İnsan endoskopik kafa tabanı yeniden fare modeli nazal mukozal greft kullanılarak beyin ve burun arasındaki yarı geçirgen bir arayüz oluşturur geliştirilmiştir. Bu yöntem, araştırmacılar, sistemik olarak uygulandığında, aksi takdirde, kan-beyin bariyeri tarafından hariçtir yüksek moleküler ağırlıklı terapötik maddelerin merkezi sinir sistemi teslim çalışma sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde Beyin Doğrudan İlaç Teslim heterotopik mukozal aşılanması Prosedürü
Bu makalede
Özet
Özet
Beyne terapötiklerin teslim kan dolaşımına ve beyin dokusu içine polar ve yüksek moleküler ağırlıklı bileşiklerin geçişini sınırlayan kan-beyin bariyeri (BBB) varlığı ile engellenmektedir. İnsanlarda bazı doğrudan dağıtım başarı transkranial kateter implantasyonu yoluyla elde edilmiştir; ancak bu yöntem son derece invaziv ve çok sayıda komplikasyonlar ile ilişkilidir. Daha az invaziv bir alternatif örneğin insanlarda endoskopik transnazal tümör çıkarma ameliyatı sonrasında kafa tabanı hasarlarını tamir etmek için kullanılan burun mukozası gibi ameliyatla takılan bir, yan geçirgen bir zar ile beyin doz olacaktır. Olsa ilaç transfer bu zar etkili BBB bypass ve beyin ve omurilik sıvısına doğrudan dağılırdı. Bu yaklaşım esinlenen, farelerde bir cerrahi yaklaşım Ekstrakranial cerrahi BBB defekti üzerinde engrafted bir donör septal mukoza zarı kullandığı geliştirilmiştir. Bu model, etkili bir şekilde gösterilmiştirbeyne yüksek molekül ağırlıklı bileşiklerin geçişine izin verir. Çok sayıda ilaç adayları BBB geçen aciz olduğundan, bu model nörolojik ve psikiyatrik hastalıklar için yeni tedavilerin klinik öncesi testler gerçekleştirmek için değerlidir.
Giriş
Nörolojik ve psikiyatrik hastalıkların tedavisi ciddi bir şekilde, merkezi sinir sistemi 1-3 ulaşan tüm olası farmasötik maddelerin% 95 in üzerinde önler, kan-beyin bariyeri (BBB) varlığı ile engellenmektedir. Örneğin, Glial nörotrofik faktör (GDNF) türetilmiş bu BBB 4-6 nüfuz edemez, çünkü sistemik olarak verilen, ancak etkisiz olan, beyin içine doğrudan enjekte edildiğinde, Parkinson hastalığının tedavisi için etkili olduğu gösterilmiştir.
Çok sayıda yaklaştı, bu sorunu aşmak için denemek için geliştirilmiştir. Neurotheraputics sistemik teslim İyileştirme beyin kılcal endotel üzerinde bulunan taşıyıcı proteinlerin seçici antikorları içeren ilaç konjugatlarını kullanılarak kanıtlanmıştır; Bununla birlikte, bu yöntem, farmasötik 7,8 geniş bir yelpazesi için geçerli olduğu gösterilmiştir edilmemiştir. Ayrıca, BBB ozmotik açılış kliniği kullanılır olmuşturilgi 9 beyin bölgesi için daha doğrudan teslim aksine müttefiki, ancak bu yöntem, sistemik ilaç doz muzdarip. Önemli çaba doğrudan beyni 10-12 hedefleme umuduyla transnasal teslim optimize girmiştir. Bazı başarılar elde edilmiş olmasına rağmen, kesin sonuçlar sadece Ensülin 13,14 gibi endojen reseptörleri sahip ilaçlar için elde edilmiştir. Ayrıca Transnazal teslim mekanizması koku nöron alımı yoluyla ya da kan dolaşımı 11 üzerinden beyne dolaylı giriş düşündüren kanıtlar tartışmalı olmuştur. Implante kateterler kullanılarak doğrudan, transkranial teslim ancak bu işlem oldukça invaziv ve çok sayıda komplikasyonlar 15,16 ile ilişkili olduğunu elde edilmiştir. Bugüne kadar, beyin içine, yüksek molekül ağırlıklı bileşiklerin sunmak için genel bir minimal invaziv bir yöntem yoktur.
Bir murin cerrahi işlem olup, burada sunulanbu beyin yarı-geçirgen bir arayüz oluşturur. Bu, bir fare, bir cerrahi kranyotomi kusur boyunca Mukozal zarı eksplant 17 aşılanması ile gerçekleştirilir. Bu prosedür kullanılarak, 500 kDa kadar çözünür bileşikler, bir zaman ve molekül ağırlığı 18 bağlı bir şekilde her ikisi de merkezi sinir sistemi (direkt olarak beyin dokusu içine yanı sıra, beyin-omurilik sıvısına) içine teslim edilebilir gösterilmiştir. BBB atlayarak Bu yöntem transnazal endoskopik cerrahi 19,20 aşağıdaki kafatasında delik onarmak için vaskülarize mukozal greftler kullanan insanlarda kafa tabanı defekt onarım için bir modeldir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Ameliyat öncesi yapılması gereken tüm prosedürleri IACUC ve herhangi bir ek etik ya da yasal yetkililerin tarafından onaylanmış ve insancıl hayvan tedavi uygulamalarını kullanmak emin olun. Bu, steril cerrahi koşullar kullanarak IACUC onaylı yöntem kullanarak fare anestezi, ameliyat sırasında veteriner merhem ile fareler gözleri yağlama ve cerrahi sonrası bakım sağlayan içerir. Prosedürün yönleri onaylanmış olup olmadığını herhangi bir soru varsa cerrahi ile devam etmeyin. Burada gerçekleştirilen tüm işlemler Boston Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1.. Hayvanlarının Hazırlanması ve Cerrahi Malzemeleri
- Ameliyat sırasında kullanılacak olan tüm cerrahi alet otoklavlayın.
- Yapılacak olan tüm teknikleri hayvan düzenleyici kurumlar tarafından onaylanan emin olun.
Mukozal Greft 2. Hasat
- Gibi benzer yaştaki bir genetik özdeş fare seçtideneysel fare ve (burada: servikal dislokasyon izofluran boğulma) IACUC onaylı yönteminde euthanize.
- Cerrahi makas kullanarak, kafatası açığa fare baş burun çevresinde cilt kaldırmak.
- Yanal burun bölgesini ve dik iki satır bağlayan gözlerle doğrultusunda üçüncü bir kanadını iki üç satır ile bir havalı matkap, işareti.
- Çevreleyen dokudan burun septum ayırmak için ventral detaya. Daha geniş bir yol ancak o da daha zor zar izole yapacak mukozal membran zarar görmesini engelleyecektir. Yakın orta hatta dar bir kesim tavsiye edilir.
- Buna yapışık bir dokudan serbest septum kesilmiş ve bir steril tuz çözeltisi içinde depolamak için makas kullanın. Bu anda greft herhangi bir bağlı doku kaldırmak kadar temizlenebilir. İdeal durum, hasarsız mukozal zarlar kıkırdak septum her iki yüzünde de sahip olmaktır. Bir grarka membran yüzey alanı, kraniyotomi siteleri karşılamak için yeterli olması şartıyla, iki fare için membran temin edebilir. Bu, mümkün olduğunca hızlı bir aşı olarak kullanılan ve araştırmacı en kısa sürede aşı izole edilir olarak 3 aşamasına ilerlemektedir önerilir.
Mukozal Greft 3. Cerrahi İmplantasyonu
- Standart, aseptik kemirgen cerrahi prosedürleri kullanılarak, uyutmak ve Stereolojik çerçeve içinde bir fare monte. Bir kemirgen anestezi makinesi kullanılarak saf oksijen yaklaşık% 2 izofluran kullanın.
- Kulak çubukları ve bir sivri tutucu ile bir stereotaksik cihazında fare hareketsiz. Gözleri oftalmik merhem sürün ve üç tur için Betadin ve% 75 etanol ile kafa derisi fırçalayın. Makas veya saç düzeltici kullanarak, kafasına kürk çıkarın. Bir jilet ile kafatası maruz ve kafa seviyesi. Dozlanacaktır beyin mahallinin üzerindeki bir kranyotomi gerçekleştirin. Örneğin, striatum hedeflerken bir 1.25 mm kesilmişpnömatik bir matkap kullanarak:;: (0.88 mm ML 1.00 mm AP merkezli) kafatası çaplı dairesel delik. Steril serum fizyolojik ile delinmiş bölgeyi ıslatın ve kafatası kaldırmak için bir jilet kullanın.
- Dikkatli bir iğne ucu kullanılarak dura kaldırın. Ayrıca, bu nemli dural yüzeyine doku yapıştırıcı en az bir miktarda uygulanarak gerçekleştirilebilir. Bu tabaka, sertleştikten sonra, bir traş makinesi bıçak ucu ile yanal hareket membran kaldırmak için kullanılabilir.
- , Yaradan uzakta bakan epitelyal yan tutmak için çok dikkat çekici beyin yüzeyi üzerinde mukoza zarı yerleştirin. Bu en iyi cımbız ile kranyotomi yerine bitişik kafatasının yüzeyine üzerindeki tüm septum aktarılmasıyla yapılır. Cerrahi makas bir çift ucu kullanarak, kıkırdak kapalı ve kafatası ve beyin yüzeyi üzerine bir membran çekin. Membran kurur ya da herhangi bir emici malzeme ile temas etmesine izin vermeyin. Greft cömertçe kraniotomi s tüm kemik kenarları üst üste gelmelidirite.
- Nitril steril bir parça ile greft örtün. Bu, iyileşme sırasında greft için derinin yapışmasını önlemek için hareket eder. Nitril, tüm mukozal membranı karşılamak için yeterince büyük olması gerekir. Gerekirse aşırı membran kesin. Bu greft temas sonra nitrilin bir hareket kaçının.
- Bir çalışan 5-0 steril dikiş ile cilt kapatın ve fare bir sonraki adıma geçmeden önce 3-7 gün boyunca kurtarmak edelim. Cilt kapatılması sırasında nitril bariyer veya mukozal greft perturb özen gösterin.
Doz Çözüm 4. İdaresi
- Stereotaktik çerçeve içinde anestezi fare güvence sonra, makasla dikiş kesilmiş ve kafatası çevresinde aşırı cilt kaldırmak.
- Nitril engel çıkarmak ve kafatasının yüzeyini temizlemek. Greft görünür oluncaya kadar bölgeyi temizlemek için steril tuzlu ve pamuklu çubuk kullanmayın. D den daha büyük bir artış gösterdi, bu bir jilet ile greft kesmek için gerekli olabiliryüzey alanı esired.
- Deney bir kaç gün daha uzun olacaksa, o kafa implant güçlendirmek için en az iki kafatası vidayı implant akıllıca olacaktır.
- Kenarları kafatası ile temas halinde olan, böylece greft üzerinde de yer verilmiştir. Kuyu ve kafatası arasındaki kavşakta cyanoacrylate yapıştırıcı uygulayın. Steril serum fizyolojik ile iyi doldurmak ve emin sızıntı olmadığından emin olmak için kontrol edin. Wells kesim şırınga iğneleri yapılır.
- Yerine kuyu sabitlemek için kafatası kemik çimentosu uygulayın.
- Bir pipet ile kuyudan tuzlu çıkarın. Bu yapıştırıcı istenilen çözüm ekleyin içeri sızdırılmış değil doğrulamak için de birkaç kez yıkayın; Bu durumda floresan dekstran 50 ul kullanılmıştır. Bu, benzer bir polariteye sahip suda çözünür bileşikleri, dekstran gibi aynı şekilde davranır beklenmektedir. Hidrofobik bileşiklerin ya da süspansiyonlar Gönderme Bu yöntemle incelenmiştir edilmemiştir.
- Sabitlenen nitrilin dairesel parça ile kuyunun üst kapaksiyanoakrilat yapıştırıcı kullanılarak üst. Yapışkan de içeriği ile temas etmediğinden emin olun.
Transmukozal Teslim 5. Analizi
- İstenen zaman süre geçtikten sonra fare anestezi ve Evan mavi bir boya çözeltisi ile de içeriği değişimi. Bu boya, aşı sağlam olduğunu doğrulamak için kullanılır.
- 30 dakika sonra, ağır fare uyutmak boya çözüm kaldırmak ve decapitation yoluyla euthanize.
- Elle implantı çıkarın ve cerrahi makas kullanarak beyin kaldırmak. Yerinde greft tutmak için dikkatli olun.
- Bir kez çıkarıldı, flaş dondurma izobütan çözeltisi içinde beyin kuru bir buz banyosu içinde soğutuldu.
- Optimal Kesme Sıcaklık 50 um de (OCT) çözeltisi ve dilim içinde beyin gömün.
- Bir mikroskop lamı üzerinde doğrudan istenen dilimleri yerleştirin.
- Görüntü kısa sürede Ekim çözüm kuruduktan gibi bir açma mikroskop kullanılarak dilim.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yeterince büyük bir nazal septum eksplant elde sonraki adımları için çok önemlidir. Bu, Şekil 1a'da gösterilen verici fare kafatasında bir yerde sondaj ile gerçekleştirilebilir. Şekil 1b de gösterildiği gibi, bu yol boyunca kesme yeterli büyüklükte bir eksplant üretecektir. Sondaj derinliği yeterince derin değilse, greft kesilmiş olacak ve beyin yüzeyini kaplamak için yeterince büyük bir zar elde etmek zor olacaktır. Daha fazla doku nazal septum üzerinde kalacaktır çünkü önerilen yo...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada tarif edilen prosedüre en zor adım beyin yüzeyi üzerine yeterli büyüklükte bir mukoza zarının başarılı transferidir. Hasat burun septum yeterince büyük ve iyi temizlenmiş ise bu adım önemli ölçüde daha kolay yapılır. Septum ventral kısmı kesilirse, yeni bir greft elde edilmelidir. Delme açısı mukozal membran matkap tarafından zarar görmediğinden emin olmak için fare kafasına dik olmalıdır. Daha geniş bir tavsiye daha sondaj yol alınırsa bu septum bağlı olduğu ekstra doku kaldırmak için çok daha zor olacaktır. Bağ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Benjamin S. Bleier MD, merkezi sinir sistemine ilaç verilmesinin geçici patent kaplama yöntemleri talebi mucidi.
Teşekkürler
Bu çalışma Parkinson Araştırma 2011 Rapid Response Yenilikler Ödülleri Programı için Mcihael J. Fox Vakfı tarafından finanse edildi. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fareler | Taconic | C57BL / 6 | |
| Isofluran | Piramal Sağlık Öğrenci | ||
| ince makas | Güzel Bilim Araçları | 91461-11 | |
| Pnömatik matkap | MTI Dental | 333-CB | |
| Matkap ucu | |||
| Forseps | Güzel Bilim Araçları | 91106-12 | |
| % 0.9 Sodyum klorür enjeksiyonu USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| Polistiren Petri kabı | Fisher | 08-757-12 | grefti geçici olarak saklamak için |
| Boncuk sterilizatörü | Güzel Bilim Araçları | 18000-45 | |
| Oksijen/İzofluran Sistemi | SurgiVet | V720100 | |
| Sıcaklık Kontrol Sistemi | Physitemp | TCAT-2LV | |
| Küçük hayvan stereotaksik alet | KOPF | Model 940 | |
| Göz merhemi | |||
| Elektrikli tıraş makinesi | |||
| Pamuk uçlu aplikatörler | Fisher | 23-400-106 | |
| %7,5 Providone iyot | Betadine cerrahi | ||
| ovma %70 Etanol | |||
| Cerrahi bıçak paslanmaz | Tüy | 2976 # 10 | |
| Neşter sapı - # 3 | Güzel Bilim Araçları | 10003-12 | |
| Kafatasını temizlemek için | % 3 Hydogen peroksit | ||
| Vetbond doku yapıştırıcısı | 3M | 1469SB | |
| İğneler | Becton, Dickinson and Company | 305176 | iğne ucu kesilmiş ve ayrıca kullanılan |
| Şırıngalar | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| Nitril eldivenler | Denville Scientific Inc | G4162 | greftin iyi kapatılması ve korunması için |
| 5-0 Naylon sütür ipliği | |||
| 91201-13 | |||
| Siyanoakrilat yapıştırıcı | iletişimsel olarak temin edilebilen süper yapıştırıcı | ||
| Diş çimentosu kiti, 1 lb, pembe opak | Stoelting | 51458 | |
| İzobütan (2-metilbütan) | Aldrich | M32631 | kuru buz banyosu için |
| Kuru buz |
Kaynaklar
- Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
- Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
- Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
- Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
- Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
- Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
- Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
- Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
- Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
- Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
- Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
- Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
- Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
- Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
- Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
- Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
- Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
