Yöntem makalesi

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

15.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51420

⸱

13 Mayıs 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Gene Regulation and Expression, College of Life Sciences, University of Dundee, UK

Bu makalede

Özet

Bu görüntüleme kullanılarak hipoksi küresel RNA sentez analizi için bir tekniği açıklar. RNA tıklayın-kimya etiketleme önceden hipoksi altında gerçekleştirilen ve tek hücre düzeyinde küresel RNA değişikliklerin görselleştirme sağlar olmamıştır. Bu yaklaşım, küresel RNA sentezinde hücreden hücreye değişiklik doğrudan görselleştirme sağlayan, mevcut ortalama RNA tekniklerinin tamamlar.

Özet

Oksijen kullanılabilirliği Hipoksi ya da düşürülmesi, pek çok fizyolojik ve patolojik proses yer almaktadır. Moleküler düzeyde, hücreleri uygun ve koordine hücre tepkisi için özel bir kopyalama başlatma programı. Hücre aktiviteleri için kofaktör olarak moleküler oksijen gerektiren çeşitli oksijen sensörü enzimlere sahip. Bu prolile-hidroksilazları ikinci histon demethylases değişir. Hipoksiye hücresel yanıtları analiz çalışmaların çoğu hücresel popülasyonlar ve ortalama çalışmalara dayanmaktadır ve hipoksik hücre bu tip bir tekli hücre analizi olarak nadiren gerçekleştirilir. Burada mikroskopi analizi ve miktar tayini, ardından kontrollü bir oksijen iş istasyonu Click-iT RNA görüntüleme kitleri kullanılarak hipoksi tek hücre düzeyinde, küresel RNA sentezinin analizi için bir metod tarif eder. Farklı zaman uzunlukları için hipoksiye maruz kanser hücrelerini kullanarak, RNA, her hücrede etiketlenir ve ölçülür. Bu analiz sağlar:hipoksik strese aşağıdaki genel RNA sentezinde zamansal ve hücreden hücreye değişiklik görselleştirme.

Giriş

Hipoksi (Düşük oksijen gerilimlerinin) bir doku için normal oksijen rahatsız olduğu zaman meydana gelir. Çevre oksijen birçok hücre türleri için önemli ipuçları veren, bir besleyici ve bir sinyal molekülü hem de. Çevre oksijen değişiklikler Hipoksi İndüklenebilir faktörler (HIFs) olarak bilinen önemli bir transkripsiyon faktörü ailesinin aktivitesini kontrol dioxygenases bir grup tarafından algılanır. HIFs iki alt-birimden, α ve β oluşmaktadır. Bilinen üç HIF-α izoformu (1, 2 ve 3) ve HIF-1β çoklu ekleme varyantları bulunmaktadır. HIF-1β yapıcı bir şekilde ifade ve çevresel oksijen düzeyleri 1 ile düzenlenmemiştir. HIF-α aile üyeleri dinamik Prolile hidroksilazları (doktora) bir sınıf tarafından düzenlenir ve Faktör HIF (FIH) inhibe edilir; HIF-α 2,3 hidroksilasyon katalize etmek üzere bir ko-faktör olarak oksijen gerektirdiği her ikisi de. Normoksi olarak HIF-α aile üyeleri olarak hidroksilite edilmiş ve proteosom için etiketliE3-Ligazını, von Hippel Lindau (VHL) tarafından al bozulması. Hipoksi ve doktora FIH aktif olmayan ya da düşük bir aktiviteye sahiptir. HIF-α izoformlar, kararlı hale HIF-1β ile bir heterodimer oluşturan ve hipoksik bir ortamda (Şekil 1A), hücresel cevabı sağlayan genlerin transkripsiyonu etkileyebilen 4.

RNA analizi için mevcut teknikler, belirli bir hücre popülasyonu arasında ortalama değerlerinin ölçümü odaklanır. Hücreler onlara düşmanca bir ortamda 5. uyum sağlayan genlerin sayısız transkripsiyonunu başlatarak bir hipoksik uyarana cevap. Bununla birlikte, hipoksi, genellikle bir gradyan olarak mevcut ve hipoksik bir ortamda hücrelerin muntazam hipoksik uyarıcı tabi değildir. Biz hipoksi tek hücre düzeyinde küresel RNA sentezini incelemek için bir oksijen kontrollü bir iş istasyonu tıklayın-iT RNA görüntüleme kitleri bir uygulama tarif.

RNA görüntüleme kiti a kullanırlkyne modifiye edilmiş nükleosid, 5-etinil üridin (AB) ve hücre ve dokuların 6, geçici ve mekansal olarak küresel RNA sentezinin saptanmasını sağlamak için kemoselektif ligasyonu. Kısaca, hücreler hipoksi ve AB mevcudiyetinde kültürlenmiş ile muamele edilir. Daha sonra sabit ve geçirgenleştirildi ve doğmakta olan RNA'ya AB şirketleşme bir azid içeren boya ile AB Kemoselektif ligasyonu ile tespit yapılmaktadır. Bu reaksiyon için tipik bir iş akışı Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Biz hipoksi ile muamele sonucu tek hücre düzeyinde RNA sentezini incelemek için RNA görüntüleme kiti kullanıldı.

Alkin etiketinin küçük boyutlu, özellikle RNA'ya modifiye nükleositin etkili bir birleşme sağlar. Kemoselektif ligasyonu veya 'klik' tepkisi yüksek, verimli, hızlı ve 7-10 özgüdür. Reaksiyon bileşenlerinin tümü bioinert ve reaksiyon, herhangi bir aşırı sıcaklıklara veya çözücü gerektirir. Click reaksiyonu olumsuzlarGeleneksel radyoetiketlenmeye gereksinimi ve çıkış beri sonuçların direkt görüntülenmesini sağlar ışıktır. Buna ek olarak, tespit molekülü kolayca RNA etkileşimli proteinlerin saptanması için antikorlar da dahil olmak üzere multipleks analizine imkan kompleks örnekleri nüfuz edebilir. Bu RNA görüntüleme deney Alexa Fluor ve flöresin (FITC) de dahil olmak üzere, organik boyalar ile uyumludur.

Biz uzaktan nesneler için açık mikroskopi ortamda (omero) bir uygulama kullanarak bizim hücre tedavisi sonrasında RNA sentezi değişimi ölçülür. Omero mevcut açık kaynak kodlu yazılım, http://openmicroscopy.org/ . Bu mikroskop görüntü analizi ve görselleştirme yazılım erişimi ve çok boyutlu, heterojen veri setlerinin yönetimi dahil olmak üzere biyolojik verilerin geniş bir yelpazede, kullanımı sağlar. Istemci uygulaması uzaktan görselleştirme ve karmaşık biyolojik görüntü verileri 11 analizini sağlar;küresel ve tek hücre RNA sentezi görsel değişiklikleri ölçmek için kullanılır. Bu mikroskopta görüntü görselleştirme ve analiz yazılımı kullanarak bu verileri ve bizim RNA görüntüleme deney analiz etmek için gerekli adımlar aşağıda gösterilmiştir.

Bu en fazla 24 saat için hipoksi insan osteosarkom tedavisinde (U2OS) hücreleri aşağıdaki genel RNA sentezinde değişikliklere görünüyordu. Tüm koşullarda olarak, RNA üretim düzeyinde hücre-hücre değişimini tespit edildi. Hipoksi maruz kısa zamanlar hücrelerinde olgunlaşmamış RNA seviyesinde önemli değişiklikler ile sonuçlanmamıştır. Bununla birlikte, hipoksi, 24 saat maruz hücrelerinde üretilen RNA miktarında önemli bir artış ile sonuçlanmıştır. Hipoksiye hücresel tepkilerin çoğu, 4-24 saat kadar uzun süre maruz kalma, aşağıdaki ölçülür. Ancak, bazı mekanizmalar örneğin, çok daha erken yerine konur; NF-KB aktivasyonu hipoksiyaya maruz kalma 12 5-15 dakika içinde gerçekleşir. Kısa hipo Araştırılmasıxia pozlama süreleri bu nedenle garanti edilir ve bu, hücre döngüsü ve apoptoz gibi daha karmaşık tepkiler azaltacağından.

Protokol

1.. Hücre Kültürü ve Tedavi

  1. Kültür, insan osteosarkom (U2OS) hücreleri, Tablo 1 'de listelenen reaktifler ve ekipmanı toplayın. Tüm reaktifler hazırlamak ve sterilite sağlamak için laminar hava akış başlığı içinde tüm doku kültürü teknikleri yürütmek
  2. Aşağıdaki gibi hazırlayın kültür ortamı:% 10 (FCS) arasında nihai konsantrasyonlar elde etmek için 50 ml DMEM FCS, 5 ml L-glutamin, 5 ml penisilin / streptomisin ekleme, 2 mM (L-glutamin), 50 U / ml ( penisilin) ​​ve 50 U / ml (streptomisin). Bir su banyosu içinde 37 ° C 'de kültür ortamı ısıtın.
  3. Tedavi için hücrelerin hazırlanması:
    1. % 70 etanol içinde çeşitli sterilize lamelleri, altı adet 3,5 cm plakaların altındaki bir kuru hava ve yer verir.
    2. 2 ml lamelleri da kuyu altına yapıştırılır kalmasını sağlamak için lamel forseps ile bastırarak, tam bir DMEM (37 ° C) ısıtılmıştır bırakın.
    3. Kendi dokusu kült U2OS hücreleri ayırmak4 ml uygulayarak, 3 ml PBS ile bir kez yıkanarak ure plaka% 0.05 tripsin-EDTA (% 1) ısıtılmış ve 7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe.
    4. 6ml içinde süspanse edin hücreleri tripsin-EDTA inaktive ve hemasitometre kullanarak saymak için tam DMEM'yi ısındı.
    5. Alanına 1.3.1 'de hazırlanan 3.5 cm plakalarının her biri için Plaka 2 x 10 5 hücre. Yavaşça bir hatta cep dağılımını sağlamak için plaka kaya. Hücreler, işlemden önce gece boyunca bağlı izin verin.
  4. Hipoksi iş istasyonu içine dört adet 3,5 cm tabak yerleştirerek hücreleri tedavi ve normal oksijen şartlarında 37 ° C'de inkübatör içinde diğer iki 3.5 cm tabak bırakın. Hipoksi tedavi bitmeden (hipoksi tedavi hücreleri hipoksi odasında) tedavi koşulları altında RNA etiketleme tahlili 1 saat işbaşı yapmaya hazır olun.
  5. 1 saat 15 dakika, 1 saat 30 dakika, 2 saat ve 24 saat boyunca hipoksi hücreleri Açığa. Bu zaman noktalarında, esnek ve kullanıcı tarafından belirlenmektedir.
  6. Bir NORMO kullanınPozitif kontrol ve negatif kontrol olarak, 4 saat boyunca Aktinomisin D (10 ug / ml son konsantrasyon) ile muamele edilmiş bir normoksik 3.5 cm levha olarak xic 3.5 cm plakası. Aktinomisin D, küresel RNA sentezinin bir inhibitörüdür.

Uyarılar:

Hoechst 33342, bilinen mutajen olduğu.
DMSO dokulara organik moleküllerin girişini kolaylaştırmak için bilinmektedir.
NaOH yıpratıcıdır.
HCl yıpratıcıdır.
Paraformaldehyde tüm hayvanlar için son derece zehirli olan ve insanlarda ölüme neden olabilir.
Triton X-100 doğrudan temas aşağıdaki cilt tahrişine neden olabilir.
Aktinomisin D zaman deri ya da yutulması ile temas toksiktir.
Tüm tehlikeli kimyasallar kullanırken gerekli önlemleri alın.

2.. Tıklayın-iT Tahlilin

  1. - 7.6, PBS içinde% 3.7 paraformaldehid (PFA),% 1 Triton X, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) pH 7.2: Click-iT deney kiti ek olarak gerekli olan aşağıdaki reaktifler toplayınPBS içinde -100, iyonu giderilmiş su (dH 2 O), dimetil sülfoksit (DMSO), 10 M sodyum hidroksit (NaOH) ve 37% hidroklorik asit (HCI); Opsiyonel - pH indikatör şeritleri.
  2. Aşağıdaki gibi tıklayın-iT reaksiyonu yapmadan önce taze PFA stok solüsyonu hazırlayın:
    1. 1.85 g PFA, bir 50 ml Falcon tüpüne 3.5 ml dH 2 O ve M NaOH of10 10 ul koyun. Bir su banyosu yapmak ve davlumbaz bu durmak için mikrodalga büyük bir beher içinde H 2 O 400 ml - 300 kaynatın.
    2. Su banyosu içine 50 ml Falcon koyun ve yavaşça PFA çözünene kadar periyodik olarak kapağı serbest, 10 dakika boyunca çalkalayın.
    3. % 37'lik bir çözelti elde, başka bir 50 ml Falcon tüpü içine, bir 0.2 mikron filtre içinden PFA çözelti, şırınga.
    4. PBS ekleyerek 10x seyreltin ve konsantre HCI 12 | il ilave edilerek pH 6.8 'e getirmek. Opsiyon: davlumbaz gösterge şeritleri ile doğru pH değeri onaylayın.
    5. Hemen kullanın ya da o mağazayeterli olmasını at 4 ° C.
  3. Aşağıdaki gibi RNA görüntüleme kiti stok çözümleri hazırlayın:
    1. AB, 100 mM'lik bir stok solüsyon elde bileşen A için 373 ul dH 2 O ekleyin. Bir aya kadar -20 ° C'de saklayın.
    2. B bileşeni (Alexa Fluor 594) DMSO içinde 85 ul eklenir ve pipetleme ya da vorteks ile karıştırın. Bir yıla kadar -20 ° C 'de hem de muhafaza edin.
    3. RNA görüntüleme kiti reaksiyon tamponu katkı 10X bir çözüm oluşturmak için bileşen E 2 ml dH 2 O ekleyin. Çözelti, kahverengi bir renk geliştiğinde bir yıla kadar -20 ° C'de saklayın, atın.
  4. AB ile Hücrelerinin Etiketleme: önceden ısıtılmış tam ortam (37 ° C) içinde aşama 2.3 'de hazırlanan 100 mM stoktan AB 2X' lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın bu aşamasının kalan yapın ve hipoksi ile muamele edilmiş hücreler için hipoksi odası içinde 2.5 adım. . ortam Devam için bu 2X çalışma çözeltisinin eşit hacimde eklenmesiyle 1X seyreltinhücreleri Aining. Muamele hücre kültürü koşulları altında 1 saat boyunca inkübe edilir.
  5. Hücre Sabitleme: PBS ile bir kez, her yıkama ve muamele koşulları altında, yukarıda aşama 2.2 'de hazırlanan% 3.7 PFA stoklar 1 ml. Işlem koşulları altında, 15 dakika boyunca inkübe edin. Hipoksi ile muamele örnekler, bu noktada hipoksi haznesinden çıkarılabilir. Fiksatif çıkarın ve PBS ile de bir kez her yıkayın (sorumlu atık PFA atmanız dikkat edin). Oda sıcaklığında bir sonraki adımları uygulayın.
  6. Permeabilization: yıkama çözeltisi çıkarın ve her bir oyuğa, PBS içinde% 1 Triton X-100, 1 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Permeabilization tamponu çıkarın ve PBS ile de bir kez her yıkayın.
  7. Etiketli RNA Algılama:
    1. DH 2 O'da 10X çözeltisi (aşama 2.3 'de elde edilmiş) 1:10 seyreltilmesiyle RNA görüntüleme kiti reaksiyon tamponu ilave taze bir 1X çalışma çözeltisi hazırlayın
    2. RNA görüntüleme kiti hazırlamahazırlandıktan hemen sonra kullanım için Tablo 2'ye göre tepkime kokteyli.
    3. Yıkama çözüm çıkarın ve her bir örnek için RNA görüntüleme kiti reaksiyon kokteyl 500 ul ekleyin. , Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe ışıktan koruyunuz.
    4. RNA görüntüleme kiti Reaksiyon kokteyl çıkarın ve RNA görüntüleme kiti Reaksiyon yıkama tamponu (bileşen F), 1 ml ile bir kere yıkayın, sonra RNA görüntüleme kiti Reaksiyon yıkama tamponu çıkarın.
  8. İsteğe bağlı multipleks tepki: üreticinin önerilerine göre bu noktada ek bir numune antikor etiketleme gerçekleştirin.
  9. DNA Boyama: PBS ile yıkayın Numuneler daha sonra yıkama çözeltisi çıkarın. PBS içinde Hoechst 33342 (Bileşen G) 1:1,000 seyreltin. Her bir oyuğa seyreltilmiş Hoechst 33342 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir, ışıktan koruyunuz. Hoechst 33342 çözüm çıkarın ve iki kez PBS ile hücreleri yıkayın. Yıkama eriyik çıkarınn ve ışık mikroskobu geçin.

3.. Işık Mikroskopisi

  1. Dağı Lameller:
    1. Standart bir mikroskop lamı ortasına orta montaj 10 ul koyun.
    2. Montaj orta kısım kapak aşağı mikroskop lamı ortasına hücre yüzü lamel yerleştirin. Bu daha sonraki görüntü alımı belirsiz gibi montaj orta kabarcıklarının oluşmasını önlemek için dikkat edin.
    3. Onun çevresine şeffaf tırnak vernik uygulanarak mikroskop lamı lamel sopa. Oda sıcaklığında 5 dakika kurumasını bekleyin. Işıktan koruyun. Örnekler Aşağıdaki montaj -20 ° C'de saklanabilir.
  2. Görüntü edinimi: floresan algılama yeteneğine sahip, geniş bir alan mikroskobu kullanarak görüntüleri edinin. DNA'ya bağlanan Alexa Fluor boya ve Hoechst 33342 için yaklaşık floresans / uyarma Maksimum emisyon değerleri, Tablo 3'te gösterilmiştir.
  3. Performanssoğutmalı bir CCD kamera ile bir 40X/1.30 NA immersiyon yağı lens ve yakalama görüntüleri kullanarak m Görüntüleme.

4.. Veri Analizi

  1. Görüntü işleme yazılımı (Malzeme tabloya bakınız) öncesinde omero müşteriye ithal kullanarak Deconvolve görüntüler. Diğer tüm koşullar kontrol Normoksik hücrelerinden render ayarlarını uygulayarak mikroskop görüntü analizi ve görselleştirme yazılımı aynı deneyde tüm görüntüler için ayarları render normalleştirmek.
  2. Her görüntünün nükleuslann seçmek için mikroskop görüntü analizi ve görselleştirme yazılımları İlgi Of Bölgesi (ROI) aracı (Malzemeler tabloya bakınız) kullanın. Her ROI için ortalama yoğunluklarını elde etmek ve 30-50 hücreler arasında bir numarası dahil, yoğunluk analizi seçeneğini seçerek, her durum için ortalama ve standart sapma hesaplamak.
  3. Adım 4.2 t elde edilen tüm bireysel ortalama yoğunluk değerlerini komplo tarafından bir veri grafik yazılımı (Malzeme tabloya bakınız) kullanılarak Dağılım araziler Constructo, her koşul altında hücreler arasındaki değişkenlik göstermektedir. Alternatif ortalama ortalama yoğunluğunu artı doğmakta RNA standart sapmasını temsil çubuk grafikler oluşturun.

Sonuçlar

RNA görüntüleme kiti reaksiyonun bir şematik Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Biz kantitatif bir birey (tek hücreli) ve küresel düzeyde (hücre popülasyonu) hem hipoksi ile tedavi sonrası U2OS hücrelerde toplam RNA sentezini belirlemek için bu reaksiyonu kullanılır. Hücreler, hipoksi ve AB mevcudiyetinde kültürlenmiş ile muamele edilmiştir. Daha sonra sabit ve geçirgenleştirildi ve AB kuruluş bir azid içeren boya ile AB Kemoselektif ligasyonu ile tespit edilmiştir edildi. Bu tespit ve floresan ışık mikroskobu kullanılarak belirlenebilir bir floresan emisyon reaksiyon sonucu 'tıklayın'. Şekil 2A Bu deneyde tipik bir sonucu gösterir. Floresan etiketli hücreleri kırmızı yalancı ve görüntü uzaktan nesneler için açık mikroskopi ortamda (omero) açılmıştır. Bu mikroskop görüntü görselleştirme ve analiz yazılımı yerleşik bir bireysel alt hücresel yapılara, seçmek için kullanılabilir ROI aracıkantitatif kırıkları ve seçilen bölge içinde görüntü yoğunluğunu analiz. Istemci programda bu aracın kullanımından sonra, veri çıkışı tipik bir örneği, Şekil 2B'de görülebilir; bireysel hücre yoğunlukları veri geçerliliğini sağlamak için görsel bir kontrol olarak hizmet deney temsili bir görüntünün yanında gösterilir.

Tek tek hücre floresan yoğunlukları, tedavi edilen hücre popülasyonu içindeki tek tek hücre yoğunluğu dağılımını gösteren bir dağılım grafik olarak çizilebilir. Grafiğin Bu tür bir örnek, Şekil 2C'de görülür. Bu tedavi sonuçlarının hızlı bir karşılaştırma sağlar ve aksi açıkça standart veri temsilini kullanarak gizlenmiş bir tedavi hücre popülasyonu içinde önemli heterojenite göstermektedir çünkü bu şekilde yoğunluk veri komplo yararlıdır. Yanıt heterojenlik Bu deneyde ilginç muntazam hipoksik uyarıcı bir olmasına rağmen, çünkühücrelere pplied, aynı tek tabakalı hücre popülasyonundan her farklı bu uyarıcıya tepki olduğu açıktır.

Şekil 2B bizim deneyde genel sonuç gösteriyor. Bir tedavi nüfus içinde tüm hücrelerin ortalama flüoresan yoğunlukları ve daha sonra bu çubuk grafik olarak çizilmiştir. Bir student t-testi kontrolünden önemli ölçüde farklı olan her tedavi grubu arasında istatistiksel olasılığını hesaplamak için kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, bu veriler zamanlarda daha fazla 1 saat 30 dakika (U2OS hücreleri hipoksi ile muamele edilir zamanla küresel RNA sentezi istatistiksel olarak önemli bir artış olduğunu göstermektedir * p <0.01;. ** P <0.05 ve *** p <0.001 ve n> 30). Bu veriler, hipoksi tedavinin uzun süre sonra, hücre bile düşmanca hipoksik ortamda RNA üretimi üzerinde çabalarını odaklanmış göstermektedir. Aktinomisin D tedavi tamamen beklendiği gibi floresan ablates.

figure-results-1
Şekil 1. A. HIF sistemi, hücre oksijen değişikliklere cevap verir. Bu basitleştirilmiş şematik hipoksi olarak prolil hidroksilaz enzimler (doktora) ve von Hippel-Lindau protein (VHL) tarafından daha sonra polyubquitination tarafından HIF-α hidroksilasyon (-OH) engelleyerek HIF heterodimer dengeler. . B. RNA sentezi, Click-IT deneyi kullanılarak tespit edilebilir hücre hipoksiye hücre cevap yardımcı sayısız genlerin aktivasyonunda HIF stabilizasyon sonuçlar; hücreler tıklayın reaksiyonu floresan yoğunluğu ve ışık mikroskobu ile tayin edilebilir RNA sentezini algılar tedaviden sonra AB ile etiketlenmiş. daha büyük bir vers görmek için buraya tıklayınızBu rakamın iyon.

figure-results-2
Şekil 2.. Omero A. Screenshot RNA etiketleme aşağıdaki tipik mikroskobik çıktıyı göstermek için. Bu mikroskop görüntü analizi ve görselleştirme yazılımları hızlı bir şekilde dahili ROI makro kullanarak tek bir hücre düzeyinde yoğunluk veri elde edebilirsiniz. Bu komutun çıkış bir ekran B. Küresel RNA sentezi gösterilmektedir bir hücre yoğunluğu elde edilebildiği için, aralığı * p C. Bu toplam veri bir resmi temsil D görülebilir dağılım çizim görülebilir <0.01; ** P <0.05 ve *** p <0.001 ve n> 30. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Reaktifler Hücre Kültürü
Fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7,2-7,6
Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM)
Fetal dana serumu (FCS) filtre sterilize
Penisilin / streptomisin
L-glutamin
% 0.05 tripsin-EDTA (% 1)
% 70 etanol
Aktinomisin D (1 mcg / ml stok)
Hücre Kültürü Ekipmanları
Steril Pasteur Pipetler
Kültürde hücrelerin korunması ve tedavi edilmesi için uygun hücre kültürü-işlenmiş plastik eşya aralığı
Su banyosu, 37 ° C'de ayarlanmış
Laminer hava akış kaputu
Kuluçka 37 ° C'de,% 5 CO2 ayarlanmış
Hipoksi İstasyonu 37 ° C,% 5 CO 2,% 1 O 2 set
Cam lamelleri
hassas forseps
Hemositometre

Tablo 1. U2OS hücrelerinin kültür için gerekli Reaktifler ve ekipmanlar.

Reaksiyon Bileşenleri Lameller sayısı
1 2 4 5 6 10
Tıklayın-iT RNA reaksiyon tamponu (Bileşen C) 428 ul 856 ul 1.7 mi 2.1 mi 2.58 ml 4.3 mi
CuSO 4 (Bileşen D) 20 ul 40 ul 80 ul 100 ul 120 ul 200 ul
Alexa Fluor Azit (Adım 2.3 olarak hazırlanmıştır) 1.8 ul 3.7 ul 7.4 ul 9.3 ul 11.28 ul 18.8 ul
Tıklayın-iT reaksiyon tamponu katkı (adım 2.3 olarak hazırlanmıştır) 50 ul 100 ul 200 ul 250 ul 300 ul 500 ul
Yaklaşık Toplam Hacim 500 ul 1 mi 2 mi 2.5 mi 1.5 mi 5 mi

. Tablo 2. RNA görüntüleme kiti reaksiyon kokteyller: lekeli edilecek lamelleri sayısına göre RNA görüntüleme kiti reaksiyon için ana karışım bileşenlerinin oranını ayrıntılı Referans tablo.

Fluoroforun Uyarma (nm) Emisyon (nm)
Alexa Fluor 488 495 519
DNA'ya bağlanmıştır Hoechst 33342, 350 461

. Tablo 3 Floresan / uyarma Maksimum emisyon değerleri,: DNA bağlanmıştır Alexa Fluor ve Hoechst 33342 boya için yaklaşık floresans / uyarma emisyon maksimum.

Tartışma

Biz osteosarkom (U2OS) hücreleri RNA sentezi üzerine hipoksi etkilerini incelemek için bir RNA görüntüleme kiti bizim kullanımını tarif etmişlerdir. Bu teknik, nispeten basit olan ve tek hücre düzeyinde genel transkripsiyon ile ilgili verileri sağlar. Biz bir hipoksi odasında etiketleme dahil, bu kit için geleneksel protokolünü değiştirilmiş. Bildiğimiz kadarıyla bu hipoksi RNA sentezi değişiklikleri ölçmek için bu tekniğin kullanımı ilk rapordur. Hiçbir radyoaktif izotoplar gerektirir ve kontrollü atmosfer iş istasyonunda çalışma sınırlamaları ile teknik uyumlu olduğu için kullanılan RNA görüntüleme kiti hipoksi deney için uygundur. Bu teknik endişe verimli tespit ve numune etiketleme ile ortak sorunları. Bu PFA örnek taze ve numunenin düşük arka plan boyama sağlamak için tarif edildiği gibi 'tık' reaksiyonu takip yıkama adımlar gerçekleştirilir düzeltmek için kullanılan son derece önemlidir. Eğer background floresan bu aşama 2.7.4 sonra 1 ml RNA görüntüleme kiti Reaksiyon yıkama tamponuyla bir kez daha yıkama için tavsiye edilir bir sorun haline gelir.

Burada sözü RNA görüntüleme kiti kullanımı ve reaksiyon özgüllük ve hız kolaylığı açısından RNA görüntüleme teknolojisinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu teknik, öncelikle numune etiketlemek için gereken zaman ile sınırlıdır. RNA görüntüleme kiti, genellikle bu süre içinde oluşacak küresel RNA hızlı değişimlerin incelenmesini engelleyen bir 1 saat etiketleme süre gerektirir. Bu nedenle bizim ilk zaman noktası, 1 saat ve 15 dakika ile sınırlı olduğunu. Bu teknik, büyük ölçüde, örneğin, bu RNA görüntüleme kiti phalloidin lekelemesi ile uyumlu değildir, diğer floresan işaretleri ile uyumluluk reaktif madde ile ilgili birkaç diğer sınırlamalar ile ilişkilidir.

Hücrelerde RNA sentezini okuyan tüm mevcut yaklaşımlar içine tadil edilmiş nükleosidlerin dahil dayanmaktadırYeni oluşan RNA ve farklı yollarla dahil etiketlerin tespiti. Öncü yaklaşım otoradyografi ile algılama ve ardından radyoaktif işaretli RNA öncüleri kullanılarak dayanıyordu. Bu yöntem, hücre döngüsü aşamalarında ve diğer önemli bulgular bir keşfine yol açtı; Ancak, bu tür radyoaktivite çalışmaları, uzun pozlama süreleri ve otoradyografiye 6 düşük çözünürlüklü görüntülerinin hantal doğası gibi dezavantajları bir yeri vardır. Alanındaki bir sonraki önceden radyoaktivite gereğini ortadan kaldırmak için immüno-kimya araçlarını kullandı. RNA immunokimya tespiti ardından Bru katılmasıyla etiketli oldu. Bununla birlikte, etkili bir antikor, DNA ya da hücre morfolojisi kaybına sebep olmuş ve floresan etiketli antikorlar 13 ile ayrıca algılama önlenmesi, pek çok protein epitoplarının zarar RNA erişimi geliştirmek için nükleik asit denatürasyonu gerekli bağlanma. 'Tık kimya' teknolojisinin tanıtımı adım algılama ve t basitleştirilmişO prosedürü otoradyografi ve immüno-kimya ile karşılaştırıldığında. Bu teknoloji, 5-ethyniluridine terminal alkin, Cu (I) 'in varlığında, florofor ile konjuge azit ile bağlanan azid-alkin Hüsgen siklo reaksiyona dayanır. Reaksiyon, hızlı ve özel olan herhangi bir ek adımlar gerektirmez ve diğer hücre bileşenleri immunokimyasal tespiti kolayca uyumludur.

Bu RNA görüntüleme teknolojisi kullanılarak biz hücreleri, aynı tek tabakalı popülasyonda, hipoksiyaya tepki olarak farklı RNA sentez düzeyde olduğunu göstermiştir. Biz RNA üretiminin sadece etkisini incelemek için deney sınırlı; Bununla birlikte, bu RNA üretimi için daha karmaşık bir analiz için tadil edilmiş, çok katlı, ek tepkileri gerçekleştirmek için bu RNA görüntüleme kiti ile tamamen mümkündür. Örneğin, bu tür fosforlu RNA polimeraz II veya transla hatta bileşenlerinin düzeyleri gibi aktif transkripsiyon belirteçleri için özel bir antikor kullanılarak ikinci boyamaprotein dönüştürülür, bu yeni üretilen RNA miktarının bir göstergesini vermek tion amaçlı mümkündür. Örneğin aktin, hipoksi ile önemli ölçüde değiştirmemelidir bir protein gibi ek protein, ek bir kontrol olarak test edilebilir. Farklı hücrelerin farklı RNA sentezi oranları ve hipoksi bile farklı tepkiler olacağı çok muhtemeldir Dahası, farklı hücre tipleri, test edilebilir.

Bu RNA görüntüleme kitin kullanımı tarif edildiği gibi adımlar gerçekleştirilir Resim oldukça basittir. Protokolünde kritik adımlar hücre kaplama, hücre fiksasyon ve boyama ve görüntü alımı içerir. Bu önemli sonucu etkileyecek deney at üzerinde ya da altında birleştiği önlemek için tarif edilen yoğunlukta hücreleri plaka önemlidir. Bu alınan hücrenin en iyi 'anlık' sağlanması, taze fiksatif kullanmak ve bac azaltmak için boyandıktan sonra hücrelerin yıkarken dikkat çekmek için de önemlidiretkili bir analiz için kabul edilebilir bir düzeye kground. Son olarak, görüntü elde etme yöntemi sonraki analiz için yeterince iyi bir kalitede görüntüler elde etmek son derece önemlidir. Biz gibi optik dünyada en çok araştırma yoğun merkezlerinde kullanılan bu protokolde kullanılan mikroskop gibi örnekleri incelemek için mevcut en iyi ışık mikroskobu kullanmanızı öneririz.

Açıklamalar

JRS Glencoe Yazılım, Inc omero katkıda bulunan bir açık kaynak ABD merkezli ticari şirketin kurucusudur.

Teşekkürler

JB, Wellcome Trust doktora öğrencisi, SR laboratuvar bir CRUK Kıdemli Araştırma Bursu (C99667/A12918) tarafından finanse edilen AS, bir CRUK klinik üyesidir. Bu çalışma iki Wellcome Trust Stratejik Ödülleri (097945/B/11/Z ve 095931/Z/11/Z) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
U2OS Birincil HücrelerAvrupa Hücre Kültürleri Koleksiyonu92022711
PBSGibco14190094
DMEMGibco41966029
FCSGibco10270106
Penisilin/streptomisinLonzaDE17-603E
L-GlutaminLonzaBE17-605E
% 0.05 Tripsin-EDTA (% 1)Gibco25300062
Hipoksi odasıRuskinnInVivo2< / sub> 300
Click-iT test KitiInvitrogenC-10329 / C10330
pFASigma76240
Triton X-100SigmaX-100
10 M NaOHSigma72068
%37 HClVWR20252.335
VectaShield Montaj OrtamıVektör LaboratuvarlarıH-1400
Actinomycin DSigmaA9415
Deltavision Çekirdek MikroskobuUygulamalı Hassasiyet/A
softWoRxUygulamalı HassasiyetN/AMetinde görüntü işleme yazılımı olarak anılacaktır.
CoolSnap HQ2 CCD KameraFotometrisiN/A
Uzak Nesneler için Açık Mikroskopi Ortamı (OMERO)OMEN/AMetinde mikroskop, görüntü görselleştirme ve analiz yazılımı olarak anılır.
SigmaPlot v12.0Systat Yazılım A.Ş.N/AMetinde veri grafiği yazılımı olarak anılır.
N

Kaynaklar

  1. Kenneth, N. S., Rocha, S. Regulation of gene expression by hypoxia. Biochem J. 414, 19-29 (2008).
  2. Appelhoff, R. J., et al. Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor. J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).
  3. Lancaster, D. E., et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. Biochem J. 383, 429-437 (2004).
  4. Rocha, S. Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription. Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).
  5. Schodel, J., et al. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq. Blood. 117, (2011).
  6. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).
  7. Breinbauer, R., Kohn, M. Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry. Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).
  8. Wang, Q., et al. Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).
  9. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  10. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
  11. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nat Methods. 9, 245-253 (2012).
  12. Culver, C., et al. Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB. Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).
  13. Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry. Cytometry A. 79, 328-337 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H cre AnaliziHipoksi TedavisiClick iT RNA G r nt lemeFloresan MikroskobiEU nkorporasyonuYeni Sentezlenen RNA KantifikasyonuOksijen Kontroll al ma stasyonuU2 OS H creleristatistiksel Analiz

İlgili makaleler