Yöntem makalesi

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

DOI:

10.3791/51408

⸱

29 Mayıs 2014

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücre gen sentezleme tahlili kök hücre heterojeniteler anlamak için gereklidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kök hücre nüfusun heterojenliği gibi farklı soy doğru onların farklılaşma eğilimi gibi, kök hücre biyolojisi ayrıntılı bir anlayış engellemektedir. Tek bir hücre transcriptome tahlil bireysel farklılık diseksiyon için yeni bir yaklaşım olabilir. Biz tek hücre Mah-PCR yöntemi geliştirdi ve bu yöntem, birkaç gen ekspresyon profilleri iyi çalıştığını doğruladı. Tek hücre düzeyinde, Oct4 olanlar her insan embriyonik kök hücre, :: EGFP pozitif hücreler, Oct4 yüksek ifade, ama Nanog bir ifade farklı bir düzeye sahiptir. Bizim tek bir hücre gen ekspresyon tahlil nüfus heterojenliklerin sorgulamak için yararlıdır olmalıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En yüksek ökaryot nüfus toplanmış nüfus analizi dolayısıyla heterojen, onların hücresel özelliklerini yorumlamak zordur. Bir nüfus içinde, tek tek hücrelerin kurnazca farklı olabilir, ve bu farklılıklar tüm nüfusu 1, 2 özelliği ve fonksiyonu için önemli sonuçlar doğurabilir. Özellikle, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) hassas bir şekilde ayırt edici 3, 4 içinde soy spesifikasyonuna pluripotensin farklı düzeylerde ve çeşitli potansiyelleri neden olan, heterojen olduğu bilinmektedir. Örneğin, farklı hücre yüzeyi antijenleri farklılaşmamış pluripotent kök hücreleri sınıflandırmak için kullanılabilir, 5 ve Austin Smith grup, morfoloji, farklılaşma yolu eğilimi ve 6 sinyal bağımlı bir göre, fare embriyonik kök hücreleri pluripotensin farklı düzeylerde önerdi. Bu olgu insan embriyosunda hipotezinic kök hücreler 7. Genel çalışmalar, farklı kök hücre hatları, bireysel değil tek bir kök hücreler arasında tülürken, potansiyel tüm somatik hücre soylarının doğru onların farklılaşma kapasitelerini etkileyen tek hücre düzeyinde pluripotensin farklı düzeylerde analiz etmek çok ilginç olabilir.

Hücresel ve moleküler heterojenite 'tek hücreli transcriptome' denir, transkripsiyon profilleme tarafından dikte ve gen ekspresyon düzeyleri 8-10 ölçülmesi için yeni yaklaşımlar vurguluyor olabilir. Tek tek hücrelerin gen ekspresyonu seviyesini ölçmek için, tek bir hücre nicel RT-PCR, basit, ancak güçlü bir protokol geliştirilmiştir. Bu asgari teknik varyasyonlar ve farklar ile sonuçlanan, her bir hücre lizatlarının yarısı gibi hESC seri olarak seyreltildi, toplam RNA karşılaştırarak eden protokol etkinliğini ve uygulanabilirliğini doğruladı. Ayrıca, biz homojen p izole etmek için genetik bir muhabir hattı kullanılırGen hedefleme sistemi kullanılarak hESC opulation. Oct4 lokusunu (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro yapı) ve TALEN plasmidlerin bir çift hedeflenmesi için verici vektör 11 kullanılmıştır. Donör vektör ve TALEN plasmitler bir çift bizim nucleofection ve klonal seleksiyon protokol ve HESC bizim rutin protokolüne 12 dayanılarak yapılmıştır bakım kullanılarak hESC (H9, WA09) girmiştir. Biz bu genetik muhabir hat Oct4 içinde Oct4 ifade EGFP ifade :: EGFP hESC doğruladı.

Bizim sonuç (Oct4 olanlar :: EGFP kuvvetli pozitif hücreler) bireysel HESC Oct4 ifade yüksek düzeyde, ama Nanog ifade farklı düzeylerde sahip olduğunu göstermektedir. Yani, bizim tek bir hücre gen ekspresyon tahlil pluripotent kök hücrelerin nüfus heterojenliklerin incelemek yararlı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir 96-yuvalı plaka içinde 1. Hazırlanması

  1. 9 ul Tek Hücre Çözme Çözüm Tek Hücre DNase1 1 ul karıştırın.
  2. 96 çukurlu PCR plakanın her çukuruna 10 ul karıştırılmış çözeltisi koyun.

FACS Arıtma 2. Ayrılmakta HESC

  1. Insan ES ortam ile nötralize edildi, 37 ° C'de 20 dakika boyunca 1 ml Accutase ile 60 mm tabak, ikinci Oct4 :: EGFP ES hücre hattı çıkarın.
  2. FACS tampon 1 ml hücre popülasyonu hazırlayın ve 1 x 10 6 hücre / ml hücre ayarlayın.
  3. Bir 35 um hücre filtresi kapak tüp aracılığıyla hücre örneği geçirin.
  4. Hücre sıralama önce buz içinde tüpü saklayın.

96 oyuklu plakanın her bir FACS-arıtıldı Tek Hücre 3. Lysis

  1. Eğitimli bir operatör ile bir hücre sıralayıcı EGFP pozitif hücreler için örnek sıralayın. 96 oyuklu bir plaka içerisinde PCR tek hücre Lysis/DNase1 çözeltisi içine tek bir hücre koyun. Gerekirse, 9Örnek 6 oyuklu plaka bir aydan daha kısa bir -80 ° C derin dondurucuda saklanabilir.
  2. Hücre lizizi, oda sıcaklığında numuneleri 5 dakika inkübe edin.
  3. Parçalama reaksiyonu durdurmak için Stop Çözüm 1 ul ekleyin.
  4. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.

4. Ters Transkripsiyon

  1. 20 uM SMA-T15, SMA-A, her bir kısım için 0.5 ul ekle.
  2. Her bir oyuğa 4 ul 5X tampon maddesi, 2 ul DTT, 1 ul ters transkriptaz ve 1 ul dNTP ekleyin.
  3. , Bir termal döngü içinde, ters transkripsiyon yapın.
    1. 90 dakika × 42 ° C 'de termal programı ayarlamak ve 85 ° C x 5 dak ters transkriptaz etkisiz hale getirirler.

5. Amplifikasyon

  1. Her ters transkripsiyonu örnek ExoSAP-IT reaktif 4 ul ekleyin.
    1. ExoSAP-IT reaktif inaktive edilmesi, 15 dakika, 15 dakika ve 80 ° C'de, 37 ° C'de inkübe edin.
  2. PCR reaksiyon karışımı w hazırlayınith SMA-p2 (2 nM)
  3. Her bir ters transkripsiyonu örnek PCR reaksiyon karışımı 10 ul ekle.
  4. Denatürasyon 20 döngü (30 saniye için 94 ° C), tavlama (30 saniye boyunca 57 ° C) ve uzatma (68 ° C 10 dakika süre ile) 'dan oluşan, amplifikasyon yapın.

6. Mah-PCR Performans

  1. Her bir oyuğa 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul büyütülmüş cDNA, 2 nM primerler ve 7 ul su içinde 10 ul ekle.
    1. 3 saniye boyunca 95 ° C'de, ardından bir program ayarlama, 30 saniye x 40 döngü için 60 ° C.
  2. Teknik hatalar için çift olarak gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verimli ve güvenilir bir hücre RNA amplifikasyonu

HESC arasında kopyalanma değişimini en aza indirmek için, kullanılan :: Oct4 FACS arıtma için EGFP HESC klonu. 96 oyuklu bir plaka içerisine Oct4 :: EGFP pozitif hücreler sıralama sonra, her bir hücre parçalama tamponu içinde lize edildi ve SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primeri kullanılarak ve SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ile sabitleme tam uzunlukta cDNA'ya poli (A) + RNA dönüştürülmüş ) SMART şa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücre gen profilleme tek bir hücrenin işlevini veya tüm nüfusu tahmin etmek için önemli bir araç olabilir. Nedeniyle teknik sınırlaması, bütün gen profili analizi nüfus ortalamasına sınırlı olmuştur. Gen ekspresyonu ve tek tek hücreler ile alt grupları arasında seviyelerindeki varyasyonlar yanlış yorumlanmasına yol açtığı önerilmiştir. Gibi çeşitli hücresel yönleri HESC bulunabilir ve bunların heterojenite pluripotensini ve kader şartname sürecini korumak için kurnazca farklı yeteneği neden olur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz el yazması değerli tartışmalar için Lee laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Lee laboratuarda çalışma Hücre Araştırma Fonu (Tedco) Kök New York Kök Hücre Vakfı Robertson Araştırmacı Ödülü ve Maryland hibe tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 kuyulu PCR PlakasıABD bilimsel1402-8900
Ambion Hücre Lizis KitiYaşam Teknolojileri4458235
SMARTScribe Ters TranskriptazClonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
Platin Taq DNA polimeraz Yüksek SadakatInvitrogen11304
10 mM dNTP Karışımı, PCR SınıfıInvitrogen18427
SYBR Evrensel 2X Master MixKapa biyosistemiKR0389
AccutaseYenilikçi Hücre TeknolojisiS-1100-1
FACS tamponu45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 & mu; l DNase, filtre sterilize edilmiş
35 & mu; m hücre süzgeç kapağı tüpleriBD Biosciences352235

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  2. Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
  3. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
  4. Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
  5. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
  6. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
  7. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
  8. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
  9. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  10. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  11. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
  12. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
  14. Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
  15. Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H cre qRT PCRFloresan Aktive H cre Ay klamaTers TranskripsiyonPolimeraz Zincir ReaksiyonuOCT4 EGFP Pozitif H crelerGen Ekspresyon Profili karmaPop lasyon Heterojenli iK k H cre Belirte leri

İlgili makaleler