Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Özet

Hücre içi pH'ı ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur, ancak bunların çok azı sitoplazmik ve organel pH'ın aynı anda ölçülmesine izin verir. Burada, canlı hücrelerin oransal görüntülemesi ile sitoplazmik ve veziküler pH'ı aynı anda ölçmek için hızlı ve doğru bir metodolojiyi ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Özet

Hücre içi pH sıkı bir şekilde düzenlenir ve sitoplazma ile organeller arasındaki pH farklılıkları bildirilmiştir¹. Hücresel pH'ın düzenlenmesi, protein, DNA ve RNA sentezi, veziküler kaçakçılık, hücre büyümesi ve hücre bölünmesini içeren fizyolojik süreçlerin homeostatik kontrolü için çok önemlidir. Hücresel pH homeostazındaki değişiklikler, zararlı fonksiyonel değişikliklere yol açabilir ve çeşitli hastalıkların ilerlemesini teşvik edebilir². Hücre içi pH'ı ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur, ancak bunların çok azı sitoplazmada ve organellerde pH'ın aynı anda ölçülmesine izin verir. Burada, canlı hücreler üzerinde konfokal mikroskopi kullanarak sitoplazmik ve organel pH'ın aynı anda ölçümü için hızlı ve doğru bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklıyoruz³. Bu amaca, seçici hücresel bölme bölümlemesine sahip iki pH algılama oranlı boyanın kullanılmasıyla ulaşılır. Örneğin, SNARF-1 sitoplazma içinde bölümlere ayrılırken, HPTS endozomal / lizozomal organeller içinde bölümlere ayrılır. HPTS yaygın olarak bir sitoplazmik pH indikatörü olarak kullanılmasına rağmen, bu boya, pinositoz^3,4 tarafından alındıktan sonra endozomal-lizozomal yol boyunca vezikülleri spesifik olarak etiketleyebilir. Bu pH algılama problarını kullanarak, endositik ve sitoplazmik bölmeler içinde pH'ı aynı anda ölçmek mümkündür. HPTS'nin optimal uyarma dalga boyu pH'a bağlı olarak değişirken, SNARF-1 için değişen optimal emisyon dalga boyudur. SNARF-1 ve HPTS ile yüklemenin ardından hücreler, her prob için bir pH standart eğrisi oluşturmak üzere pH kalibre edilmiş farklı solüsyonlarda kültürlenir. Konfokal mikroskopi ile hücre görüntüleme, artefaktların ve arka plan gürültüsünün ortadan kaldırılmasına izin verir. HPTS'nin spektral özellikleri nedeniyle, bu prob hafif asidik endozomal bölmenin ölçümü veya endozomal / lizozomal organellerin alkalinizasyonunu göstermek için daha uygundur. Bu yöntem, veri analizini basitleştirir, pH ölçümlerinin doğruluğunu artırır ve hücrelerin dış zorluklara verdiği yanıtlar sırasında pH modülasyonu ile ilgili temel soruları ele almak için kullanılabilir.

Protokol

Hücresel pH Kalibrasyon Çözümleri 1. Hazırlanması

1. Kalibrasyon için kullanılmak üzere 5 çözümler hazırlamak için beş ayrı 50 ml konik tüplere aşağıdaki bileşikler ekleyin:
   • NaCl (1 M NaCl 1 mi) (1 M NaCl, 10 ml H = ₂ 0 içinde 0.58 g)
   • KCl (6.75 1 M KCI mi) (1 M KCl, 10 ml H ₂ 0 içinde 0.75 g =)
   • Glikoz (1 M D-Glikoz 1 mi) (1 M D-Glucose = H 10 ml 1.80 g ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0.05 1 M MgSO ₄ ml) (1 M, 10 ml MgSO H ₂ 0 içinde ₄ = 1.20 g)
   • 20 mM HEPES (1 M HEPES 1 mi) (10 mi H ₂ 0 içinde 1 M HEPES = 2.38 g)
   • _CaCl2 (1 M _CaCI2 ve 0.05 mi) (10 mi H 1 M _CaCl2 = 1.47 g ₂ 0)
     Çift distile H ₂ O (GKD ₂ O) tüm çözümler hazırlayın.
2. GKD ₂ O 35 ml solüsyonu ile, her tamamlamak ve böylece kadar bir manyetik karıştırıcı ile karıştırındevrim sisi elde edilir.
3. 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ve 7.5 pH değeri elde etmek üzere 1 N KOH ya da 1 N HCI ile, her çözeltinin pH'ı ayarlayın. Daha sonra, 50 ml lik bir son hacme kadar deiyonize su ile hacim ayarlayın.
4. Tedbir 5 nigerisin mg ve stok çözeltisi nigericin 10 mm hazırlamak için mutlak EtOH 670 ul ekleyin.
   Dikkat: nigericin son derece toksik ve büyük bir dikkatle (eldiven, gözlük ve maske) ile ele alınması gerekir. Nigericin tamamen eriyene kadar inversiyon yolu ile çözüm karıştırın.
5. Her bir ayar çözeltiye 10 mM nigerisin (nihai konsantrasyon 10 uM) ve 0.05 ml ilave edilir. Nigericin hücre zar geçirgenliğini artırır ve hücre dışı K ⁺ kutuplaşma giderici bir konsantrasyonunun mevcudiyetinde hücre-içi ve hücre dışı pH'ın dengede neden olan bir iyonofor olduğunu.
6. Kalibrasyon çözümleri 4 ° C'de 1 ay kadar saklanabilir

2.. Hücre Hazırlanması

1. Biyolojik bir Safet altında35 mm y kapağı, tohum hücreleri x 10 mm kültür tabakları,% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotikler ile desteklenmiş büyüme ortamı içinde 2 ml. 24 saat sonra yaklaşık olarak% 50 izdiham sağlamak için gerekli hücre miktarı kullanın.
   Not: Deneylerde, biz HT-1080 hücre çizgisi ve plaka kültür kabı başına 1 x 10 ⁵ hücre kullanın.
2. Kalibrasyon için kullanılacak deney ve plaka 5 ek kültür tabakları için gereken kültür kaplarına sayısını belirler.
3. En az 24 saat boyunca 37 ° C /% 5 _CO2 inkübatörü içinde yer kültür tabakları.

PH-algılama Sondalar 3. Hazırlanması

1. GKD ₂ 0 floresan prob pH 8-hydroxypyrene-1 ,3,6-trisülfonik asit, trisodyum tuzu (HPTS / pyranine) bir 1 M stok çözelti hazırlayın. Bu çözelti, oda sıcaklığında saklanan ve ışıktan korunmalıdır.
2. Thereâ adlandırılan (and-6)-karboksil seminaphthorhodafluor asetoksimetil ester asetat (C-SNARF-01:00 - 1 mM 5 'lik bir stok çözelti hazırlayınfter SNARF-1) DMSO 1.76 ml Snarf-1, 1 mg çözülmesiyle. Iyice tekrarlanan pipetleme karıştırın. SNARF-1 çözeltisi, -20 ° C'de saklanan ve ışıktan korunmalıdır.

4. Hücre Etiketleme

1. Onaltı saat canlı hücre görüntüleme önce, tam ortam 2 ml içeren her kültür tabağına 1M HPTS stok solüsyonu 2 ul (nihai konsantrasyon 1 mM) ekleyin.
2. Inkübatör kültür yemekleri dönün. HPTS prob nedenle etiket prob pinositoza tarafından alınmalıdır organeller, hücre-laktobionat olduğunu. Bu durum HPTS hücre inkübasyonlar serum-takviyeli kültür ortamında gerçekleştirilir gerektirir.
3. HPTS ile inkübasyondan sonra, steril PBS ile iki kez Hücreleri yıkamak ve en az 2 saat boyunca serumsuz ortamda 2 ml ekleyin. SNARF-1 ile inkübasyon serum prob ortaya çıkmasını önlemek, çünkü serum içermeyen ortam içinde yapılması gerekmektedir.
4. AF elde etmek üzere bir 1 mM SNARF-1 ihtiyat çözeltisinden 10 ul ekleinal 5 uM arasında konsantrasyon ve hücreler loş ışık altında, 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübasyona izin verin. C-SNARF-1 konsantrasyon ve kuluçkalama süresi, hücre tipine bağlı olarak değişebilir.
5. İnkübasyonun sonunda, steril PBS içerisinde iki kez yıkama ve hücreler serum içermeyen ortam 2 ml ekleyin.

PH Modülatörler 5. Ilavesi

1. Yöntem hücrelerde pH değişiklikleri tespit edebilir olup olmadığını değerlendirmek için, hücre içi pH'ın modüle farklı reaktif de kullanılabilir:
   • Bafilomisin A1, V-ATPaz ⁵ spesifik bir önleyicisi
   • Na ⁺ / H ⁺ değiştirici izoformu 1 (NHE-1) ⁶
   • _NH4CI, hücre içi pH ⁷ arttıran bir zayıf baz
   1. Yukarıda bahsedilen reaktiflerin stok çözelti hazırlayın:
      • Bafilomisin A1: 100 uM'lik bir stok çözeltisi elde etmek üzere, DMSO ile 160 ul bafilomycin A1 10 ug eklemek
      • EIPA: obtai metanolün 1.67 ml EIPA 25 mg eklemek50 mM'lik nihai konsantrasyon na
      • _NH4CI: 1 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere GKD ₂ O 10 ml amonyum klorürün 0.53 g çözülür.
      
      Not: Tüm stok solüsyonları -20 ° C sıcaklıkta saklanan ve ışıktan korunmalıdır bafilomycin A1 dışında 4 ° C'de tutulmalıdır.
   2. Ayrı bir kültür tabaklarında, aşağıda tarif edildiği gibi reaktifler ekleyin:
      • 100 uM bafilomycin A1 2 ul (son konsantrasyon 100 nM)
      • 50 mM EIPA 1 ul (nihai konsantrasyon 25 uM)
      • 1 M _NH4CI (nihai konsantrasyon 20 mM), 40 ul
   3. 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe hücreleri
2. Görüntü alma geçin.

6.. Canlı hücre Görüntüleme Mikroskop Özellikleri ve Toplama Ayarlar

1. Kullanarak canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek 40X objektif bir spektral ters tarama konfokal microsco üzerine montepe motorize XY aşamada, çevre kontrollü (sıcaklık, nem, CO ₂₎ evre inkübatör cam alt kültür yemekleri barındıran bir bölme ile donatılmıştır.
2. Burada kullanılan konfokal alet (Olympus FV1000) ile donatılmıştır:
   • Bir diyot lazer 405 nm
   • A 40 mW argon lazer (458 nm, 488 nm, 515 nm)
   • Bir helyum neon lazer (543 nm)
   • Florit 10X objektif, NA0.4
   • Bir LUCPLFLN 40X objektif, NA0.60
   • Bir PLAPONSC PLANI APO 60X yağ objektif, NA1.4
   • Dikroik ayna DM 405/458/488/543
   • Bir SDM 560 ve SDM 640 dikroik filtreleri
   • A BA655-755 bariyer filtre
   • Bir ışın ayırıcı BS20/80
   • Görüntü elde etme ve analiz için veri analizi yazılımı,
3. Sahne inkübatör 37 ° C'ye kadar ısıtılır ve mikroskop kurulduktan sonra, önce konfokal sahne görüntüleme odasına HPTS ve Snarf-1 ile inkübe bir kültür çanak yerleştirin.
4. Ailgi alanı bulma ürkiye'de, yazılım satın alma ayarları Şekil 1 ayarlayın.
   • İki sanal kanal set kurmak.
   • 525 nm ve 570 nm 543 ve emisyon toplama SNARF-1 uyarım - - 600 nm 505 405 nm ve emisyon toplama HPTS uyarma karşılık ilk aşamasını başlatın.
   • 525 nm ve 640 de 543 nm ve emisyon toplama SNARF-1 uyarım - - 650 nm 505 458 nm ve emisyon toplama HPTS uyarma karşılık ikinci aşamasına.
   • Konfokal açıklık varsayılan olarak 175 um ayarlanır ve optimal diyafram elle 300 mikron ayarlanmış olması gerekiyor.
   • 0,4 mikron kalınlığında seri yatay optik bölümleri (800 x 800 piksel) istifleme Resmi atın.

NOT: 40X objektif aynı anda birkaç hücreleri gözlemlemek için yararlıdır ve organel görüntüleme için iyi çalışır. Ancak, uzaysal çözünürlüğü ve sinyal yoğunluğu Bette vardırR, bir 60X objektif kullanılarak yağ elde. Buna ek olarak, iki boyalar arasında bir uyarım veya emisyon cross-talk bulunmaktadır.

PH-algılama Problar 7. Kalibrasyon

1. Kalibrasyon önce, daha önce HPTS ve Snarf-1 ile inkübe kültür çanak orta kaldırmak steril PBS ile iki kez yıkama ve daha sonra, beş kalibrasyon çözümlerden biri 2 ml ekleyin.
2. Konfokal aşama odasına kültür tabağına yerleştirin.
3. Aşağıdaki ayarlara göre zaman atlamalı görüntü elde geçin:
   1. Deney için görüntülerin ve aralık süresi sayısını ayarlayın.
      NOT: tipik olarak 30 dakika ila görüntüleri arasında, 1 dakika süre aralığı kullanınız.
   2. Her görüntünün edinimi arasındaki kapatmak için deklanşörü programlayın.
4. Bir elektronik tablo yazılımı dakika başına floresan yoğunluğunu kaydedin ve floresan yoğunluğu sabit olduğu zaman belirler. 20 dk - Hücre içi pH 15 sonra genellikle kararlı.
5. REPEAT kalan her kalibrasyon çözümü için yeni bir kültür çanak kullanarak 7,1-7,4 adımları.

8. Veri Toplama

1. Kalibrasyon yapıldıktan sonra, alan başına 15-20 hücreleri içeren 4-5 rastgele seçtikleri alanlarda örnek verileri kazanır. İki görüntüleri her alan için elde edilir: HPTS etiketleme (kesecikler) ve SNARF-1 etiketleme (Sitosol) için saniye biri.
2. Eşiğe (hücre dışı bir bölge) dijital hem de sondaların floresan görüntülerden çıkarılır. Ilgili saklanan görüntülerden Etiketli veziküller ve sitosol bir ikili maske kullanılarak seçilir. Her pH-algılama probu için, floresan yoğunlukları sayısal bir ölçek (0-4,095 gri seviye ölçeği) ölçülür. Organel ya da sitoplazmada tüm pikseller için bir ortalama yoğunluğu hesaplanır ve değerler floresan oranlarının hesaplanması için kullanılmaktadır.

9. Veri Analizi

1. Çeşitli yazılım paketleri veri analizi için piyasada mevcuttur. YaniFluoview Yazılım.
2. Aşağıdaki gibi, bir tablo, kayıt değerleri içinde ve floresan oranları hesaplanır: HPTS durumunda, R = (F _{458 nm} / F _{405 nm),} ve SNARF-1, R = (F _{644 nm} / F _{584 nm} durumunda .)
3. Böyle GraphPadPrizmasındaki gibi bilimsel grafik yazılımı kullanarak veri çiziniz. Plot pH (X ekseni) bir fonksiyonu olarak floresans oranı (Y-ekseni) tasvir gerekir. Eğri uydurma, lineer olmayan regresyon kullanılarak elde edilir.
4. Adım 8.2 'de tarif edildiği gibi örneklerin floresan şiddetlerini toplamak ve floresan oranları hesaplar. PH değerleri içine oranlarını dönüştürmek için kalibrasyon eğrileri kullanın.

Sonuçlar

Hücre içi ve endozomal / lızozomal hücre bölmelerine hem de pH değerinin ölçümü için aynı anda, rasyometrik floresan pH algılama Snarf-1 problar ve HPTS kullanılmıştır. HPTS endozomal / lizozom oran ölçer pH'ı ölçümünü sağlar, oysa SNARF-1 sitosolik bölmesi ile sınırlandırılmıştır. 16 saat HPTS ile hücre yükleme endozomlar / lizozomlarında ⁴ seçici yerelleştirme sağlar. PH algılama probları ile yüklü HT-1080 hücreleri kaydedilen floresans tipik bir örneği, Şekil 2A'da gösterilmiştir. ...

Tartışma

Farklı hücre bölümlerinde canlı hücre görüntüleme Sayısal pH ölçümü doğru dış zorluklara hücre yanıtlarında pH değişimleri ölçmek için gereklidir. Bununla birlikte, hala önemli engellerden biri kolayca ve özel hücre bölmeleri hedef etmektir. Bu bağlamda, bir kaç çalışmada, elektroporasyon ya da mikroenjeksiyon ile ^8-10 hücrelere katılan bir hücre içi pH göstergesi olarak HPTS kullanımını sermiştir. Bu teknikler yani elektro hücrelere geniş zararlara yol açar, ve mikroenjeksiyon özel ekipman ve teknik beceri g...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kalibrasyon
Sodyum klorür	Fischer	L-11621
Potasyum klorür	Fischer	M-12445
D-Glikoz (dekstroz)	Fischer	D16-1
Magnezyum sülfat	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Kalsiyum klorür dihidrat	Fischer	M-1612
Deiyonize su	N/A	N/A
Nigericin	Calbiochem	481990	Solunduğunda veya cilt ile temas ettiğinde toksik
4 ° C'de ışıktan koruyun; C
Kültür kapları ve boş; 35mm	BD Biosciences	354456
pH algılama probları
8-Hidroksipiren-1,3,6-trisülfonik asit (HPTS)	Yaşam teknolojileri	H-348	Oda sıcaklığında ışıktan uzak tutun
5- (ve-6) -Karboksi SNARF®-1, Asetoksimetil Ester, Asetat	Yaşam teknolojileri	C-1271	-20 ° C'de ışıktan ve nemden uzak tutun; C
Dimetil Sufoksit (DMSO)	Fischer	BP231-1 & nbsp;	zararlı
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 100X
Potasyum klorür	Fischer	M-12445	20 g
Sodyum fosfat monobazik	Fischer	S369-1	115 g
Potasyum fosfat monobazik	J.T Baker	3246-01	20 g
Deiyonize su	N/A	N/A	1 L
Otoklava getirin ve pH'ı 7.4'e	ayarlayın
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Sodyum klorür	Fischer	L-11621	40,5 g
Deoinize su	N/A	N/A	5 L
pH modülatörlerine
Bafilomisin A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5- (Etil-N-izopropil) amilorid (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Amonyum klorür	Fischer	A649-500

çözeltileri getirin