Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve Ex vivo Fibroblastlar

Özet

Sentetik, doku mühendisliği kolorektal kanser modelleri, lazer microdissected stroma hücreleri ve moleküler profil invaziv ön ve kanserle ilişkili stromal hücre tümör hücreleri arasındaki ara yüzeyde ayırt edici karakterize biyoloji ve incelemek için bir yeni ve manuel olarak kullanılabilen bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Özet

Kolorektal kanser işgalci (CRC) hücreleri, onların kardeş hücrelerden kurtulma stromayı sızmak ve hücre dışı matris (ECM) bozulmasina kapasitesini elde etmiş. Bu hücre fenotipik ayrı grubun biyolojisini karakterize ölçüde metastatik kaskad sırasında erken olayların anlayışımızı geliştirmek olabilir.

Tümör işgali malign epitel ve kanser bağlantılı stroma arasında çift yönlü etkileşimler tarafından kolaylaştırdı dinamik bir süreçtir. Bu ko-kültür ve lazer mikro-disseksiyon teknikleri Organotipik kombine tümör stroma-arayüzünde hücreye özel tepkileri incelemek amacıyla.

Fibroblastlar gibi önemli stromal bileşenleri 3-dimentioanally kanser epitelyal hücrelere sahip ortak-kültürlenir, olduğu Organik tip modeller, yakın pH incelenecek istila ve kansere stroma etkileşimi sağlayacak yüksek manuel olarak kullanılabilen deneysel araçlardırysiological koşulları.

Lazer mikrodisseksiyon (LMD) mikron düzeyinde hassasiyetle tümör dokusu içinde çeşitli katmanlarının cerrahi diseksiyonu ve çıkarma, gerektiren bir tekniktir.

Genomik Transkriptomik ve epigenetik profilleme ile bu teknikleri birleştirerek biz tümör hücreleri istila ve stromal doku çevresindeki moleküler özelliklerine daha derin bir anlayış geliştirmek ve bunu yaparken de potansiyel yeni biyomarkerler ve CRC ilaç gelişimi için fırsatlar ortaya hedefliyoruz.

Giriş

Organik tip ko-kültürler bu temel hücre-dışı matris bileşenlerini ihtiva eden bir ^1-3 kollajen jel habis epitel hücreler ve stromal hücrelerin yan yana 3-boyutlu olarak in vivo tümör mikro-ortam içinde yeniden yardım doku mühendisliği modellerdir. Prensip olarak tümör istilasını ölçülmesi için bir yöntem olarak tasarlanmış, organotypics in vivo hayvan modellerinde bağımlılığı azaltmak ve bu bezine akın eden hücre, bir mono-dağılmış halde ^2-4 içine yapay karşıya hareket ettiği Transwell tahlilleri, in vitro olarak, diğer tekniklerin eksikliklerini kaçının. Fibroblastlar gibi, bu modellerde görülen stromal hücreleri dahil, malign yayılma ve metastaz ^3-4 düzenlenmesinde tümör mikro-ortamınm rol yansıtır, ancak stroma fenotipik hetero gibi olduğu organotipik fizyolojik önemi maksimize etmek için modeller, hedef organ, anatomik olarak doğru bir ex vivomümkün olan her yerde ^3,6 fibroblastlar dahil edilmelidir.

Organotypics tümör ve stromal hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için çok yönlü bir platform vardır ve giderek kimyasal inhibitörlerinin tümör işgali üzerine etkisini ve hedeflenen gen değişiklikleri ^7,8 incelemek için yeni yollar kullanılır. Invaziv tümör marjı incelenmesi özellikle heyecan verici bir görünüm sergiliyor. Organotipik modellerinde, kurulan kolorektal kanser (CRC) hücre çizgileri, tipik olarak iyi tabakalı epitel tabakası üretir ve kesit olarak, hücre dışı matris (ECM) işgal kapasitesi kazanmış hücreler kolay bir şekilde görülebilir. Lazer mikrodiseksiyon kullanarak ve izolasyon bunları okuyan bu hücreleri ayıklanması tümör ve in vivo tümör ilişkili stromal hücrelerinin kurulan mikro-topografik düzensizliğin ışığında, kolorektal kanser metastaz kökeniyle ilgili önemli biyolojik anlayışlar ortaya koyabilir ve nasıl daha verimli olabilir hedeflenmiş. Benn aşağıdaki metodoloji, doku yazılı onam sağlanan örnekleri ve çalışma bağışlanan tüm hastalar bölgesel araştırma etik komitesi kurumlar tarafından onaylanmıştır.

Protokol

Kolon Eksplantlarından Primer Fibroblast Kültürleri 1.. Kurulması

1. Doğrudan cerrahi ameliyathanede normal insan kolon mukoza dokusu örnekleri elde edilir ve 7-10 içinde askıya PBS ml 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve / ml Fungizone, 0.25 ug ile takviye edilmiştir.
2. Laboratuarda, 10 cm'lik bir doku kültürü çanağı merkezinde numune yerleştirin ve PBS / Pen-strep / fungizon ile 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra aspire etmeyin.
3. Steril forseps ve neşter ile (yaklaşık 2mm) küçük parçalar halinde doku kesilir ve 12 plaka olarak neşter ile çizilmiş bir haç merkezine her bir parçayı yerleştirin. Yapışması sağlamak için doku üzerinde hafifçe neşter sallayın.
4. Kültür 750 ul numuneler birinci fibroblast büyüme ortamı subme gerekir, (DMEM,% 20 fetal buzağı serumu (FCS), 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 292 ug / ml L-glutamin ile takviye edilmiş)float etkinleştirme olmadan doku RGE. 2 günde yeniden besleme dışında önümüzdeki 5 gün içinde plaka rahatsız kaçının.
5. Sonraki 5 gün boyunca yavaş yavaş fibroblastlar doku kenarından dışarı büyümeye başlar. Yaklaşık 7 gün, bu daha görünür olacak. Dışarı büyüyen yeterli fibroblastlar varsa Yaklaşık 3-4 hafta sonra, ve, her bir oyuğa 750 ul tripsin eklemek. Hücreler T-25 doku kültürü şişesi, havuz ve transfer (5-10 dk sürebilir) müstakil sonra.

2.. Organotipik Hazırlık

Fibroblast emprenye organotipik jelin hazırlanması:

1. % 10 FCS ve 292 ug / ml L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM içinde Organotipik başına 5 x 10 ⁵ hücre ihtiva eden bir fibroblast hücre süspansiyonu hazırlayın.
2. Aşağıdaki oranlarda, buz üzerinde organotipik jeller Makyaj:
   • Rat-Kuyruk Kollajen 7 hacim: Matrıgel karışımı (1:1)
   • Süzüldü 10x DMEM 1 hacim
   • FCS 1 hacim
   • ⁵ x 10 5 fibroblastlar içeren fibroblast hücre süspansiyonu, 1 hacim
     9 jeller (jel başına 1 mi) 10 ml hazırlamak ve kabarcıklarını önlemek için yavaşça karıştırın.
3. , 24 oyuklu plakanın her oyuğuna 1 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 1 saat boyunca kuluçkaya bırakınız Jeller ayarlaması için nemli bir atmosferde C °. 1 saat sonra, jellerin üzerine 1 ml DMEM (% 10 FCS) / Glut ekleyin ve gece boyunca inkübatör dönün.
4. Ertesi gün, jeller ve ⁵ x 10 5 CRC epitel hücreleri ihtiva eden ortam plaka 1 ml üst aspirat ortamı.

Jel kaplı naylon Formlarının hazırlanması:

5. , 1.5 cm boyutlarında otoklavlanmalıdır naylon sayfaları peşin, 1.5 cm x steril hazırlayın.
6. Steril forseps kullanarak, 10 cm kültür çanak (genellikle 4 naylon yaprak çanak başına kalabilirler) naylon yaprak gerekli sayıda koyun.
7. Aşağıdaki sırayla, buz üzerinde jel Makyaj (250 ul toplamhacim) naylon tabaka başına gereklidir:
   • Rat-Kuyruk Kollajen 7 hacimleri
   • Süzüldü 10x DMEM 1 hacim
   • FCS 1 hacim
   • 1 DMEM hacmi,% 10 FCS / Glut
8. Çözelti, sarı ise, çözelti donene kadar 50 ul alikolar içinde 0.1 M NaOH ilave edilerek etkisiz hale getirir.
9. Her bir naylon tabaka için, bu çözeltinin 250 ul ilave edin ve 37 ° C'de inkübe ° C jel ayarlaması için 30 dakika boyunca% 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosferde.
10. PBS içinde% 1 glutaraldehid çözelti hazırlayın. Jel belirledi bir kez, her 10 cm kültür tabağına 10 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
11. Yıkama naylon levhalar PBS ve DMEM içinde 1x (% 10 FCS) / Glu içinde 3 kat ve 4 ° C de DMEM / Glu içinde gece boyunca inkübe

Işgali için çelik ızgaralar üzerine organotipik jeller Raising:

12. Tripod oluşum içine paslanmaz çelik levhalar katlayarak iskele ızgaralarını hazırlıyor. Kullanmadan önce otoklav.
13. Altı çukurlu bir levhanın her bir kuyuya bir çelik ızgara yerleştirmek için, etanol içinde sterilize forseps kullanın.
14. Her ızgara üzerine, üst kollajen tarafı ile bir jel kaplı naylon yaprak yerleştirin.
15. Dikkatlice etanol steril bir spatula kullanılarak yükseltilmiş naylon tabaka için 24 oyuklu plaka Organotipik jeller aktarın.
16. Naylon tabaka ortamı ile temas halinde olduğu, ancak daldırılmamaktadır kadar% 10 FCS ile takviye edilmiş DMEM,% 10 FCS / Glut ile kuyu doldurun. Orta organotipik jel dokunmayın olmadığından emin olun.
17. Her 2 günde bir ortam değiştirme,% 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C'de 14 gün boyunca inkübe edin.

3.. Organotipik Fixation

1. Kuyudan naylon tabaka dahil tüm organotipik çıkarın ve sarılmak film yerleştirin.
2. Organotipik ve temiz bir tek neşter kullanılarak naylon sayfasını ikiye bölmek ve oda sıcaklığında 24 saat formaldehit içinde iki yarıyı düzeltmek.
3. % 70 Ethan ile formaldehit değiştirinol, 24 saat sonra ve öncesinde, parafine gömme, kesme, boyama ve bir gece bekletin.

İnvaziv Margin 4. Lazer Diseksiyon

1. Zarı üzerine 10 um-kalınlıkta Bölüm slaytlar.
2. 1 dakika boyunca Ksilen uygulayarak Deparaffinize bölümleri, daha sonra, ilave 1 dakika boyunca iksilenin çıkması ve% 75 etanol içinde çözmek.
3. 1 dakika boyunca% 0.125 kresil menekşe çözeltisi ile etanol ve leke çıkarın. Kresil Violet epitel hücreleri vurgular ve stromadan kolay ayrımcılığına izin verir.
4. Kresil menekşesi çıkarın ve% 100 etanol ile yıkamadan önce, ilave 1 dakika boyunca% 100 etanol geçerlidir. 30 dakika boyunca kuru hava slaytlar izin verin.
5. Seçilen platformu (örneğin Leica AS sistemi) kullanılarak lazer mikrodiseksiyon Davranış.
6. Mikroskop sahnede yüzü aşağı microdissected gereken lekeli bölümü ile cam slayt yerleştirin.
7. Toplama kaseti bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü monte edin ve 50 ul ilave edinmicrodissected doku toplayacak içine kapağa hücre liziz tamponu (örn., DNA, RNA ya da protein lizis tamponu).
8. Direkt görüş altında, ilgi doku tespit joystick'i kullanın ve yazılım arayüzü kullanarak, tümör yayılması önünde microdissected edilecek hücreleri vurgulayarak, lekeli organik bölümü açıklama.
9. Vurgulanan bir bölümünü kesmek gerekir hem de yangın lazer, talimat ve mikrosantrifüj tüp kap içine microdissected doku itmek.
10. Bir kez yeterli malzeme elde edilmiştir, toplama kaseti çıkarmak mikrosantrifüj tüpü kapatmak ve tüpün altına lizis tamponu çekmek için yavaşça dönerler.
11. Mikrodisseksiyon tamamlanana kadar buz üzerinde örnekleri yerleştirin. Uygun bir yöntem ile işlem örnekleri ilgilenilen analit çıkarmak için.

Sonuçlar

Biz CRC hücre hatları ve stromal hücrelerin çoklu kombinasyonlar için yukarıdaki yöntemi uyguladık. Burada sunulan bir örnek, primer insan ex vivo kolon fibroblastlar ile SW480 epitelyal hücre hatları olduğu, CRC. 3-boyutlu ko-kültürler istilacı tümör ön hücreler arasında farklı şekilde eksprese miRNAs karşılaştırılmasında mikroskopisi ve lazer yakalama mikro-kesim (Şekil 2) tabi tutuldu (Şekil 1), inşa edilmiş ve microRNA (miRNA) profil (Şekil 3) ile analiz ed...

Tartışma

Burada spesifik olarak izole edilmesi ve epitel hücreler ve stromal hücrelerin bir 3 boyutlu ko-kültür yapı metastatik ilerlemesi en erken aşamaları sırasında kanser bağlantılı stroma işgal etme kapasitesine kazanmış tümör hücrelerini karakterize etmek için bir yöntem tarif eder.

Ex vivo insan kolonik fibroblastlar ihtiva eden bir sentetik stroma ile yan yana CRC epitel hücrelerinin oluşan Co-kültür modelleri 3-boyutlu olarak CRC işgali yapısını incelemek için kullanılmıştır. In...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kolorektal kanser hücre hatları - gösterilen örnek SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Kollajen	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Naylon membran	Merck Millipore VVLP01300
Metal ızgara	Mesh Şirketi	WSS20-A4	themeshcompany.com
Lazer mikrodiseksiyon platformu	Leica Microsystems	Leica AS LMD
Membran montajlı slaytlar	Moleküler cihazlar
Cresyl Violet	Merck Millipore 1052350025