Retinoik asit ile osteoblastların primer fare tedavisi kemik hücresinin morfolojik ve moleküler özellikler taşıyan dallanmış homojen bir hücreler popülasyonu üretir. Yöntem, elde edilmesi ve kültürü birincil kemik hücresinin korumanın zorluğu üstesinden gelir ve transjenik modelleri türetilen hücreler çalışma avantajlı olabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İlköğretim Fare Osteoblastlar gelen osteositlere Kültürler Edinme Retinoik Asit Uygulama
Bu makalede
Özet
Özet
Osteosit kültürleri için olan ihtiyaç iyi kemik araştırmacıların eden bilinmektedir; Birincil osteositlere izolasyonu zordur ve düşük hücre sayıları üretmektedir. Bu nedenle, en yaygın olarak kullanılan hücre sistemi osteosit benzeri MLO-Y4 bir hücre hattıdır.
Burada tarif edilen yöntem, morfolojik ve moleküler osteosit özelliklere sahip dallanmış homojen bir hücreler popülasyonunu üretmek üzere retinoik asidin kullanılması anlamına gelir.
Fare kafatası alınan osteoblastların izole edildikten sonra, bütün-trans retinoik asit (ATRA) hücre ortamına ilave edilir ve hücre izleme ters döndürülmüş bir mikroskop altında her gün yapılır. Üretim morfolojik değişimler tedavi ve farklılaşma 2 gün sonra tespit edilebilir dendrit hücre dışı matrisi üretme yeteneği kaybı, osteoblast belirteçlerin aşağı-regülasyonu ve ilerleyici gelişmesiyle birlikte, 5 gün içinde tamamlanır yukarı-regülasyonu osteosit özgü moleküllerin. içeriği "> günlük hücre izlenmesi için birincil hücrelerin doğal değişkenlik gereklidir ve protokol, farklı fare türlerinden elde edilen ve transjenik modelleri uygulanan hücrelere, minimal değişiklik gösteren uyarlanabilir.
Yöntem, gerçekleştirilmesi kolaydır ve özel aletler gerektirmez, bu yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu ve hızlı bir şekilde sınırsız biyolojik uygulamalarda bu hücrelerin kullanımına izin veren, hücre dışı matrisin tam yokluğunda olgun osteosit nüfus oluşturur.
Giriş
Kemik hücresinin, en bol kemik hücre tipi, derin iskeleti içinde yer alan büyük ölçüde dallanmış hücreler, terminal olarak farklılaşmış bulunmaktadır. Olgun osteositler ait hücre vücut kemik boşluklar içerdiği ve çeşitli şekillere sahip olan; yuvarlak osteositlerde trabeküler kemikte 1 daha sık iken uzun hücre organları ile osteositlerde, kortikal kemik bulunur. Dallı dendritler diğer kemik hücresinin ile değil, aynı zamanda diğer kemik hücre türleri, kemik iliği, kan damarları ve ilgili perisitlerin ile sadece birden fazla kişi karmaşık hale getiren bir ağ-yapının oluşturulması, kanalcığı adı verilen küçük kanallarda hücre gövdesinden uzanan ve bulunur. Boşluklar ve kanalcık içerdiği interstisyel sıvının sayesinde, osteositler nedenle lokal hem de sistemik etkinlik, ya da tam tersi davranışları hem lokal hem de sistemik değişikliklerle 2 ile kontrol edilebilir, sadece etkileyebilir, aynı zamanda sonuçta dolaşım sistemine bağlanmıştır.
kemik hücresinin çalışması son zamanlarda, bu tür doku-ve hücreye özel transgenik hayvanların üretimi, güçlü mikroskopi teknikleri ve yüksek verimli tarama moleküler 3,4 kullanımı gibi çeşitli teknik ilerlemeler, sayesinde ivme kazanmıştır. Bununla birlikte, bu hücrelerin bilgisi esas olarak vitro modellerde yeterli göreli azlığı, yine eksik. Aslında osteositlerde nedeniyle derin konumu elde etmek ve kültür korumak için her zaman zor olmuştur, ve böyle bir farklılaşmış hücre tipini karakterize çoğalma düşük seviye var.
Genellikle düşük verimli olduğu hücre ve hatta birkaç kirletici fibroblast hızla osteositler 8 büyümek doyurmaya riski taşıyan da yıllar boyunca, bir dizi yöntem, birincil kemik hücresinin 5-7 izole etmek için geliştirilmiştir. Bu nedenle, in vitro çalışmalarında en deneysel köklü osteosit hücre l hakkında şu ana kadar yapılmıştırine MLO-Y4 9.
Ek in vitro metodolojiler bu hücreleri okuyan olasılığını artırabilir ve osteosit biyoloji ve patofizyolojinin analizini artırabilirsiniz. Büyük ölçüde kabul edilmesi, bu tür yöntemler çoğaltmak kolay olmalı ve hücre olgunlaşmasını ulaşmak için özel aletler ya da çok uzun bir süre gerektirecektir olmaz. Birincil hücreleri varsa da önemlisi, bu mümkün transgenik hayvanların yararlanmak olur. Yakın zamanda osteoblast hücre hattı MC3T3-E1 ve retinoik asit ile tedavi, birincil osteoblastların osteositler 10 morfolojik ve moleküler özellikler taşıyan dallanmış homojen bir hücreler nüfus gelişimine yol açan hızlı bir fenotip değişikliklerini oluşturmaktadır anlatılmıştır.
All-trans retinoik asit (ATRA), nükleer retinoik asit reseptörleri (RAR'lar) bağlanmak suretiyle gen transkripsiyonunu düzenler A vitamini aktif bir metabolizma ürünüdür. RAR'larsonuçta retinoik asit (RA)-duyarlı hedef genler 11 modülasyonu yol açan, retinoid X reseptörleri (RXR'ler) ile heterodimerler olarak DNA'ya bağlanır. ATRA gibi nöronal hücre 12 ve 13 gibi diğer podocytes dallanmış hücreler, aralarında, çeşitli hücre tiplerinin farklılaşmasını ve olgunlaşmasını modüle ettiği gösterilmiştir.
Burada tarif edilen yöntem, birincil osteoblastların için ATRA eklenmesi dayanmaktadır. Etkili olmak için, ATRA tanımlanmış bir yoğunlukta kaplama hücreleri üzerinde kesin bir olgunlaşma safhasında ilave edilmesi gerekir; deneyimlerimiz bu koşullar osteoblast gelen osteositlere için fenotip anahtarını elde etmek için önemlidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Ulusal ve bilimsel amaçlar için kullanılan ve inceledim ve Milano Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylanmış hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa yürürlükteki mevzuata göre yapılmıştır.
İlköğretim Osteoblastlar 1. İzolasyon
Bir yöntem olup, küçük bir modifikasyonla, Dodig ve arkadaşları 14 tarafından tarif edilen prosedür takip eder.
- % 0.1 kollajenaz P ve% 0.05 ekleyerek, orta sindirilmesi hazırlayın HBSS ortamı (Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi, herhangi bir kalsiyum, magnezyum, ya da fenol kırmızı) için (% 2.5 tripsin 10X, fenol kırmızı başlayarak) tripsin.
- 3-4 gün eski fareler kullanın (prosedür 1 fare gibi kaç uygulanabilir).
- Başları kesilerek kurban. % 70 etanol ile baş Sprey ve buz üzerinde tutmak. Cımbız ve diseksiyon / cerrahi makas ile deri ve kas tabakaları çıkarın.
- Yavaşça parietal kemikleri kaldırmak veiki devrede de gol sagital sütür izleyerek onları ayrı. Emin kemikleri sütür ve herhangi yapışık doku ücretsiz yapmak ve prosedür tamamlanana kadar HBSS ortamı içeren plakalarda bireysel kemik parçaları yerleştirin.
- HBSS atın ve her bir ekle 37 ° C de 15 dakika boyunca ortam sindirerek
- Süpernatant atın.
- Tekrar 37 ° C'de 15 dakika boyunca orta sindirerek ekleme
- Bu kez süpernatan kaydetmek ve% 10 FBS (Fetal Sığır Serumu) ve% 1 streptomisin / penisilin ile desteklenmiş a-MEM (Minimum Essential Medium) yerleştirin.
- Tekrar 1.7 ve 1.8 2x adımları.
- 5 dakika boyunca 425 g'de santrifüj ile üç toplanan fraksiyonları, spin hücreleri havuzda toplayın, süpernatantı atmak hücre pelletini için katkılı a-MEM içinde 3 ml ekleyin ve transferi 25 cm2 şişeye.
- Enkaz ve ölü hücreleri çıkarmak için, 24 saat sonra ortam değiştirin.
- 50 ug / ml, askorbik asit (AA) ve gly 3 mM eklemegliserin 2-fosfat disodyum tuzu, alfa-MEM ortamına hidrat (GP).
- Bundan sonra, her gün (alfa-MEM artı AA / GP) orta değiştirmek.
2.. ATRA Protokol
- Etkisiz hale getirilmesini önlemek için, karanlık bir odada ATRA (all-trans retinoik asit) tüm deneyler.
- HBSS ortamı içinde, 1X Tripsin çözeltisi hazırlandı ve kullanılana kadar 37 ° C'de tutun.
- Birlikte akan hücreler arasındaki orta çıkarın ve dikkatli bir şekilde HBSS ile yıkayınız.
- 1 ml tripsin ekleyin, yavaşça tüm hücreler, tripsin ile kaplı izin vermek için şişeyi döndürmek ve 37 ° C'de 3 dakika boyunca inkübe
- Bir ters mikroskop altında hücre gerçek ayrılması için kontrol edin.
- Tripsin inaktive alfa-MEM ortam maddesi 3 ml ilave edilir.
- Hücreleri yeniden elde etmek ve 425 g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
- Taze ortam içinde hücre pelletini.
- Bir hemositometre sayım odasında bir damla yerleştirin, birkaç dakika boyunca yerleşmek için izin ve ce saymakll numarası.
- 10,000 hücre / alfa-MEM plus AA / GP ile 2 cm 'lik bir yoğunlukta 25 cm2 şişelerde yer hücreler. Hücre yoğunluğu hücre süreçlerinin ve hücreler arası temasların optimum gelişimi ile ilgili olduğunu unutmayın. Bir başlangıç yoğunluğu daha yüksek 10,000 hücre / cm 2 hücre süreçlerini uygun gelişimine zarar, ancak daha düşük hücre sayıları nedeniyle arası temasların olmadığı için, prematüre hücre ölümüne neden olabilir.
- Her 24 saat ortama 5 uM ATRA ekleyin.
- Morfolojik değişiklikler genellikle 48 saat sonra gözlenir: morfolojisini değerlendirmek için günlük hücreleri izleyin. Ilk 24-48 saat sonra, hücreler hala çoğaldığında,, yukarıdaki yoğunlukta replate. Olgun osteositler homojen bir popülasyon 4-5 gün sonra da rastlanmaktadır. Ihtiyaçlarına bağlı olarak, 12-15 gün öncesine kadar, herhangi bir zaman noktasında hücreleri kullanır.
- Hücreleri (örneğin lamelleri ya da plakalar gibi) başka destekler üzerine plakalanır edildiği zaman, yukarıda yoğunluğu muhafaza emin olmak vekullanıma kadar ATRA her 24 saatte eklemeye devam. Deneyden önce en az 24 saat boyunca yeni destek uymak hücreleri bırakın.
3. İmmünoboyama
- Immün için, lamelleri hücreleri plaka ve (Burry 15 örneğin bakınız) kuruldu metodolojileri izleyin.
- Örneğin dolaylı immünofloresans için, 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında, karanlıkta, ikincil floresan etiketli antikor ile daha sonra, nemli bir bölmede 1 saat boyunca oda sıcaklığında primer antikor ile inkübe sekans,% 4 paraformaldehit veya soğuk aseton içinde çözmek nemlendirilmiş bir odada.
- Nükleer counterstaining için DAPI veya analogları kullanın ve orta anti-solmaya montaj.
4. Alizarin Red Boyama ve Ekstraksiyon
- Lamelleri hücreleri plaka.
- 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde lamel içine daldırarak hücreleri sabitleyin.
- Alizarin kırmızı boyama çözeltisi bir damla (1 mg / ml, pH 5.5) ile hücrelerin Kapak30 dakika karıştırıldı.
- Musluk suyu ile lamelleri yıkayın. Cam slaytlar gliserol bir damla ile montaj ve dik bir 10X olarak mikroskop ve 20X büyütme ile görüntü alabilir.
- Yukarıdaki prosedür sonra, musluk suyu içindeki slaytlar daldırarak lamelleri geri.
- Bir oyuklu bir plaka içerisinde her bir lamel koyun.
- % 60 perklorik asit (miktar tamamen hücreleri karşılamak için yeterli olması gerekir) ekleyin ve hafif çalkalama ile 4 ° C'de O / N bırakın.
- 450 nm dalga boyunda spektrofotometri ile süpernatantın optik yoğunluk okuyun.
- Hücre sayısı değerlerini normalize etmek için, 10 dakika boyunca bir hücre preparatının kapsayacak şekilde Janus Green (PBS içinde% 0.2 çözelti) ekleyin.
- Ultra-saf su ile dikkatlice yıkanır.
- 0.5 N HCI (miktar tüm hücreleri karşılamak için yeterli olması gerekir) ekleyin ve bir kaç saniye boyunca elle hafifçe çalkalanır.
- Spektrofotometre ile 615 nm'de emicilik ile oku.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sonuçlar 5 ila 10 bağımsız deneyler için kullanılmıştır.
Hücre Morfoloji
AA / GP birincil hücreler çoğunlukla arnavut kaldırımı gibi özellikler, olgun osteoblastlar özelliği var tedavi. Serpiştirilmiş dallanmış hücreleri (Şekil 1A kırmızı oklarla gösterildiği gibi) büyük olasılıkla bir kemik hücresinin temsil ettiği, bulunabilir.
ATRA tedavisi ile, hücreler hızla genellikle 2 gün sonra gözlenen etkileri, görüntülemeye başla...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Son yıllarda osteosit kemiğin en merkezi hücre olarak ortaya çıkmıştır. Araştırma gelişmeler kademeli kemik hastalıklarının çeşitli için yeni ve daha iyi tedavi tasarımı için çok büyük bir değer olan, daha önce ya da umulmadık kanıtlanmamış osteosit özellikleri, bir çok açıklayıcıdır. Bununla birlikte, osteosit biyoloji araştırılması osteosit benzeri hücre hattı MLO-Y4 yayınlanmadan önce osteoblastlar, uzun bir süre boyunca taşıyıcı hücre olarak kullanılmış olduğu bir düzeye kadar in vitro modellerin sınırlı sa...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Finansman "Progetto bir Concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" MD, ve Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano tarafından sağlandı
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kollajenaz P | Roche Uygulamalı Bilimler | 11213857001 | |
| Tripsin | Gibco, Yaşam Teknolojileri | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Yaşam Teknolojileri | 14175129 | 37 ° C'de ön ısıtma; |
| Alpha-MEM | Invitrogen'i kullanmadan önce C, Life Technologies | 22571038 | 37 ° C'de ön ısıtma; Kullanmadan önce C |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomisin/Penisilin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Askorbik asit | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Gliserol 2-fosfat disodyum tuzu hidrat | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | ATRA'yı ışıktan |
| koruyunParaformaldehit | Sigma-Aldrich | P6148 | Kullanmadan önce PBS'de çözün ve süzün. Daima kimyasal bir başlık altında çalışın. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | İkincil antikora eklenebilir |
| Alizarin kırmızısı | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perklorik asit | Sigma-Aldrich | 176745 | Dikkatli kullanın (cilt ve göz koruması önerilir) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dikkatli kullanın (cilt ve göz koruması önerilir) |
| Gliserol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Ekonomi Cımbızı #7, 0,40 x 0,5 mm uçlar | Dünya Hassas Aletler | 501981 | |
| Ekonomi Cımbızı #4, 0,40 x 0,45 mm uçlar | Dünya Hassas Aletler | 501978 | |
| Diseksiyon Makası, düz, 10 cm kavisli | World Precision Instruments | 14394 | |
| Cerrahi Makas, 14 cm, düz, S/S | World Hassas Aletler | 501218 | |
| Kültür şişeleri | Corning | 430168 | |
| Kuyu plakaları | Corning | 3335 | |
| Thermanox lameller | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Mikroskop | Zeiss Apotom | ||
| Spektrometresi | Safas Xenius |
Kaynaklar
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. Osteocyte isolation and culture. Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).
- Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
