Yöntem makalesi

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

20.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51400

⸱

9 Nisan 2014

 , 
1HIV Drug Resistance Program, National Cancer Institute

Bu makalede

Özet

Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri.

Özet

Anti-HIV ilaçlarının bir dizi kabul edilmiş olmasına rağmen, toksisite ve ilaç direnci ile ilgili sorunlar hala mevcuttur. Bu, en az toksisite ile ortak bir ilaç dirençli HIV-1 suşları ile enfeksiyonu önleyebilen yeni bileşiklerin belirlenmesi için bir ihtiyaç gösterir. Burada, hızlı hücre sitotoksisitesinin ve WT ve mutant virüs suşlarına karşı bir bileşiğin etkinliğinin belirlenmesi için kullanılabilecek etkili bir deneyi tarif eder.

Arzu edilen hedef hücre hattı, 96 oyuklu bir plaka içerisinde tohumlanmıştır ve 24 saatlik bir inkübasyondan sonra, test edilecek bileşiklerin seri seyreltileri ilave edilir. Daha başka manipülasyonlar hücresel sitotoksisite deneyleri için gerekli olan; anti HIV lusiferaz hücrelere ilave edilir eksprese eden bir WT veya ilaç dirençli HIV-1 vektörü ya da bir önceden belirlenmiş miktarda deneyleri. Sitotoksisite, bir ATP bağımlı parlaklık deneyi ve enfeksiyon üzerinde bileşiklerin etkisini kullanarak ölçülür lucife miktarının belirlenmesi ile ölçülürvarlığında ya da varsayılan inhibitör yokluğunda rase.

Bu tarama deneyinde tamamlamak için 4 gün sürer ve çok sayıda bileşiğin paralel olarak taranabilir. Bileşikler üç kez taranır ve veri hedef bileşiklerin yokluğunda enfekte / ATP seviyeleri normalleştirilir. Bu teknik potansiyel anti HIV bileşiklerin etkinliği ve toksisite hızlı ve doğru ölçüm sağlar.

Giriş

HIV-1 viral yaşam döngüsündeki çeşitli temel adımları hedefleyen ilaçların durumuna çok HIV-1 enfeksiyonlarının tedavisi ve uzun vadeli hayatta kalma geliştirdi kombine ilaç tedavisi (yüksek oranda aktif bir anti retroviral terapi olarak adlandırılan veya HAART) yol açmıştır Hastaların. Tipik olarak iki, nükleosid ters transkriptaz (RT) inhibitörü ve bir proteaz inhibitörü ya da bir nükleosid olmayan bir RT inhibitörü kombinasyonlarını kullanan HAART, şimdi bir yaşam boyu durum 1-5 içine ölümcül bir hastalık dönüştürülmüş bulunmaktadır. Ancak, viral replikasyonunun zaman içinde tutulan bastırılmasına içinde HAART çok başarılara rağmen, bu sınırlamaları vardır. HAART'a HIV ortadan kaldırmak değildir, bu nedenle hastalar tedavi edilmez ve tedavi hayat uzun. Ilaç toksisitesi ve ilaca dirençli suşların ortaya çıkması ile sorunlar vardır. Direnç HIV integrazın (IN) hedef yeni onaylanan ilaçlar dahil onaylı anti HIV ilaçları, tüm ortaya çıkabilir. İlaç direnci muhtemelen beca doğarViral replikasyon (3 x 10 -5 mutasyonlar / baz / çoğaltma döngüsü hata oranı) sırasında meydana gelen spontan mutasyon kullanım 6. Mutasyonlar anti-retroviral ilaç hedefleri kodlayan genlerde ortaya çıkar, bu mutasyonların küçük alt ilaçlara viral suşun duyarlılığında bir azalmaya yol açacaktır. Ilaç direncinin geliştirilmesini önlemek için, bir ilaç konsantrasyonu tam olarak HIV çoğalmasını önlemek seviyede muhafaza edilmelidir. Tedavi rejimine kötü bağlılık sorunu şiddetlendirir, ve direnç 7-9 hızlı gelişimine yol açabilir. İlaç konsantrasyonları farklı emilim, metabolizma, dağıtım, ve boşaltım seviyelere hastalarda değişebilir olmasına rağmen, yüksek ilaç konsantrasyonları toksisite 10 yol açabilir. Tedavi hastanın yaşam boyunca devam yana, anti-retroviraller uzun süreli toksisite konusunda ciddi güvenlik endişeleri vardır. HAART yaygın kullanılan anti-retroviraller olumsuz etkilere sahip olabilir and yan etkileri yaşamı tehdit 11-15 oylandı olaylar olmuştur. Hastalar direnci ve toksisite gelişimi ile karşılaşma sorunları etkili bir şekilde çok az veya hiç toksisite ile uzun süreli virüsün ortak ilaca dirençli türlerinin çoğalmasını bloke yeni ilaçlar geliştirmek için ihtiyaç altında yer alır.

Bu nedenle, hızlı bir şekilde, viral yaşam çevriminde temel adımları bloke bileşiklerin taranması için bir analiz için bir ihtiyaç vardır. Burada bir bileşikler ve hızlı ve verimli bir şekilde WT ve ilaca dirençli HIV türlerinin her ikisinin replikasyonunu bloke etme kabiliyetleri sitotoksisitesini değerlendirmek için kullanılabilecek etkili bir tahlili tarif eder. Kullandığımız deney hasta 16-18 izole virüs ilaç direnci taranması için geliştirilmiş bir deneyde benzer.

Deney HIV ters transkripsiyon engelleyebilir bileşikler için ekrana değişiklik olmadan da kullanılabilir olsa da, descri doyurmayaibe inhibitörleri IN değerlendirmek için tahlil kullanılarak. IN hücresel genom içine 19 ekler viral DNA, bir viral temel bir enzimdir. Inhibitörleri umut verici bir dizi geliştirilmektedir da, bazıları halen, sadece Isentress 20, 21 (aynı zamanda Raltegravir veya RAL olarak da bilinir), klinik denemeler sürmektedir ve son zamanlarda, Elvitegravir (EVG) 22 ve Dolutegravir (DTG) 23 olmuştur FDA tarafından onaylanmıştır. Bu bileşikler, HIV Yatak ve hücre kültüründe non-B alt tipleri hem karşı ve hastaların 24, 25 aktiftirler. Bununla birlikte, RAL ile tedavi Y143R, N155H ve G140S/Q148H 24, 26-31 de dahil olmak üzere mutantlan, IN ilaca dirençli HIV-1 için seçer. N155H ve G140S/Q148H ayrıca bu direnç mutasyonlarına karşı etkili olan iplikçik transfer inhibitörleri (INSTIs) IN ikinci nesil tasarım ve geliştirilmesi gereğini vurguluyor EVG etkinliğini azaltmak.

Protokol

Usta Hisse 1. Hazırlanması

  1. DMSO içinde test edilecek olan bileşiklerin ana stokları olun. 20 mM'lik bir konsantrasyonda standart stokları hazırlayın.
    Not: 10 mM üzerinde herhangi bir konsantrasyonu kullanılabilir. Bu analizi doğrulamak için pozitif kontrol olarak kullanılabilir bileşikler RAL, EVG ve DTG içerir.
  2. Emin bileşikler 15 saniye için çözümler birden çok kez vorteks ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek DMSO içinde çözündürülür. Kullanılana kadar -20 ° C'de karanlıkta, 20 mM stok çözelti saklayın.

Bileşik elemesi için 96 oyuklu plakalar, 2. Hazırlanması

  1. Test edilecek olan hücre hattı (örneğin, HOS veya TZM-bl) seçin ve (ortam içinde (4000 hücre / göz) 4 x 10 4 hücre / ml bir yoğunlukta bu hücrelerin 100 ul tohum örneğin Dulbecco tadil edilmiş Eagle ya da DMEM ortamı % 5 (v / v) fetal sığır serumu,% 5 yeni doğmuş buzağı serumu ve penisilin (50 birim / ml) ile takviye edilmiş artı streptomycin).

Virüs Hisse 3. Nesil

32-34 (Şekil 1, aşama 1 'de gösterildiği gibi), 293 hücrelerinin transfekte edilmesiyle VSV-g-psödotipli HIV üretir.

  1. , Transfeksiyondan önce günde, 1.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda olacak şekilde 100 mm'lik çapı olan kaplara 293 hücreleri üzerinde plaka.
  2. , Kalsiyum fosfat yöntemi kullanılarak 35 ve 4 VSV (pHCMV-g) ug - transfeksiyon gününde, 16 vahşi tipli ya da mutant HIV (ΔLUC pNLNgoMIVR) içinde 293 ug hücreleri transfekte.
  3. Kalsiyum fosfat çökelti, yaklaşık 6 saat sonra, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez yıkama ve 293 hücreleri 48 saat süreyle taze ortam ile inkübe ilave edilir. [DMEM% 5 (v / v) fetal bovin serumu,% 5 yeni doğmuş buzağı serumu ve penisilin (50 birim / ml) artı streptomisin (50 ug / ml) ile takviye edilmiş].
  4. 100 mm çapında olan ortam kaldırarak supernatantları içeren virüs hasatyemekler, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Turbo DNase ile süpernatantlar tedavi, bir 45 mikron gözenek boyutunda bir şırınga filtreden geçirilerek filtre üst fazlar, 10 dakika için 3000 rpm'de düşük hızlı santrifüjleme ile süpernatantlar açıklık ve enfeksiyon deneylerinde hazırlanması için ortam içinde süpernatantlar seyreltik . -80 ° C'de, alikolar içinde dondurulmuş viral süpernatantlar saklayın
    Not: süpernatan içinde p24 miktarı, bir HIV-1 p24 enzim-bağlı immünsorbent deney paketi kullanarak belirlenir. P24 konsantrasyonu numunedeki virüs miktarını kontrol etmek için kullanılır. Virüs yaklaşık 500 ng enfeksiyon öncesi günde 1.5 x 10 5 hücre / tabak yoğunluğunda 60 mm'lik çapı olan kaplara üzerine kaplanmıştır HOS hücrelere ilave edilir. Inkübasyon 48 saat sonra, hücreler hasat edilir santrifüj ile toplandı, yıkandı ve 100 ul PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. Lüminesans raportör gen deneyi reajanı eşit miktarda ekleyin ve bölümler 5.4.1 'de tarif edildiği gibi lusiferaz etkinliğini ölçmek ve5.4.2. Adım 4.6 'da ele alındığı gibi, bu kaynaktan, virüsün uygun bir seyreltme yapılabilir.

4.. 96 oyuklu plakalar içerisinde bileşik Tarama

, Üç kopya halinde her bir bileşik taraması ve sonuçları ortalama.

Not: viral replikasyonu üzerindeki her bir bileşiğin etkisi, herhangi bir bileşik olmadan elde edilen replikasyon düzeyine normalize tarafından düzeltilir.

  1. Taranması için deneysel konsantrasyon aralığını belirler.
    Not: Genellikle, 11 seri seyreltme ile ekranlar kolon ve bunu 7 seri seyreltme ile ekranlar ile plaka kolona bileşiğin eklenmesi ile yapılır satıra göre olan bileşiğin eklenmesi suretiyle yapılır. Kuyuların set biri üçlü bileşik yok kontrolü için ayrılmış olmalıdır. Buna ek olarak, tek bir sütun ya da bir satır negatif / arka plan kontrolü olarak hareket için boş olması gerekir. Virüs ilave edilmiş ise Son olarak, bu hücresel sitotoksisite tahlili ya da enfekte olup olmadığını belirleyecektir.
  2. Hazırlamak20 mM stok çözeltisinden seri seyreltileri. (Tablo 1 'de gösterildiği gibi) konsantrasyonları, test edilecek konsantrasyonları ampirik bir biçimde tespit aralığına bağlı olarak seçilir. Nihai konsantrasyon 100 uM olacak, yani eğer, bir 1 mM çalışma stok yapmak, 10x istenen nihai konsantrasyon ortam içinde seyreltim dizileri hazırla.
    Not: 50 s 5-10 mm yukarıda IC ile bileşikleri ilaç geliştirilmesi için genellikle iyi bir aday değildir. İlk deneylerde sadece WT vektör karşı bileşikleri test edin. Etkin bir şekilde inhibe eden vektör WT gelecek vaat eden bileşikler, daha sonra, ilaç dirençli mutantların bir paneline karşı test edilir.
  3. (Şekil 1, aşama 2'de gösterildiği gibi) inkübatör 96 oyuklu plakalar çıkarın ve üç kopya halinde oyuklara test edilecek bileşiklerin seri dilüsyonları ekleyin.
    Not: oyuğuna ilave hacmi nihai konsantrasyonu 1/10 hacim olmalıdır. Sonuç olarak, 22 ul / oyuk (nihai hacim s eklemekost virüs enfekte ek tahliller için 220 ul) 'dir. Sitotoksisite analizi için, 11 ul / oyuk (son hacim 110 ul / oyuk olan) ekleyin.
  4. Inkübatör 96 oyuklu plakalar döndürür. Hücresel sitotoksisite ekran için, 37 ° C'de 96 oyuklu plakalar, 48 saat inkübe edilir ve başka bir manipülasyon Protokolü 4 ihtiyaç vardır: Protokol 5'e geçin enfekte tahlilleri için, Protokol 4 talimatları takip etmektedir..
  5. Enfekte edebilirlik analizleri, sadece. Analiz edilecek bileşikler ile 37 ° C 'de 3 saat inkübasyondan sonra, en az bir inkübatör plakaları çıkarın.
    Not: Bu bileşik, HIV vektör ile enfeksiyon öncesinde hücreler tarafından alınmasını sağlar.
  6. Virüsün 33 'lik bir stok seyreltme hazırlayın, 34 (genellikle yaklaşık 01:03) muamele edilmemiş hücrelerdeki 0,2-1,5 olan nisbi lusiferaz birimlerine (RLU) arasında bir lusiferaz sinyal üretecek. Bütün bir plaka Dilu yaklaşık 10 ml alacakted virüs. 8 ya da 12 kanallı pipet kullanarak, kuyu her virüsün 100 ul ekleyin. Negatif / arka plan kontrol kuyuları için virüs katmayın. 48 saat boyunca 37 ° C inkübatör plakaları dönün.
    Not: Virüsün stok 1:03 seyreltme viral üstte yüzen madde içindeki konsantrasyonu, yaklaşık 500 ml 1.0 ng olduğunu gösteren bir p24 deneyinde göre 0.2 -1.5 arasında, bir lusiferaz RLU sinyal üretecek tipik bir dilüsyonudur.

5. Hazırlanması ve 96 kuyucuklu plaklar içinde NE sitotoksisi ve enfektivitesini Ölçümü

  1. Kuyulardan medya aspire (medyada fenol kırmızı lusiferaz sinyali etkileyebilir). Ucuna bağlanmış bir 200 ul pipet ucu ile bir cam pipet kullanın. Medyanın üstünde başlamak ve yavaş yavaş kuyunun alt köşesinde aşağı doğru çalışır. Kuyunun alt kısmında çok fazla zaman harcamak etme, ya da hücreler de kaldırılabilir.
  2. PBS içinde 100 ul ekle 0,5 m ile desteklenmişHer bir oyuğa M MgCI2. Bu hücreler, kurumaz, böylece ortam çıkarılır hemen sonra yapılması gerekmektedir.
  3. Sadece sitotoksisite deneyleri için, liyofilize edilmiş bir reaktif temin her şişeye Luminescence ATP algılama tahlilinden alt-tabaka tampon maddesi 5 ml ekleyin. Bir şişe, 96 oyuklu bir plaka için yeterlidir.
    1. Her bir oyuğa Luminescence ATP tarama deneyinde hücre liziz tamponu 50 ul ekle. Kompakt bir termomikser ile 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 700 rpm'de 96 oyuklu plaka çalkalayın.
    2. Negatif kontrol / arka plan gözü hariç bütün oyuklara yeniden Luminescence ATP tespitinde maddesi 50 ul ekle. Kompakt bir termomikser ile 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 700 rpm'de çalkalanır. Sinyal gelişimi için zaman tanımak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. Mikro luminometre kullanılarak 96 oyuklu plaka okuyun.
      Not: SoftMaxPro mikrolevha Lüminometre programını açın. Emin Lüminometre lumi ölçmek için ayarlanmış olduğundan emin olun5 okuma / iyi bir duyarlılıkta lüminesans.
  4. Sadece enfekte deneyleri için, liyofilize edilmiş bir reaktif temin her şişeye Luminescence raportör gen tahlili ikinci alt-tabaka tampon maddesi 10 ml ekleyin. Bir şişe her bir 96-çukurlu plaka için yeterlidir.
    1. Her bir oyuğa yeniden Luminescence raportör gen tahlili tepkin maddesi 100 ul ekle. Sinyal gelişimi için zaman tanımak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    2. Bölüm 5.3.3 'de yapıldığı gibi, bir mikro-luminometre kullanılarak 96 oyuklu plaka okuyun.

Bileşikler CC 50 ve IC 50 Değerleri 6.. Belirlenmesi

  1. Bir excel elektronik tabloya mikrolevha lüminometre gelen lusiferaz veri aktarımı.
    1. Ortalama hem de üç kopya ve arka plan / kontrol sinyal verileri lusiferaz verileri. Tüm konsantrasyon aralığı için ortalama üç nüsha sinyalden ortalama arka zemin / kontrol sinyali çıkarın.
    2. arka bu inhibisyon yüzdesi belirlemek için herhangi bir bileşik yokluğunda, sitotoksisite veya enfekte olup olmadığını, aktivitesine karşı konsantrasyon aralıkları için ortalama sinyali düzeltilmiş Normale.
      Not: yüzde önleme 100 ile çarpılarak ilacın yokluğunda lusiferaz aktivitesi ile bölünen ilaç varlığında, lusiferaz aktivite olarak tanımlanır.
  2. CC 50 ve IC 50 değerlerini elde etmek Kaleidagraph yazılım programını kullanın
    1. Ampirik bir biçimde tespit konsantrasyon aralığını ve KaleidaGraph içine lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi her iki aktarın.
    2. X ekseni üzerinde konsantrasyon aralığı ve Y ekseni üzerinde lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi ile veri çizilir.

Sonuçlar

Tahlil (Şekil 1, adım 1 ve 2) başarılı bir şekilde gerçekleştirildi, daha sonra lusiferaz değerleri Tablo 2'de sunulan veriler benzemelidir konsantrasyon aralığında tarama.; Potansiyel olarak kuvvetli bir bileşik, soldan sağa lusiferaz aktivitesinin arttırılması ortaya çıkaracaktır, ve kontrol, yüksek lusiferaz aktivitesi olmalıdır. Lusiferaz aktivitesi konsantrasyon aralığında 0,1 Bağıl Lusiferaz birimlerine (RLU) geçmez, bu genellikle bileşiğin hücreleri öldürdüğünü gösterir. Lusiferaz veriler, daha fazla ya da tüm seri seyreltileri karşısında 2.0 RLU eşit ise, bileşikler, test edilen konsantrasyonlarda HIV-1 enfeksiyonlarının inhibe etmek mümkün değildi.

Kaleidagraph (Tablo 3, bölüm A) içinde lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi karşı bileşiklerin konsantrasyonunu çizimi, lineer regresyon analizi ile, t benzer sonuçlar üretecek Tablo 3, Kısım B'de gösterilen hortum

figure-results-1
HIV-1 viral stoklar ve hücresel toksisite ve tek yönlü bir bulaşıcılığı Tahliller Kur Şekil 1.. Hazırlanması. Adım 1 'de, 293T hücreleri pNL4.3ΔEnv.LUC ve VSV-G ile transfekte edilir ve 34 virüs üretmek için 48 saat boyunca kuluçkaya yatırılmıştır . Bu enfekte deneylerinde kullanılıncaya kadar virüsü (alikotları -80 ° C'de donduruldu) toplanır ve depolanır. Adım 2 için, HOS hücreler, 96 oyuklu plaka içerisine tohumlanır ve 24 saat için kuluçkalanmıştır. Hücreler daha sonra 3 saat boyunca, test edilecek bileşiklerin seri seyreltileri ile önceden yatırıldı ve daha sonra virüs (WT ya da ilaç dirençli iki) ile enfekte edilir. 48 saatlik bir inkübasyondan sonra, lusiferaz hareketliliği ölçülür.

le1.jpg "width =" 300 "/>
Tablo 1. Seri Seyreltme Prototip tarama Drug. Bir daha sıkı bir tarama tipik olarak 10 uM başlar ve 0.0005 uM 'da sona 11 seri dilüsyonları içerir. Seri seyreltmeler 10x hazırlanır; 100 ul hücre ve de her virüsün 100 ul) vardır. Bu hacim ve bu hesaplamalar neticesinde de, seri seyreltiler, bütün bir 96-yuvalı plakanın 3 satır için yeterli olacaktır. Sitotoksisite deneyleri, aynı şekilde hazırlanır; Bununla birlikte 11 seri seyreltme 250 uM başlar ve 0.05 uM 'da sona. Seyreltileri sadece 11 ul hücre 100 ul içeren plaka içindeki oyuklara ilave edilir. bu şekilde daha büyük bir sürüm görüntülemek için tıklayın.

figure-results-2
Tablo 2. Lusiferaz Sinyal veri okuma ve lusiferaz aktivitesi, bir yüzde Önlenmesinin Belirlenmesi. Verileri tablosu bir başarılı bir bileşik için lusiferaz verileri tipik bir dizi gösterir. Tabloda ayrıca lusiferazm yüzde önlenmesini ve CC 50 ve IC 50 değerlerini belirlemek için gerekli ek hesaplamaları gösterir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

figure-results-3
Tablo 3. Doğrusal Regresyon Analizi Veri Tablosu. Kısım A. KaleidaGraph lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi karşı kullanılan konsantrasyon aralığını Grafik uygun inhibisyon eğrileri üretecektir. Kısım B, inhibisyon eğrileri, 3 parametrik tanımlanırSigmoidal fonksiyonu ve lineer regresyon ile verilere uygun 18 analizleri. Bu veriler tablo, daha sonra% 50, örneğin, IC 50 ve CC 50 ile virüs entegrasyon ve hücresel sitotoksisite engellemek için gerekli ilaç konsantrasyonlarını hesaplamak için Microsoft Excel ile birlikte kullanılır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Biz, sitotoksisite ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 hem de replikasyonunu inhibe etme kabiliyetleri açısından bileşikleri taramak için kullanılabilecek bir hızlı, etkili ve yeniden üretilebilir bir deneyi tarif eder. Hızla bileşikleri belirlemek ve etkinliğini ve sitotoksisite test etmek için yeteneği, HIV-1'e karşı, yeni ve geliştirilmiş ilaçların geliştirilmesinde önemlidir. Kurşun bileşikleri belirlendikten sonra, kurşun bileşiği analogları üretilen ve aynı deneyi kullanılarak test edilebilir. Tahlil oldukça basittir. Kullanıcının en sık karşılaşılan sorunlar (zehirli bileşikler, vektör stoku ile ilgili sorunlar) teşhis etmek için izin hem pozitif ve negatif kontroller vardır. Ilavesiz bileşiği ile kuyu, üçlü bir dizi kullanım, virüs tarafından enfeksiyon meydana geldiğini göstermektedir. Sitotoksisite bağımsız deneyde ölçülür olması viral replikasyonu üzerindeki özel bir etkisi olarak sitotoksisiteye neden lusiferaz bir azalma yanlış yorumlanması önler.

Kritik adımlarHücrelerin eşit olarak kuyu her virüsün aynı miktarda eklenmesi, ve lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi, oyuklar test edilecek bileşiklerin uygun konsantrasyonları sahip olduğu, kuyularda, dağıtılır ve böylece protokolde plakaları hazırlanıyor CC 50 ve IC 50 değerleri belirlemek.

Tahlil, kasa sayısal ve tekrarlanabilir. Vektör, replikasyon kusurlu olduğu için deney güvenlidir. Doğru ve uygun denenebilir lüsiferoz ifade eden bir tek yuvarlak vektör, dayalı olduğu için tahlil nicel ve tekrarlanabilir. Bir çok yuvarlak virüs çoğaltma tahlilinde, ölçülen IC50 viral yaşam döngüsü sayısına bağlıdır; deneyler WT ve önemli ölçüde farklı çoğaltma kapasitelerine sahip olabilir, ilaç dirençli iki virüs içeren bu bir sorundur.

Birkaç enzimatik deneyler bu olabilir orada önceden bildirilmiştirIN inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir. Entegre DNA ölçmek için gerçek zamanlı PCR teknolojisi içeren deneyler daha emek yoğun ve 36, 37 her ikisi de pahalıdır, saflaştırılmış rekombinant protein (ler) gerektirir, ve genel olarak, bulunmaktadır. Bu, diğer viral enzimler (RT ve proteaz) üzerinde bileşiklerin etkisini ölçmek için enzimatik testleri kullanmak mümkün olsa da, her bir enzim, kendi deney sistemi gerektirir. Bir yuvarlak deney vektörü tarif edildiği gibi, RT inhibitörlerinin taranması için, değişiklik olmadan, kullanılabilir. Benzer bir deney, proteaz inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir; Bununla birlikte, bir proteaz inhibitörü deneyde, bileşikler vektörlerini üretmek için kullanılan hücrelere ilave edilmelidir. İlgili bir deney, çeşitli hücreler ve vektörler kullanılarak, aynı zamanda zarf (env) ve HIV giriş füzyon inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir. Son olarak, deney otomatik robot dağıtım aracı ile birlikte, daha büyük bir ölçekte, kullanılabilir. Bu nedenle, tahlil, WT ve m karşı bileşiklerin büyük kütüphaneleri taramak için kullanılabilirutant HIV. Ancak, gerçek deney verileri yorumlamakta bir sınırlama viral yaşam döngüsü noktaları farklı aşamalarında hareket HIV replikasyon inhibitörü algılayabilir. Kendi başına deney, yaşam döngüsünde adım bir bileşik ile bloke edildiği tanımlamaz. Bu soru doğarsa, bu ilave tahliller 38 saati kullanılarak çözüldü ve saflaştırılmış rekombinant viral proteinlere karşı bileşiği test tarafından yapılabilir.

Ne yazık ki, anti-HIV ilaç başarıya rağmen, direnç ve toksisite hem de sorunlar hala var. Etkili bir anti-HIV aşı yokluğunda, mevcut ilaç dirençli mutantların karşı etkili olacak, ancak aynı zamanda virüsün yayılmasını azaltmak önleyici ilaçlar geliştirmek için yeni bir tedavi edici ilaçlar geliştirmek için sadece bir ihtiyaç vardır. Anti-HIV ilaçlarının profilaktik kullanımı bulaşmamış insanların tedavi incudes ise, bu yaklaşım l var olan ilaçların geliştirilmesi üzerinde özel bir yük getireceğiittle veya uzun süreli toksisite.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu araştırma NCI İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMSOSigmaD2650
DMEMCorning Cellgro10-017
ATPlite Lüminesans ATP Algılama Test SistemiPerkin Elmer6016941
Steady Lite Plus Yüksek Hassasiyetli Lüminesans Raportör Gen Test SistemiPerkin Elmer6016751
Dulbecco'nun PBSGibco-Life Technologies-Invitrogen14190-136
SpectraMax Gemini EMMoleküler Cihazlar
KaleidaGraphSinerji Yazılımı
Nunc F96 Microwell Beyaz Polistiren PlakaThomas Scientific12-566-26
Eppendorf Termomikser KompaktSigma AldrichT1442-1EA
Turbo DNaseAmbion-Life Teknolojileri-InvitrogenAM2238
Millex HA Filtre Ünitesi, 0.45 & MMillipore SLAHA033SS
İttifakı HIV-1 p24 Elisa Kit, Perkin ElmerNEK050B001KT
HOS hücreleriATCCCRL-1543
TZM-bl hücreleriNIH AIDS Reaktif Programı8129
pNL4.3 & Delta; Env.LUCNIH-NCI HIV İlaç Direnci Programı- Hughes Lab
VSV-GNIH-NCI HIV İlaç Direnci Programı- Hughes Lab
SoftMax ProMoleküler Cihazlar0200-310

Kaynaklar

  1. Mouton, Y., et al. Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA. AIDS. , 101-105 (1997).
  2. Hammer, S. M., et al. A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team. New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).
  3. Hogg, R. S., et al. Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens. Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).
  4. Egger, M., et al. Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study. BMJ. 315, 1194-1199 (1997).
  5. Gulick, R. M., et al. Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy. New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).
  6. Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time. Science. 271, 1582-1586 (1996).
  7. Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature. Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).
  8. Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic. Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).
  9. Volberding, P. A., Deeks, S. G. Antiretroviral therapy and management of HIV infection. Lancet. 376, 49-62 (2010).
  10. Acosta, E. P., et al. Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data. Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).
  11. Rockstroh, J. K., et al. Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK. Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).
  12. Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management. Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).
  13. Lunzen, J., et al. Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial. Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).
  14. Sax, P. E., et al. Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks. Lancet. 379, 2439-2448 (2012).
  15. Sax, P. E., et al. Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results. Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).
  16. Kellam, P., Larder, B. A. Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates. Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).
  17. Hertogs, K., et al. A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs. Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).
  18. Petropoulos, C. J., et al. A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1. Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).
  19. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67, 1211-1221 (1991).
  20. Hazuda, D. J., et al. Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells. Science. 287, 646-650 (2000).
  21. Nguyen, B. Y., et al. Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).
  22. Wills, T., Vega, V. Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase. Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).
  23. Kobayashi, M., et al. In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor. Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).
  24. Cooper, D. A., et al. Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng. J. Med. 359, 355-365 (2008).
  25. Briz, V., et al. Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O. AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).
  26. Fransen, S., et al. Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways. J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).
  27. Goethals, O., et al. Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles. Virology. 402, 338-346 (2010).
  28. Goethals, O., et al. Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors. J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).
  29. Canducci, F., et al. Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies. AIDS. 23, 455-460 (2009).
  30. Ceccherini-Silberstein, F., et al. Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation. AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).
  31. Charpentier, C., et al. Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy. HIV Med. 9, 765-770 (2008).
  32. Julias, J. G., et al. Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage. J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).
  33. Hare, S., et al. Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572). Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).
  34. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. J. Virol. 59, 284-291 (1986).
  35. Kemp, S. D., et al. A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine. J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).
  36. Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nat. Med. 7, 631-634 (2001).
  37. Brussel, A., et al. Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection. AIDS. 17, 645-652 (2003).
  38. Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds. Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

HIV ntegraz nhibit rleriH cresel Sitotoksisite AnaliziLusiferaz Raporer AnaliziSeri Dil syonlu Bile iklerYabani Tip HIV 1la Diren li HIV 1ATP Ba ml L minesansMikroplaka L minometresi96 Kuyucuklu Plaka Taramas
HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.