Method Article

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

DOI:

10.3791/51416

⸱

July 1st, 2014

 , 
1CEA, DSV, IG, Genoscope, 2CNRS-UMR8030, Évry, France, 3Université d'Évry Val d'Essonne, 4Massachusetts General Hospital Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi kullanılarak örnekler arasında protein ekspresyon farklılıkları ölçmek için bir yöntemdir. Redi etiketleme her bir serbest amin için iki metil grubu eklemek için düzenli olarak (ışık) veya formaldehid ve sodyum siyanoborohidrid döteryumlanmış (ağır) formları kullanılarak gerçekleştirilir. Burada Redi etiketleme ve kompleks protein karışımları kantitatif karşılaştırılması için sağlam bir protokol göstermektedir. Karşılaştırma için Protein örnekleri hafif ya da ağır metil etiketler, karıştırılmış ve LC-MS/MS ile ko-analiz ya da taşımak için etiketli peptidler içine sindirilir. Bağıl protein bolluğu tam MS spektrumları elde oluşturucu peptidin ağır ve hafif olarak işaretlenmiş versiyonlarının iyon kromatogram tepe alanlarının karşılaştırılması ile nicelendirilir. Burada tarif edilen yöntem örnek ters-fazlı, katı faz ekstraksiyonu ile hazırlama, peptidlerin üzerinde kolon Redi etiketleme, bazik pH rev tarafından peptid içerir fraksiyonasyonersed faz (BPRP) kromatografi ve StageTip peptid saflaştırma. Biz kararlı izotop birleşme için diğer yöntemlere göre Redi etiketleme avantajları ve sınırlamaları tartışmak. Biz örnek hemen hemen her tür protein zengindi karşılaştırmak için, hızlı, ucuz ve doğru yöntem olarak Redi etiketleme kullanarak yeni uygulamalarını vurgulayın.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karmaşık numuneler arasında birçok proteinin konsantrasyonu farklılıklarını ölçme proteomikteki merkezi bir sorundur. Giderek, bu farklı izotopik etiketler, her numune proteinlerin etiketleme örnekleri birleştirilmesi ve konsantrasyon farkları ölçmek için kütle spektrometresi kullanılarak yapılmaktadır. Çeşitli yöntemler, protein ve peptid kararlı izotopik etiketleme için vardır. ICAT 3, 4 iTRAQ ve indirgeme dimetilasyonu 5 protein ekstraksiyonu ve sindirim sonra izotop etiketleri ekleme ise 15 N etiketleme 1 ve SILAC 2, in vivo olarak metabolik izotopik etiketler tanıtmak. Bu yöntemler arasında, indirge....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu yöntem daha önce 12 tarif edilmiştir.

1.. Protein İzolasyonu

Tercihen, French pres, boncuk dayak veya sonikasyon gibi fiziksel yöntemlerle, yokedici hücreler tarafından hücre protein 1 mg hazırlayın. Enzim kütle spektrometresi ölçümleri bulandırabilir çünkü lizozim-aracılı hücre parçalanmasını önlemek.

Proteinlerin 2. TCA Yağış

Proteinlerini çöktürmek için 10 dakika süre ile buz üzerinde 4 hacim protein ve soğuk 1 hacim trikloroasetik asit (TCA) ilave edin. Santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12,000 x g ve supernatant çıkarın. 4 ° C&....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Saccharomyces cerevisiae kullanılarak doğruluk, kesinlik ve Redi etiketleme tekrarlanabilirliği değerlendirildi ve Clostridium tüm hücre lizatlarını phytofermentans. Önce C bir karışımı Redi etiketleme verimliliği sayılabilir selüloz (ağır etiketli, H) ve glukoz (açık etiketli, L) kültürler protein lizatları phytofermentans. Bir% 1 peptit yanlış keşif orana süzüldü, bu örnek, bir% 98 verimle Redi etiketleme 11194 benzersiz peptid dizilerini ihtiva etmiştir. Kesirlenmemiş .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek ucuz etiketleme reaktifleri (reaktif numune başına 1 dolardan daha az maliyeti), hızlı reaksiyon hızı (~ 10 dk), yan ürünlerin yokluğu: Birkaç puan nicel Proteomikte için cazip bir yöntem indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) kullanılarak peptidlerin kararlı izotop etiketleme yapmak tekrarlanabilirliği (Şekil 3, 4), sabit reaksiyon ürünleri, bir proteaz kullanma yeteneği ve işaretli peptidlerin yüksek iyonlaşma verim. Bir sentetik ortam üzerinde spesifik amino asit oksotrofilerinin veya büy.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını ya da diğer ilgi çatışmalarını beyan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yardım ve rehberlik için SP Gygi ve GM Church'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, ACT'ye bir CNRS başkanı tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Trikloroasetik asitSigma-AldrichT9159protein çökeltme
AsetonSigma-Aldrich650501protein çökeltme
Sodyum dodesil sülfatSigma-Aldrich71736denatüre, protein
Sodyum hidroksitSigma-AldrichS8045denatüre eder, protein
DL-Dithiothreitol'üazaltırSigma-Aldrich43816denatüre, azaltma, alkilat
proteini Proteaz İnhibitörü Komple Mini KokteylRoche4693124001denatüre, proteini azaltır
İyodoasetamidSigma-AldrichI6125alkilat proteini
HEPESSigma-AldrichH7523yeniden süspanse, ekstrakte etme, etiketleme proteini
Kalsiyum klorürSigma-AldrichC5670proteini yeniden süspanse
Lizil EndoproteazWako Kimyasalları129-02541protein sindirimi
Sıralama sınıfı tripsinPromegaV5111protein sindirimi
Asetik asitSigma-Aldrich320099protein sindirimi
Trifloroasetik asitSigma-Aldrich299537Ters fazlı peptit ekstraksiyonu
tC18 Sep-Pak C18 kartuşlarıSularWAT054960Ters fazlı peptit ekstraksiyonu
Ekstraksiyon manifolduSularWAT200609Ters fazlı peptit ekstraksiyonu
AsetonitrilSigma-Aldrich14261çeşitli
FormaldehitSigma-Aldrich252549" ışık" peptit etiketleme
SiyanoborohidritSigma-Aldrich71435" ışık" peptit etiketleme
Döteryumlu formaldehitSigma-Aldrich492620" ağır" peptit etiketleme
Sodyum siyanoborodeürideCDN izotoplarıD-1797" ağır" peptit etiketleme
MESSigma-AldrichM3671peptit etiketleme
C18-HPLC sütunu (4.6 x 250 mm, 5 & m partikül boyutu)Agilent770450-902bazik pH ters faz kromatografisi
Formik asitSigma-Aldrich399388çeşitli
C18 Empore Diskleri3M14-386-3 AŞAMA ipuçları
MetanolSigma-Aldrich494437STAGE ipuçları
etmek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reductive DimethylationStable Isotope LabelingQuantitative ProteomicsPeptide FractionationLC MS MS AnalysisSolid Phase ExtractionBasic pH Reversed Phase ChromatographyStageTip PurificationMass Spectrometry QuantificationProtein Abundance Comparison

Related Articles