Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Özet

Hücre içi pH'ı ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur, ancak bunların çok azı sitoplazmik ve organel pH'ın aynı anda ölçülmesine izin verir. Burada, canlı hücrelerin oransal görüntülemesi ile sitoplazmik ve veziküler pH'ı aynı anda ölçmek için hızlı ve doğru bir metodolojiyi ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Özet

Hücre içi pH sıkı bir şekilde düzenlenir ve sitoplazma ile organeller arasındaki pH farklılıkları bildirilmiştir¹. Hücresel pH'ın düzenlenmesi, protein, DNA ve RNA sentezi, veziküler kaçakçılık, hücre büyümesi ve hücre bölünmesini içeren fizyolojik süreçlerin homeostatik kontrolü için çok önemlidir. Hücresel pH homeostazındaki değişiklikler, zararlı fonksiyonel değişikliklere yol açabilir ve çeşitli hastalıkların ilerlemesini teşvik edebilir². Hücre içi pH'ı ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur, ancak bunların çok azı sitoplazmada ve organellerde pH'ın aynı anda ölçülmesine izin verir. Burada, canlı hücreler üzerinde konfokal mikroskopi kullanarak sitoplazmik ve organel pH'ın aynı anda ölçümü için hızlı ve doğru bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklıyoruz³. Bu amaca, seçici hücresel bölme bölümlemesine sahip iki pH algılama oranlı boyanın kullanılmasıyla ulaşılır. Örneğin, SNARF-1 sitoplazma içinde bölümlere ayrılırken, HPTS endozomal / lizozomal organeller içinde bölümlere ayrılır. HPTS yaygın olarak bir sitoplazmik pH indikatörü olarak kullanılmasına rağmen, bu boya, pinositoz^3,4 tarafından alındıktan sonra endozomal-lizozomal yol boyunca vezikülleri spesifik olarak etiketleyebilir. Bu pH algılama problarını kullanarak, endositik ve sitoplazmik bölmeler içinde pH'ı aynı anda ölçmek mümkündür. HPTS'nin optimal uyarma dalga boyu pH'a bağlı olarak değişirken, SNARF-1 için değişen optimal emisyon dalga boyudur. SNARF-1 ve HPTS ile yüklemenin ardından hücreler, her prob için bir pH standart eğrisi oluşturmak üzere pH kalibre edilmiş farklı solüsyonlarda kültürlenir. Konfokal mikroskopi ile hücre görüntüleme, artefaktların ve arka plan gürültüsünün ortadan kaldırılmasına izin verir. HPTS'nin spektral özellikleri nedeniyle, bu prob hafif asidik endozomal bölmenin ölçümü veya endozomal / lizozomal organellerin alkalinizasyonunu göstermek için daha uygundur. Bu yöntem, veri analizini basitleştirir, pH ölçümlerinin doğruluğunu artırır ve hücrelerin dış zorluklara verdiği yanıtlar sırasında pH modülasyonu ile ilgili temel soruları ele almak için kullanılabilir.

Protokol

Hücresel pH Kalibrasyon Çözümleri 1. Hazırlanması

1. Kalibrasyon için kullanılmak üzere 5 çözümler hazırlamak için beş ayrı 50 ml konik tüplere aşağıdaki bileşikler ekleyin:
   • NaCl (1 M NaCl 1 mi) (1 M NaCl, 10 ml H = ₂ 0 içinde 0.58 g)
   • KCl (6.75 1 M KCI mi) (1 M KCl, 10 ml H ₂ 0 içinde 0.75 g =)
   • Glikoz (1 M D-Glikoz 1 mi) (1 M D-Glucose = H 10 ml 1.80 g ₂ 0)
   • MgS0 ₄ (0.05 1 M MgSO ₄ ml) (1 M, 10 ml MgSO H ₂ 0 içinde ₄ = 1.20 g)
   • 20 mM HEPES (1 M HEPES 1 mi) (10 mi H ₂ 0 içinde 1 M HEPES = 2.38 g)

Sonuçlar

Hücre içi ve endozomal / lızozomal hücre bölmelerine hem de pH değerinin ölçümü için aynı anda, rasyometrik floresan pH algılama Snarf-1 problar ve HPTS kullanılmıştır. HPTS endozomal / lizozom oran ölçer pH'ı ölçümünü sağlar, oysa SNARF-1 sitosolik bölmesi ile sınırlandırılmıştır. 16 saat HPTS ile hücre yükleme endozomlar / lizozomlarında ⁴ seçici yerelleştirme sağlar. PH algılama probları ile yüklü HT-1080 hücreleri kaydedilen floresans tipik bir örneği, Şekil 2A'da gösterilmiştir. .......

Tartışma

Farklı hücre bölümlerinde canlı hücre görüntüleme Sayısal pH ölçümü doğru dış zorluklara hücre yanıtlarında pH değişimleri ölçmek için gereklidir. Bununla birlikte, hala önemli engellerden biri kolayca ve özel hücre bölmeleri hedef etmektir. Bu bağlamda, bir kaç çalışmada, elektroporasyon ya da mikroenjeksiyon ile ^8-10 hücrelere katılan bir hücre içi pH göstergesi olarak HPTS kullanımını sermiştir. Bu teknikler yani elektro hücrelere geniş zararlara yol açar, ve mikroenjeksiyon özel ekipman ve teknik beceri g.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kalibrasyon
Sodyum klorür	Fischer	L-11621
Potasyum klorür	Fischer	M-12445
D-Glikoz (dekstroz)	Fischer	D16-1
Magnezyum sülfat	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Kalsiyum klorür dihidrat	Fischer	M-1612
Deiyonize su	N/A	N/A
Nigericin	Calbiochem	481990	Solunduğunda veya cilt ile temas ettiğinde toksik
4 ° C'de ışıktan koruyun; C
Kültür kapları ve boş; 35mm	BD Biosciences	354456
pH algılama probları
8-Hidroksipiren-1,3,6-trisülfonik asit (HPTS)	Yaşam teknolojileri	H-348	Oda sıcaklığında ışıktan uzak tutun
5- (ve-6) -Karboksi SNARF®-1, Asetoksimetil Ester, Asetat	Yaşam teknolojileri	C-1271	-20 ° C'de ışıktan ve nemden uzak tutun; C
Dimetil Sufoksit (DMSO)	Fischer	BP231-1 & nbsp;	zararlı
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 100X
Potasyum klorür	Fischer	M-12445	20 g
Sodyum fosfat monobazik	Fischer	S369-1	115 g
Potasyum fosfat monobazik	J.T Baker	3246-01	20 g
Deiyonize su	N/A	N/A	1 L
Otoklava getirin ve pH'ı 7.4'e	ayarlayın
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
Sodyum klorür	Fischer	L-11621	40,5 g
Deoinize su	N/A	N/A	5 L
pH modülatörlerine
Bafilomisin A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5- (Etil-N-izopropil) amilorid (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Amonyum klorür	Fischer	A649-500

çözeltileri getirin