Yöntem makalesi

Nöbet gibi Aktivite Analizi ve Hareket için A Düşük maliyetli Yöntemi Drosophila

DOI:

10.3791/51460

⸱

19 Şubat 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Franciscan University of Steubenville, 2Department of Computer Science, Franciscan University of Steubenville

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özgür ve ucuz yazılım programları bir web kamerası ve bir arada kullanarak, Drosophila melanogaster lokomotif desenler hız, mesafe, ve çeşitli motor etkinlikler zamanında farklılıkları tespit etmek için analiz edilebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Video izleme sistemleri Drosophila melanogaster hareketini analiz ve lokomotif davranış çeşitli anormallikleri tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu sistemler davranışsal bilgi hazinesi sağlayabilir, bu sistemlerin maliyeti ve karmaşıklığı birçok laboratuvar için engelleyici olabilir. Biz, D. melanogaster lokomotif davranışı ve nöbet hareketinin ölçülmesi için düşük maliyetli bir analiz geliştirdik. Sistem mesafe hareket izlemek için ucuz ve serbest bir yazılım kombinasyonu kullanılarak işlenebilir görüntüleri yakalamak için bir web-cam kullanan, belirli bir zaman dilimi sırasında hareket ve hareket süresi, ortalama hız. Bu sistemin kullanılmasını göstermek için, D'nin bir grubu, 3-10 kat daha duyarlı nöbet benzeri aktiviteye (SLA) vahşi tip sinekler göre olan mutantlar, Bang duyarlı (BS) Felç melanogaster incelenmiştir. Bu yeni bir sistem kullanarak, tespit etmek mümkün olduğu BS mutant patlama anlamsız (BSS) vahşi tip sinekler daha yeni bir ortamda keşif hareketlilik düşük seviyelerini sergiler. Buna ek olarak, sistem yaygın tip II diyabet tedavisinde kullanılan ilaç metformin, BS mutantlar SLA yoğunluğunu azalttığını tespit etmek için kullanıldı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kısa ömürlü ve mevcut güçlü genetik araçlar göz önüne alındığında, Drosophila melanogaster çeşitli hastalıkların etiyolojisi ve çeşitli biyolojik süreçlerin temelinde yatan fizyolojisi araştırmak için mükemmel bir model sistemidir. Birçok durumda, bu davranış, genetik ya da farmakolojik işlemi bu model organizmaların 1,2 hareket yeteneği üzerindeki sahip olduğu etkilerini ölçmek için avantajlıdır.

Genel olarak, iki boyutta 3-7 uçucu hareket ölçmek için kullanılan çeşitli yöntemler vardır. Bu sistemler aynı anda birden fazla sinek izlemeyi desteklemek ve hız, rekor yol uzunluklarını ölçmek ve bir sinek hareketli geçirdiği zaman yüzdesini kaydedebilirsiniz. Onlar hareketlilik ve sinek hareketi 6-9 cinsel dimorfik doğası üzerine ilaçların etkileri dahil çeşitli bağlamlarda içinde hareketini incelemek için kullanılır olmuştur. Bu sistemlerin en önemli dezavantajı izleme sys maliyetidirtem veya ilgili yazılım ve kamera. Bazı durumlarda, bu dolar binlerce çalıştırabilirsiniz. Maliyet, sadece yeni izole edilmiş mutant lokomotif kalıpları miktarının belirlenmesi, örneğin, bu tür bir sistemin sınırlı kullanımı gerekir bir laboratuar için özel bir sorundur.

Daha basit ama daha az sağlam bir yöntem rekor hareketi, bir sinek, bir kapalı tüp 10,11 ortasına yerleştirilen bir kızılötesi ışın yolu haçlar kaç kere tabanlı sistemleri kullanmaktır. Bu tür sistemlerin hareket ve uyku-uyanıklık döngüsü hakkında değerli bilgiler verebilir iken, onlar sineğin gerçek yolu yakalamak için başarısız üzerinden veya tahmin hareketi altında çünkü. Ek yüksek çözünürlüklü yöntemleri bu sınırlamadan 12 denemek ve aşmak için kullanılmış olmakla birlikte, örneğin, tüpün uçlarında önemli bir hareket sergileyen sinekler gibi düşük hareket kaydedecektir uçar.

Basit ve ucuz hala geotaxi ölçmek cihazları tırmanıyors, bir tek tüp veya tüplerin 2,13 bir dizi sinekler yukarı doğru hareketi,. Bu tür sistemleri ucuz ve kolayca geotaxis kusurları tespit ederken, onlar araştırmacılar için ilgi olacağını hareketinin pek çok diğer yönlerini yakalamak için başarısız.

Birçok laboratuvar, set-up ve işletmek D. melanogaster suşları davranış farklılıkları karakterize için avantajlı bir araç olacaktır basit, düşük maliyetli sağlam analiz sistemi için. Burada az iki yüz dolar için set-up ve sineğin hareketinin yolu, hızı ve süresi hakkında bilgi vermek mümkün olabilir bir deneyi tarif. Tayinin etkinliğini göstermek için, bunun belirlemek için kullanılabileceğini gösteren verileri sunmak, nöbet ve ilaç metformin 2) yeteneği, açık olan bir Bang duyarlı (BS) mutant 1) bir lokomotor kusur hangi yaygın olarak nöbet benzeri etkinliği (SLA) i yoğunluğunu azaltmak için, tip II diyabet tedavisinde kullanılann iki BS mutantlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Bireysel hazırlanması Locomotion Testi için Sinekler

  1. Transferi hafifçe bireysel boş şişeleri içine dokunarak ve bir pamuk yumağı ile şişeleri kap ile uçuyor. Sinekler gözlem öncesinde rahatsız 20-30 dk bekletin. Daha önceki çalışmalar, anestezisiz sinekler 14 oranla anestezi poz davranışını değiştirebilir bulduk önce davranışsal gözlem saat içinde sinekler uyutmak değil önemlidir.
  2. Yavaşça şişeden sinek dokunun ve hava geçişini sağlamak için küçük yarıklar ile (5 mm yüksekliğinde), 5 cm çaplı Petri kapsamındaki bireysel sinekler yerleştirin. Alttan aydınlatmak ve Petri kabı üzerine monte edilmiş bir web kamerası kullanarak sinekler gözlemlemek.

2. Bireysel hazırlanması nöbet Testi için Sinekler

  1. İki günlük nöbet duyarlı sinekler Yem standart maya / mısır unu / agar ortam veya standart medya ya doğrudan ilaç ile birlikte karıştırılır. Burada sunulan veriler için, sinekler 1 gitmesine ya beslenen edildistandart medya veya metformin 25 mg ile karışık standart ortam 1 gr f.
  2. Sinekler bireysel boş şişeler içine nazik dokunarak bunları aktarmak ve bir pamuk yumağı ile şişeleri kap, medya ya da medya artı ilaç iki gün boyunca beslendi sonra. Sinekler gözlem önce 20 dakika süreyle rahatsız bekletin. Daha önceki çalışmalar, anestezisiz sinekler 14 oranla anestezi poz davranışını değiştirebilir bulduk önce davranışsal gözlem saat içinde sinekler uyutmak değil önemlidir.
  3. 10 saniye boyunca yüksek ayarı kullanarak bir laboratuar vortexer tek bir sinek içeren Vortex tek ampuller. Doğrudan kağıt üzerine monte edilmiş bir web kamerası altında kağıt boş bir beyaz kağıda hareketsiz sinek yerleştirin.

3. Video Kaydı

  1. HandyAvi yazılım programını kullanarak hareket veya SLA kaydedin http://www.azcendant.com/download.htm . Bu program web kamerası kullanıyorsakullanıcı ayarları dayalı görüntüleri yakalayabilir.
  2. Capture sekmesi altında Time-Lapse görüntüleri seçeneği penceresi açıldığında, yakalama aygıtı olarak web kamerasını seçin seçin. Çoğu deneyler için 640 x 480 video çerçeve boyutu yeterli değildir.
  3. Sıkıştırma için Intel IYUV codec seçin ve nöbet tahlil için 0.1 sn / kare seçebilir veya hareket tahlil için 0.1-0.5 sn / çerçeve seçmek. Gelişmiş sekmesinde, her yakalamak için bir. Bmp resim dosyası oluşturmak seçin ve o (Görüntü yığını) alır görüntüleri saklamak için program için bir klasör seçin.
  4. Kağıdın üzerinde bir ölü sinek yerleştirin. Video ayarları kutusuna tıklayın ve parlak beyaz arka plan ve koyu sinek ile açık bir karşıtlık olduğunu böylece Cihaz ayarları sekmesi altında ayarlarını.
  5. Kayda başlamak için start düğmesine tıklayın. Kayıt dönemi bittikten sonra, durdurma düğmesine basın. Görüntü yığını şimdi seçili klasörde olmalıdır. Not: Kayıttan önce, emin olun folGörüntü yığını için seçilen der boştur.

4. ImageJ kullanma Veri Analizi

  1. Indirilebilir açık NIH ücretsiz görüntü işleme yazılımı ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Not: Programı indirmek için ek olarak, MultiTracker plug-in indirilen ve de belirtildiği gibi monte edilmelidir http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
  2. Dosya sekmesini tıklayarak ve daha sonra ithalat → Görüntü dizisi seçerek ImageJ içine Görüntü yığını aktarın.
    1. Görüntü yığını içeren klasörü seçin, görüntülerden birini vurgulayın ve açık seçin. Bir Dizi Seçenekleri iletişim kutusu açılacaktır. Sayısal Sıralama adlarını tıklatın ve sonra Tamam 'ı seçin ve görüntü yığını ImageJ yüklenecektir.
  3. Eşik tüm görüntüler her sinek olmak beyaz bir arka plan oluşur, böylecesiyah bir nokta ile dönüştürüldü. , Bu süreci başlatmak Görüntü sekmesi altında Tipi → 8 bit seçerek bir 8-bit biçimine dönüştürmek görüntü.
    1. Yine Görüntü sekmesine tıklayın ve → Eşik ayarlayın belirleyin. Bu eşik noktası ayarlanabilir kesti hangi Eşik diyalog kutusu açılacaktır.
    2. Bir dilim siyah bir nokta yoksun eğer orada ekstra siyah noktalar veya görmek için görüntüleri ile tarayın. Bu durumda ise, bu sorunu hafifletmek için eşik ayarlayın. Genellikle uygun bir eşik değere programı, varsayılan olarak ayarlanması gerekmez.
      Not: yığını Her slayt sineğin konumunu temsil eden sadece bir siyah nokta olmalıdır.
    3. Eşik diyalog kutusunda uygulamak seçin ve diyalog kutusunu Maske için bir dönüştürme açılacaktır. Seçeneklerden herhangi birini tıklatın ama sadece eşik OK görüntü yığınını tıklatın etmeyin.
  4. Görüntü yığını eşikleyerek sonra, seçin MultiTracker plug-in Eklentiler sekmesi altında amacıylapiksel sineğin hareketini ölçmek. Nesne Tracker diyalog kutusu görünecektir.
    1. Diyalog kutusunda verilen dört tüm seçenekleri tıklatın ve ardından Tamam seçeneğini seçin. MultiTracker plug-in sonra her dilim siyah nokta için koordinatları eklemek ve Sonuçlar yanı sıra pencere piksel toplam yol uzunluğu bu listeler. Yollar penceresi sinek aldı yolun bir grafik görüntü verir.
    2. Sonuçlar penceresinden x-ve y-koordinatı listesini kopyalayın ve bir Excel tablosuna veri yapıştırabilirsiniz. Yığını herhangi bir slayt içinde siyah bir nokta yoksa, MultiTracker program o slayta durur. Bu durum ortaya çıkarsa, bu sağlamak için 4.2 ve yeniden eşik yığını adıma geri dönmek için gerekli olduğunu söz slayt siyah bir nokta olarak sinek kaydolur.
  5. Boş bir kağıt parçası üzerinde beyaz bir cm aralıklı iki nokta ayrı bir görüntü almak, yol cm piksel uzunlukları dönüştürmek için.
    1. Yukarıda izleyinadım (3.1-4.4.2), x belirlemek için, y piksel iki nokta koordinatları ve bir cm'ye karşılık piksel sayısını belirlemek için bu bilgileri kullanabilirsiniz. Bu dönüşüm faktörü cm olarak hareket verilerini oluşturmak için beş adımda kullanılır. Not: Bu yapıldıktan sonra, gelecekteki tüm kayıtlar için sabit kamera tutmak için önemlidir. Kamera taşınır veya ayarlanır Her zaman, bir cm piksel dönüştürmek için bu adımı tekrarlayın gerekiyor.
    2. Vücut pozisyonu ve ışık şiddeti / yansıması hafif dalgalanmalar görüntüleri eşikleyerek çıktığında oluşturulan siyah nokta boyutunu ve merkezini etkileyecek çünkü MultiTracker plug-in tarafından oluşturulan yol uzunluğu hareketi overestimates. Bu parazit sinek hareketin doğru bir tahminini elde etmek için uzaklaştırılmalıdır.

5. Excel kullanma Veri Analizi

  1. X serisi ithal tarafından kaydedilen verilerden gürültü çıkarmak, y MultiTracker pr tarafından oluşturulan koordinatlarıFly Analizi, yazarlar tarafından oluşturulan bir Excel Visual Basic programına Ogram. (Program yazarları başvurarak edinilebilir.)
  2. Click Me düğmesini tıklatın ve bir eşik değeri cut-off seçin. SLA analizi için 0.5 cm / sn bir eşik değer seçin veya hareket analizi için 0,1-0,3 cm / sn arasında bir değer seçin. Tamam'a tıklayın ve programın hız, zaman ve hareket mesafesini hesaplar. Not: Program sıralı 0.5-1.0 sn kutularına verileri değerlendirmek için bir sürgülü pencere analizi kullanır ve bu pencerede sırasında hızı hesaplar. Kullanıcı-tanımlı kesim üzerinde bir şey sinek hareketi olarak kabul edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada anlatılan teknik Drosophila BS mutantlar 1 SLA farklılıkları analiz etmek için daha önce kullanılan olmuştur. Burada sunulan sonuçlar kolayca şok BS suşları (EAS), patlama anlamsız (BSS), ve teknik nakavt (TKO) içerir. EAS eğrisi fosfatidil etanolamin 15 sentezinde rol oynayan bir kinaz kodlayan etanolamin ve tko lokus bir mitokondriyal riboprotein 16 kodlar. Bss mutasyon paralitik (para) voltaj-kapılı sodyum ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila da hareket veya hareket kalıplarını incelerken, bu kat edilen mesafe ile ilgili bilgiler, hareket hızı ve hareket deseni elde edebilmek için yararlıdır. Bu bilgileri ayıklamak için, pahalı ekipman geleneksel genellikle idareli 4,8,9 gibi deneylerin kullanmak isteyen küçük laboratuarları veya laboratuarları için yasak olduğu istihdam edilmiştir.

Burada tarif edilen deney, mesafe (Şekil 2 ve 6) hareketinin, seyahat hızı belirleme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ayrıca ince-ayar çalışmalarıyla bu deney için Kris Burner, Stephen McKinney, Laura Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer ve Megan Hyde teşekkürlerimizi ifade etmek istiyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Web KamerasıLogitechPro900Herhangi bir kaliteli web kamerası yeterli olacaktır.
HandiAVI time-lapse yazılımıAzcendant yazılımıEn son sürüm http://www.azcendant.com/
ImageJNIH'deEn son sürüm http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Multiracker Plug-InNIH'deEn son sürüm şu adreste bulunabilir: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html
VortexerVWRVortex Genie 2Vortex Genie 2 gibi standart boyuttaki girdapların çoğu yeterli olacaktır.
5 cm Petri kabı kapağıLabM LimitedD011Hareket tahlilinde bir arena için daha küçük veya daha büyük Petri kabı kapakları kullanılabilir.
Işık kutusuözel yapımHurda malzemeden üretilmiştir. Aydınlatma, hareket testi için kullanılır. Oda aydınlatmasına bağlı olarak, testi ışık kutusu olmadan da yapmak mümkündür.
bulunabilir bulunabilir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in. 1496, 94-103 (2013).
  2. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).
  3. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  4. Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).
  5. Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).
  6. Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, (2002).
  7. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
  8. Martin, J. R. A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).
  9. Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila. J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).
  10. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13, 489-499 (2012).
  11. Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour. PLoS One. 5, (2010).
  12. Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program. PLos ONE. 7, (2012).
  13. Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia. Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).
  14. Seiger, M. B., Kink, J. F. The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila. Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).
  15. Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis. Cell. 79, 2333 (1994).
  16. Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12. Cell. 51, 165-173 (1987).
  17. Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. , 187-534 (2011).
  18. Hardie, D. G. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).
  19. Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila Hareket AnaliziWeb Kameras TakibiImage J lemeSinek Analiz Yaz l mLokomotor DavranBang hassas MutantlarMetformin TedavisiVideo KaydVeri Analizi

İlgili makaleler