hücre fonksiyonu ve gelişme sırasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada çapraz bağlayıcı in vivo daha sonra yapı-işlev analizi için çapraz bağlı kompleksler, ardından arıtma ardından Drosophila embriyolardan yerli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder.

Özet

Pek çok hücresel süreçleri multisubunit protein kompleksleri tarafından kontrol edilir. Sıkça bu kompleksler geçici oluşturmak ve birleştirmek için doğal bir ortam gerektirir. Bu nedenle, bu işlevsel protein kompleksleri tespit etmek için, hücre lizizi ve daha sonra saflaştırma daha önce in vivo olarak bunları stabilize etmek için önemlidir. Burada Drosophila embriyolardan büyük niyetli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, hücre zarını kolayca geçebilir formaldehit düşük bir konsantrasyonu kullanılarak in vivo çapraz bağlama ile embriyoların içine komplekslerin embriyo nüfuziyet ve stabilizasyon dayanmaktadır. Daha sonra, ilgilenilen protein kompleksi jel geçirilmiş, ardından arıtma ve kütle spektrometresi ile analiz edilir İmmüno. Bu tohum çizgisi gelişimi için gerekli olan bir Tudor protein kompleksi, saflaştırılmasını kullanarak bu yöntemi örneklemektedir. - Küçük Tudor birden Tudor etki alanı içeren büyük bir proteindirHedef proteinlerin metillenmiş arginines veya lisin ile etkileşim modülleri. Bu yöntem, farklı organizmalardan ve dokulardan yerli protein komplekslerinin izolasyonu için uyarlanabilir.

Giriş

Multisubunit protein montajlar ve DNA-ya da RNA-protein komplekslerinin izolasyonu protein kompleksleri, DNA-bağlanma düzenleyici proteinler veya RNA bağlama proteinlerinin RNA hedefleri tarafından kabul genomik lokusları tespit için gerçekleştirilir. Farklı yöntemler, belirli bir RNA-bağlama proteini (CLIP-seq) 2 ile ilişkili transkripsiyon faktörleri veya kromatin proteinleri (ChIP-seq) 1 ve RNA hedefleri tarafından tanınan DNA siteleri genom tanımlanmasını sağlar. RNA türetilmiş cDNA ya da DNA hedeflerinin diziler daha sonra derin dizilir. Bu yöntemler, kimyasal veya UV kaynaklı çalışılan kompleksinin bir protein bileşenine karşı bir antikor ile immüno-çökeltme (IP) takip kompleksleri stabilize etmek için çapraz bağlama kullanın.

Bir organizmanın gelişimi sırasında, çok sayıda geçici protein kompleksleri oluşturur. Bu nedenle, kontrol dev moleküler mekanizmaların anlaşılması, in vivo olarak, bu komplekslerin bileşimi ve işlevini analiz için çok önemlidirelopment. Bu etkileşim bileşenleri ve in vitro olarak hücre biyokimyasal ortamı yerel konsantrasyonları üretmek için neredeyse imkansız olduğu için bu tür bir in vivo analiz in vitro yaklaşımına göre daha üstün olacaktır. Burada biz başarılı Drosophila embriyolar büyük protein kompleksleri izole etmek için kullanabileceğiniz bir in vivo yaklaşım göstermektedir. Bu yöntemde, canlı embriyolar protein kompleksleri düşük formaldehit konsantrasyonu ve daha sonra ilgi protein kompleksleri için kompleksleri ve kütle spektrometre analizi jel geçirilmiş, ardından arıtma komplekslerinin bilinen bir bileşenine karşı bir antikor ile IP ile izole edilir ile çapraz bağlanmış olan bilinmeyen karmaşık bileşenleri tanımlar. Formaldehit hücre zarı nüfuz edebilir ve 2.3-2.7 Â 3 bir dizi çapraz bağlama sahip olduğu için, protein kompleksleri, in vivo olarak çapraz bağlanabilir ve karmaşık parçaları birbirine yakın olması muhtemeldir. Bu makalede bizBir örnek olarak Tudor (Tud) protein kompleksinin izole edilmesini kullanarak bu yöntem açıklanmaktadır. Tud tohum çizgisi 4-7 gelişimi için gerekli olan bir tohum çizgisi proteindir. Bu protein için diğer polipeptidlerin 8-10 metillenmiş arginines veya lisin ile etkileşim için bilinen 11 Tud alanları içerir.

Daha önce, fonksiyonel Tud 5 HA-etiketli ifade eder ve bu nedenle, spesifik bir anti-HA antikoru çapraz bağlamadan sonra Tud kompleksi aşağı çekmek için kullanılan bir transgenik Drosophila satır elde ettik.

Protein-protein çapraz bağlar ek olarak, nükleik asit, formaldehit-protein çapraz bağlar oluşturabilir ve yonga-seq deneylerde kullanılır. Ayrıca, Drosophila, formaldehid ile çapraz bağlama, in vivo Vasa RNA helikaz protein 11 bir RNA hedefinin belirlenmesini sağladı.

Bu yazıda in vivo çapraz bağlama ve pur için bir yöntem tarif ederkenDrosophila embriyolardan protein kompleksleri ification, bu yöntem diğer organizmalar ve dokular için uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Büyük Elma Suyu-agar Plakaları hazırlanması

  1. 4 plakaları yapmak için, 1000 ml'lik bir şişeye 375 ml 2 H, O, 11.25 g uçucu agar ve bir karıştırma çubuğu ilave edin. Bu gevşek sıvı mallar için tek bir 30 dakika sterilizasyon döngüsünde şapkalı şişe kapağı Mix A. otoklav Mix A.
  2. 500 ml'lik bir behere 125 ml elma suyu, 12.5 g sofra şekeri ve bir karıştırma çubuğu ilave edin. Karışım A ve otoklavlama işlemi bitene kadar yaklaşık 70 ° C'de karıştırıldıktan ve sıcaklığı muhafaza ederken bu ısıtılmış bir platformda Mix B. ısı Mix B.
  3. Mix tamamlanmasından sonra bir otoklav, A. yavaşça kombine karışımı karıştırma devam Mix Mix B transferi ve bunun 15 dakika boyunca soğumaya bırakın. Aşırı soğutma ve bir koruyucu eklenmeden önce neden agar katılaşma kaçının.
  4. , Etanol içinde% 10 (ağırlık / hacim) metil 4-hidroksibenzoat, bir çözüm olun. Bu, koruyucu olarak hareket edecektir. Yukarıda elma suyu-agar karışımına solüsyonun 3.75 ml ilave edilir. Anothe karıştırıldıktan Ol5 dakika r.
  5. Her 300 cm 2 plastik veya köpük tabak içine koruyucu ile 125 ml elma suyu agar karışımı dökün. Bu sırada oda sıcaklığma soğumaya ve katılaşmaya olsun. Dökme sırasında, hava kabarcıkları oluşturan kaçının.
    Not: elma suyu agar plakaları hemen kullanıma hazırdır. Net sarar ile kullanılmayan tabak örtün ve bir hafta kadar 4 ° C'de saklayın.

2.. Drosophila Embriyo Toplama ve Ön çapraz bağlama tedavisi

  1. Embriyolar elde edilecek olan yaklaşık 40.000 ila 50.000 sinekler ile nüfus kafes yerleştirin.
  2. Her iki levha 12 orta standart mısır unu-melas 125 ml içeren yapın ve her plaka üzerinde kurutuldu, fırıncı mayası içinde yaklaşık 4 gr serpin. Sinekleri şişmanlatıyor 48 saat boyunca 25 ° C inkübatör nüfus kafesin içine bu tabak yerleştirin.
  3. 25 ° C sıcaklığa kadar ıstınız 2 elma suyu-agar plakaları Her biri üzerinde kurutuldu, fırıncı mayası içinde yaklaşık 1 gr serpinplakası. 0-1 hr-eski embriyoların toplamaya başlamak için nüfus kafes içinde 2 tabak yerleştirin.
  4. 1 saat koleksiyonu sonunda plakalarını çıkartın. Koleksiyonun bir tur gerekirse 2 yeni plakalar ile değiştirin.
  5. Plakaları kapak ve ince bir fırça ile hafifçe embriyolar tekrar süspansiyon yeterince su ekleyin. Paslanmaz çelik tel örgü yapılmış iki tabakalı bir elekten tekrar süspansiyon haline embriyolar dökün.
    Not: Üst tabaka embriyo ile icar ederken büyük bir böcek parçalarını toplayan orta gözenek boyutu (850 mikron) örgü yapılır. Alt tabaka maya ve su geçişine için verirken, embriyolar toplar ince örgü (75 mikron) yapılmıştır.
  6. 50 ml'lik bir tüp ve ince naylon örgü ile yapılan bir toplama sepeti içine toplanan embriyolar transfer ince boya fırça kullanın. Su ile kısaca embriyoların durulayın sonra kuruması için kağıt havlu üzerine örgü kurulayın.
  7. 3 dakika boyunca hafif bir döndürme ile% 50 çamaşır suyu embriyolar bırakın. Tam durulayınly su ile kalan çamaşır suyu çıkarmak için. Kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın.
  8. (Bu, daha uzun bir süre 30 saniye sürmemelidir) 15 saniye boyunca hafifçe çalkalanarak izopropanol veya çok embriyo kümeleri arıza kadar dechorionated embriyolar bırakın. Iyice kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın.
  9. Yeniden asılmış onları tutmak için embriyolar üzerinde heptan akışı için bir pipet kullanırken 5 dakika boyunca heptanda embriyolar daldırın. Kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın.
  10. 3 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 (PBST) içeren fosfat tamponlu salin, pH 7.4 (PBS) akışı ile embriyolar durulayın.
  11. Toplama sepeti sökün ve 10 ml PBST ihtiva eden bir 15 ml tüp örgü ile birlikte embriyolar aktarılır. Örgü kapalı embriyoların yıkamak için tüp hafifçe çevirin.
  12. Tüpten kafes çıkarın. Dikey konumda tüp koyun ve embriyolar yerçekimiyle tüpün dibine çöker sağlar.
    Not: Yaklaşık 100-300embriyoların ul bir kafesten bir 1 saat toplama beklenmektedir.
  13. PBST çıkarın ve hemen çapraz bağlama gerçekleştirmeye devam.

Toplanan Embriyolar 3.. In vivo Çapraz

  1. Kullanımdan hemen önce, PBST içinde% 0.2 'lik formaldehit hazırlayın. Embriyoların için formaldehit sabitleyici 10 ml eklenir ve 10 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde hafif bir çalkalama ile 25 ° C'de inkübe edin. Günün sonunda kullanılmayan fiksatif atın.
  2. Çapraz bağlama reaksiyonu söndürün
    1. Çapraz bağlama sonunda, embriyolar tüpün dibine çöker sağlar.
    2. Formaldehit çözeltisi çıkarın. Hemen çapraz bağlama, reaksiyonun sönmesi için PBST içinde 0.25 M glisin 10 ml ekleyin. 5 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde hafif bir çalkalama ile 25 ° C'de inkübe edin.
    3. Embriyoların tüpün dibine çöker olsun. Söndürme çözeltisi çıkarın. PBST'de 10 ml üç kez ile embriyolar yıkayın.
    4. Tamamen P çıkarınBir pipet kullanarak TSİ yıkama solüsyonu. -80 ° C'de kullanıma kadar saklayın embriyolar.

4.. Protein Numune Hazırlama ve immüno-çökeltme

  1. 2 ml lisiz tampon maddesi içinde bir Dounce homojenleştirici kullanılarak 500 ul çapraz bağlanmış homojen embriyolar (0.5 M üre,% 0.01 SDS,% 2 Triton X-100, PBS içinde 2 mM fenilmetansülfonil florit [PMSF] ve proteaz inhibitörü kokteyli).
    Not: Aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında bu ve aşağıdaki adımları uygulayın.
  2. 1.5 ml santrifüj tüplerine lizat aktarın ve yavaşça ayrıntılı lizizi sağlamak için 15 dakika için bir döner platform üzerinde sallayın. Hücre yıkıntıları pelet haline getirildi, 5 dakika boyunca 16,000 x g'de lizat santrifüj. Temiz bir 15 ml tüp içinde süpernatant kaydedin.
  3. Anti-HA agaroz boncuklar süpernatana çamur 40 ul ilave edin ve 2.5 saat süreyle dönüşlü bir platform üzerinde inkübe edilir.
  4. 5 dakika boyunca 2500 x g'de santrifüjleme ile boncuk Pelet. Süpernatantı ama beğenme bırakıntüp içinde ximately 250 ul. Geri kalan süpernatan içinde yeniden süspanse edin ve boncuklar 10 mikron gözenek filtresi ile bir 1.5 ml döndürme kolonuna transfer.
  5. 10 saniye boyunca 12,000 x g'de santrifüj spin kolon ve akış atmak.
  6. 200 ul yıkama tamponu (0.1 M glisin, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630,% 0.1 Tween-20, PBS) eklenerek ve boncukları yıkayın. 10 saniye boyunca 12,000 x g'de santrifüj ve sütun yıkama atın. Yıkandıkları iki kez daha tekrarlayın.
  7. Boncuklara 40 ul yıkama tamponu (2 mg / ml PBS içinde HA-peptid) eklenir ve yavaşça çalkalanarak her 5 dakika ile 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 10 saniye boyunca 12,000 x g'de santrifüj ve sütun elüat toplamak.
  8. Anti-HA antikoru kullanılarak western 13-blot analizi ile kompleks bir elüsyon kontrol edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Western blot ve ardından (Şekil 1 'de gösterilen)% 7 aşama jel (Şekil 2) -, çapraz bağlanma etkinliği ve çapraz bağlanmış Tud protein kompleksinin başarılı bir saflaştırma% 3 üzerinde SDS-PAGE ile analiz edildi.

% 3 kullanmanın amacı, -% 7 adım jel kompleksinin geri kalan çapraz bağlanmamış Tud protein ve konsantrasyondan Tud çapraz bağlanmış protein kompleksinin etkili ayrılmasına dayanmaktadır. Yukarıda sözü edilen in vivo eden çapraz bağlama ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Formaldehit genellikle protein-protein, protein-nükleik asit etkileşimleri belirlemek için bir çapraz bağlama maddesi olarak kullanılmaktadır. Birlikte aşağı kütle spektrometresi prosedürleri ile uyumluluğu ile iyi çözünürlük ve hücre zarı geçirgenliği, hücre içi çapraz uygulamalar 3,15-17 için formaldehit ideal bir aday ajan olun. Özel olarak, başarılı bir şekilde Vasa, Drosophila 11 önemli bir germ hücre RNA helikaz ile ilişkili mRNA tespit etmek için kullanıldı. Yakın varlarsa molekülle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz bu çalışma ile teknik yardım için Ürdün Davis, Yanyan Lin, Eric SCHADLER ve Jimiao Zheng teşekkür ederim. Bu çalışma ALA MCB-1054962 hibe NSF KARİYER tarafından desteklenen

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Drosophila agarLab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1Elma suyu plakalarının kırılgan hale gelmesine neden olacağından su ve agar karışımını uzun süre otoklavlamayın
Metil 4-hidroksibenzoatSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501Diğer adı: TEGOSEPT
Nüfus kafesiFlystuff ( http://www.flystuff.com/)59-104
İnce naylon örgüFlystuff (http://www.flystuff.com/)57-102Toplama sepetini yaparken, sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için ağı şahin tüp kapağının açıklığından biraz daha büyük kesin
Dounce homojenizatörSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETHomojenizatörü buz üzerinde soğutun ve protein bozulmasını önlemek için kullanmadan önce soğuk lizis tamponu ile önceden durulayın
Proteaz inhibitörü kokteyli Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS, konsantre proteaz inhibitörü stok çözeltisi hazırlamak için kullanılabilir
Anti-HA agaroz boncuklarıMBL uluslararası (http://www.mblintl.com/)561-8Kit ayrıca HA-peptid ve spin kolonlarını içerir
HA-peptidMBL uluslararası (http://www.mblintl.com/)561-8PBS ile 2 mg / ml'ye hazırlayın 
Spin ColumnMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Spin kolonları kitin bir parçası olarak dahil edilmiştir
IsopropanolFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)
Triton X-100Fisher Bilimsel (www.fishersci.com/‎)BP151-500
Heptan FisherBilimsel (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625Kullanmadan önce nanosaf su ile 10X'ten 1X'e seyreltin
FormaldehitFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
GlisinBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
ÜreBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0730
Fenilmetansülfonil florürSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1Gİzopropanol içinde 200 mM stok çözeltisi hazırlayın, ardından lizis tamponunda 2 mM'lik çalışma konsantrasyonuna seyreltin
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
15 ml'lik tüplerUSA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
Çamaşır suyuClorox markası%50 çamaşır suyu 50 ml'lik tüpler yapmak için eşit hacimde nanosaf su ile seyreltin
BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
Üst katman elekFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
Alt katman elekFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA
BP26324

Kaynaklar

  1. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
  2. Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
  3. Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
  4. Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
  5. Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
  6. Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
  7. Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
  8. Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
  9. Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
  10. Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
  11. Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
  12. Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  14. Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
  15. Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
  16. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
  17. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
  18. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694(2006).
  19. Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein Kompleksi zolasyonuFormaldehit apraz Ba lanmamm nopresipitasyonWestern Blot AnaliziK tle SpektrometrisiEmbriyo PermeabilizasyonuJel PurifikasyonuTudor Protein Kompleksi

İlgili makaleler