Bu video makalesinde, kanser hücresi istilasını yönlendirmede hormonların, sitokinlerin ve/veya büyüme faktörlerinin rolünü incelemek için modifiye edilmiş bir in vitro yöntem açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir Modifiye
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kan serumu kanser hücrelerinin mikrodamarlara kendi intravasation kolaylaştırılması, göç ve istila hangi doğru kemoatraktan olarak hizmet vermektedir. Ancak, hücre göç hangi doğru gerçek moleküller zor kalır. Bu modifiye işgali tahlil hücre göçü ve işgali sürücü hedefleri belirlemek için geliştirilmiştir. Bu teknik, belirli bir hormon, büyüme faktörü, sitokin ya da bir kanser hücresinin invaziv potansiyel aracılık bir rol oynayıp oynamadığını belirlemek için üç koşullar altında istila endeksi karşılaştırır. Bu koşullar, i), normal fetal sığır serumu (FBS), ii) kömür-sıyrılmış hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler ve iii) CS-FBS + molekülü kaldırır FBS (CS-FBS) ("X") gösterilir içerir. FBS ile karşılaştırıldığında CS-FBS ile hücresi yayılmasında belirgin bir değişiklik, değişiklik aracılık hormonlar, sitokinler ya da büyüme faktörleri olduğu anlamına gelir. Bağımsız molekülleri daha sonra yeniden kabiliyetlerini test etmek için, CS-FBS geri eklenebilirayet ya da işgali fenotip kurtarmak. Ayrıca, iki ya da daha çok faktör katkı maddesi veya araç veya yayılmasının inhibe edilmesinde çok sayıda molekülün sinerjistik etkilerini değerlendirmek için kombine edilebilir. Genel olarak, bu yöntem, hormonlar, sitokinler ve / veya büyüme faktörlerinin kanser hücresinin özel bir tip ya da belirli bir mutant için kimyasal çekici ve istila inhibitörleri olarak görev yapan hücre istilasında rol oynayan olup olmadığını belirlemek için araştırmacı sağlar. Belirli chemoattractants ve inhibitörleri tanımlayarak, bu değiştirilmiş işgali tahlil kanser hücresi işgali yönlendiren sinyal yolları aydınlatmak için yardımcı olabilir.
Giriş
Bir yeni işgal tahlil belirli hormonlar, kanser hücresi yayılımını tamamen içinde kimyasal çekici olarak sitokin ve / veya büyüme faktörlerinin katılımı belirlenmesi amacı ile geliştirilmiştir. hücre dışı matriks (ECM) ile işgal etmeye tümör hücrelerinin yeteneği metastatik fenotip 1-3 bir özelliğidir. İstila odaları yaygın olarak kanser hücresi istilasını ve göç çalışma, in vitro araç olarak kullanılmıştır ve in vivo tümör istilası ve metastaz mekanizmaları da bilgiyi sağlayabilir. odalar, hücre kültür plakalarının gözeneklerine içinde iç içe geçmiş silindir hücre kültürü ekler oluşur. insertlerin taban, tanımlanmış gözenek büyüklüğü ve yarı geçirgen polikarbonat veya polistirol membranlardır.
Standart istila deneyinde, hücreler, serumsuz ortam ile uç zar üzerine ekilir ve serum veya serum gibi kemoatraktantlarla dolu olan hücre kültür çukurlarına yerleştirildi set kadar kemoatraktif kuvvet. Bu kuvvet, tahrik Hücreler daha sonra tespit etmek ve hücrelerin sayısını belirlemek için geleneksel boyaları kullanılarak boyanmış hücre dışı matris (yayılma) 'in bir kaplama boyunca, alternatif olarak, yarı geçirgen bir zar (göç) hareket ettirin. hücre sayısı daha sonra invaziv olmayan hücre hattında göç ve istila derecesine göre normalize edilir. Bu yöntem araştırmacının, genetik manipülasyon da dahil olmak üzere koşullar altında çeşitli farklı hücre tiplerinin invaziv potansiyelini değerlendirmek için izin verir.
Hormonlar, sitokinler ve büyüme faktörleri serum kritik bileşenleridir ve giderek invaziv fenotip 4 sürüş ile ilişkili olduğu gösterilmiştir edilmektedir. Ancak, yine de işgali aracılık bu kemoatraktif serum moleküllerinin yapısı, rolü ve özgüllük zor kalır. meydan sürüş sorumlu serum veya serum benzeri chemoattractants belirli hangi faktörlerin belirlenmesi kalırmoleküller işgali sürecini inhibe ne olabilir kanser hücresi işgali yanı sıra. Bu yazıda, kanser hücrelerinin chemoattraction ve işgali sürüş molekülleri olarak, hormonlar, sitokinler ve / veya serum içinde mevcut olan büyüme faktörleri potansiyel katılımı değerlendirmek için bir yöntem tarif eder.
Önerilen bu tadil edilmiş protokolde, odun kömürü sıyırma% 2 karakalem sıyrılmış FBS (CS-FBS) oluşturmak üzere,% 2 fetal sığır serumu (FBS) ile ilgili hormonlar, sitokinler ve büyüme faktörleri çıkarmak için kullanılır. % 2 FBS ve% 2 CS-FBS iki kanser hücre istilasını sürücü kemoatraktif kuvveti ayarlamak için maddeler olarak kullanılmaktadır. Normal% 2 FBS ile karşılaştırıldığında, kemoatraktif madde olarak% 2 CS-FBS kullanarak ilk dahil olmak üzere çeşitli yararlar elde edilir, ve en belirgin olarak, hormonlar, sitokinler ve büyüme faktörleri, indirgenmiş / bağıl yokluğunda kanser istilası fenotipi çalışma yeteneği. Ayrıca hormonlar, büyüme faktörleri kolektif çıkarılması olup olmadığını değerlendirmek için araştırmacı sağlar ve cytokines invaziv endeksteki artış veya azalmaya neden olur. Daha sonra deney, (Şekil 2 ve 3 e bakınız), "X" olarak adlandırılan tek bir bileşen eklenmesi azalma artışı önleyen, ya da orijinal değerine invaziv endeksi geri olup olmadığını belirlemek için tasarlanmıştır. Bu yöntem, kömür sıyırma boyunca serum uzaklaştırılır bileşen fizyolojik seviyelerini elde etmek için spesifik olan, ancak, aynı zamanda kömür sıyırma aynı zamanda sinyal iletim yollarını etkileyen unutulmamalıdır. Örneğin, odun kömürü sıyırma osteoprogenitör hücrelerinin alkalin fosfataz aktivitesi azalır ve MAPK nin aktivatörlerinin 5 azaltılması yoluyla adipogenesis uyarabilir bildirilmiştir. Karakalem sıyrılmış ortam ticari olarak temin edilebilir ve protokolüne göre bu dekstran ile kömür birleştirir ve fetus inek serumu, O / N 6 ile inkübe özetlenmiştir.
Bu deney, RESPO geliştirilenNSE Zucker ve ark. 7 tarafından bildirilen bir sonuç yazarlar, normal% 2 FBS ile medya doğru göç sırasında gap junction iletişimi etkileyen bir mutant fenotip işgali endeksindeki artış gösterdi olduğunu gösterdi. Bu artış, kömürle sıyrılmış serum ikamesi ile ortadan kaldırıldı. Bu sonuçtan, Yazarlar, bir lipofilik molekül yönelik bu mutan etkilenen taşıma (daha özel olarak ise, bir hormon, bir büyüme faktörü, sitokin ya da) 7. İyi hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler tümör promosyonuyla ve istila 4 yer alan sinyal yolları aracılık ettiği bilinmektedir. Bu nedenle, bu bilim araştırmacılar ne faktör (ler) çalışma altında, özellikle kanser hücrelerinin veya mutantlar tümör invazyonu sürüş belirlemek için de önemlidir. bileşenin konsantrasyonu arasındaki farka bağlı olarak, belirlenen deney fizyolojik konsantrasyonda ayrı ayrı bileşenlerin rolünü ele almak üzere tasarlanmıştır ve# 8220, X ", normal FBS ve CS-FBS içinde. Bu testin gelişme sayesinde, araştırmacılar kendi sistemini düzenleyen özel invaziv yolun içine daha fazla fikir sahibi olabilir.
Hormonlar, büyüme faktörleri, sitokinler ve genellikle tümör destekleyicileri 8 olarak sınıflandırılmıştır. Örneğin EGF, bu faktörlerden bazıları istila odaları 9 kimyasal çekici doğrudan kaynakları olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, bu doğrudan tümör invazyonu bu serum ana bileşenleri temsil gibi görünmektedir. Bu protokol bir araştırmacı kanser hücrelerinin invaziv potansiyeli aracılık hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler katılımını değerlendirmek için izin verir geleneksel in vitro işgali tahlil için basit, ama önemli, değişiklik önermektedir. Ancak, tahlil değerli zaman ve r kullanmak şekilde değil, prosedür analizinde erken aşamada yaptıkları çalışmada etkili olacaktır dair bir cevap ile araştırmacı sağlamak için tasarlanmıştıresources gereksiz görülmesi halinde. Bu yöntem CS-FBS kullanır ve potansiyel kanser hücresi işgali aracılık kurşun adayları olarak sürdürmeye molekülleri hangi şekilde araştırmacılar takdirine bağlıdır. Bu analizlerin sonuçları, serum bileşenleri, özellikle hücre hattı veya mutant için Kemoattraktantlar veya inhibitörleri çalışılan olarak hizmet hangi belirlenmesinde yararlı olduğu ispatlamak zorundadır. Ayrıca, bu yaklaşım araştırmacı teşvik veya kanser hücresi işgali inhibe ya anahtar sinyal yolları belirlemeye yardımcı olabilir; Böylece gelecekte ilaç tasarımı yönlendiren.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Farklı Medya ve Ek Bileşenleri hazırlayın
- Deneyden önce, test edilecek da normal FBS ilave karakalem sıyrılmış FBS ya da kömür şeritli FBS artı madde ile DMEM veya diğer belirtilen ortam maddelerini kapsayan ortamı hazırlar. Birden fazla bileşen, her deneyde test edilebilir unutmayın.
- Tartın ve uygun fizyolojik konsantrasyon tarafından kömür şeritli serum içinde çözünmüş hormonlar, büyüme faktörleri ya da sitokinler seyreltin.
2. on Ice Kollajen Matrix hazırlayın
- 200 ul 10x PBS (pH 7.4), 5.4 ul 1 N NaOH, iki kez damıtılmış H2O 600 ul ve 1.2 ml kolajen I: buzda sonra steril filtre edilmiş bileşenler eklenerek 2.2 mg / ml'lik bir matris 2 mi kolajen hazırlanması (de 3.63 mg / ml).
- Plaka için hazır olana kadar buz üzerinde kolajen I çözeltisi tutun.
3.
- Her bir hücre çizgisi test edilebilmesi için, 12-kuyu ekler ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bölmesi kullanırlar. Kemoatraktan medya ekleyerek ve deney düzeneği up için ekler aktarmak için ekler içermeyen ek 12 kuyu kullanın.
NOT: hücre hatları burada kullanmak için bir polietilen tereftalat (PET) membran ve 8 mikron gözenek büyüklüğüne sahip plakalar üzerinde bir kollajen matriks uygunudur. Bununla birlikte, önceden kaplanmış plakalar içinde bir Matrigel matris, hücre çizgisi araştırılmaktadır göre azalmış gözenek boyutu ile ikame edilebilir. - Açıkça (bir kontrol, invaziv olmayan hücre hattı için FBS göç, CS-FBS göç, FBS işgali, ve CS-FBS işgali yanı sıra FBS-göç) analiz edilen duruma başına 3 kuyu kullanılarak, plaka etiket. Bir kolajen ya da Matrigel matris boyunca ve daha sonra zar içindeki gözeneklerin içinden hareket etmek sureti ile PET zar içindeki gözeneklerin içinden hareketi ve deney invazyonu ile deney göç. Bir her hücre durum için farklı renk işaretçileri kullanınKaplama işleminde kimliği.
4. Invasion Matrix dağıtın
- Dikkatle uçlar haline kollajen matris solüsyon içerisinde 75 ul istila deneyleri için kullanılacak pipetle. Kabarcıkları önlemek için dikkatli kullanın. Yüzeye ters pipet uygulayarak kabarcıklar Dağılın.
- Katılaşmaya jel sağlamak için 30 dakika boyunca 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatöründe kolajen kaplı insertler ile plaka aktarın.
5. Plaka Membran veya Invasion Matrix üzerine Hücreler
- Bu arada, Hücreleri tripsinize edin ve% 10 FBS ile ortamı eklenir. Sıkma hücreleri masa üstü bir santrifüj ile 5 dakika süreyle 200 x g'de ve serumsuz ortamında 3 kez yıkayın.
- Serum serbest medya süspanse. Bir hemasitometre veya otomatik slayt sayacı ile hücreleri saymak. 5 x 10 4 hücre / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar serumsuz ortam ekleyin.
- Kolajen matrisi (30 dakika sonra) katılaşmış girdiğinde, ortam 700 ul ya da2% tanımlanan FBS veya her kuyuya FBS kömür-elimden. Plaka başına 12 ekler:
- 3 ekler medya ile kolajen ve kuyuları var +% 2 FBS
- 3 ekler medya ile kolajen ve kuyuları var +% 2 CS-FBS
- 3 ekler medya +% 2 FBS ile hiçbir kolajen ve kuyuları var
- 3 ekler medya ile hiçbir kolajen ve kuyuları var +% 2 CS-FBS
- Test edilen faktörlerin sayısı ve her bir durumda karşılık gelen herhangi bir kollajen kontrol olarak, ek plakalar kullanın.
- Tüm geçiş ve istila insertlerin de uç başına 500 ul hücre vererek, 5 x 10 4 hücre / ml'de ekler hücre süspansiyonu ekleyin.
- 37 ° C'de 22 saat boyunca kuluçkaya bırakılır.
6. Geçirme ve istila Hücrelerinin sayısı niceliğini
- Ayrı kuyularda metanol fiksatif, eozin ve hemotoksilin kullanarak kuyuların ayarlayın boyama.
- Her kuyudan hücreleri ve matriks çıkarmak için pamuklu bezlerden kullanın.Her kuyu için ikinci sürüntü uygulaması ile Rrepeat.
- Forseps ile, arka arkaya 3 çözeltilerin her birine, her bir ek 1 saniye için 5 kez batırın.
- Ekler / N O kurumasını bekleyin.
- Ya i) kenarlarda dikkatle kesim, bir neşter ile filtreleri kaldırabilirsiniz ve lamel ve daldırma yağ ile bir slayt monte, veya ii) ekler O / N ters kurumasını ve mikroskopi için doğrudan ekler kullanmak için izin.
- Ertesi gün, bir 20X amacı ile bir mikroskop altında slaytlar veya ekler görüntüleyebilir ve filtrenin farklı bölgelerinden 5 görüntüleri çekmek. Tutarlılığı artırmak için, 4 dış alanları ve bir merkez almak.
- ImageJ yazılımı kullanarak tüm koşullar için hücreleri saymak ve aşağıdaki formüller için geçerlidir.
- Aşağıdaki gibi yüzde işgali belirleyin:
Ben = a eklemek kollajen sayesinde işgalci hücrelerin # ortalama
Kontrol eki aracılığıyla göç hücrelerin # = b Ortalama
% Işgali = (a / b) x 100 - Aşağıdaki gibi% 2 FBS Invasion Endeksi belirleyin:
Hücrelerin istilası% (% 2 FBS içinde) analiz edilir = C
(% 2% FBS) kontrol girişimsel olmayan hücrelerin işgali = d
Invasion İndeksi (FBS) = (c / d) - Aşağıdaki gibi% 2 CS-FBS Invasion Endeksi belirleyin:
Hücrelerin istilası% = e (% 2 CS-FBS) analiz edilir
% (% 2 CS-FBS) kontrol girişimsel olmayan hücrelerin işgali = f
Invasion Endeksi (CS-FBS) = (e / f)
7. tekrarlayın Deneysel Protokolü + X n Çoklu Faktörler Kombine ile Kömür-elimden FBS ile FBS Kömür-elimden Karşılaştırılması
- "X" ya da bileşenlerin bir kombinasyonu, farklı bileşenler kullanılarak gerektiği kadar prosedür birden fazla kez tekrarlayın.
- Göç ve istila etkileri her faktör "X" katkısını belirlemek için hesaplamalar uygulayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
işgal endeksi noninvaziv hücre hattına normalleşme göre her durum için hesaplanır. Deneyler için, biz 1205Lu melanom hücre çizgisi ve kurulan varyant kararlı hücre kuşaklarının z invaziv çizgiler olarak hem de 1205Lu hücreleri mantıksal kontrol olarak hizmet vermektedir 10 türetildikleri premalign invaziv olmayan değişik türde, WM793 kullanın. Bu dermis birincil bileşeni olduğundan biz de işgali matrisi olarak kollajen I kullanmaktadır. Optimal işgali matris hücre hattı dayalı ve in vivo ile uyumlu ö...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tümör metastaz çok aşamalı bir süreçtir. Hücreler, bazal membran kırmaya da uzak bölgelere taşınabilen lenf sistemi veya kan ya da kılcal damarlarla içine intravasate gerekir. Tümör hücreleri daha sonra damar dışına ve Makrometastaz 12 içine yerleşmektedir. Mezenkimal geçiş (EMT), tümör invazyonu ve metastaz için epitel yoluyla ilerleme steroid hormonların 13,14 tarafından geliştirilmiştir, büyüme 15-18, ve sitokinler 19-21 faktörleri. Bu moleküller, bir testin geliştirilmesi ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, D'Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY'den sağlanan finansman kaynaklarını kabul ediyor.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 8.0 & micro özellikli BioCoat Kontrol Ek Parçaları; m PET membran | Corning | 354578 | iki adet 24 oyuklu plakanın her birinde 12. PET = polietilen teraftalat |
| Kollajen I, sıçan kuyruğu | Corning | 354236 | Kaynak = sıçan kuyruğu tendonu, saflık =% 90 |
| Fiksatif; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Metanol bazlı fiksatif, hematoksilen/eozin |
| Fetal sığır serumu | Life Technologies | 16000 | FBS olarak belirlenmiştir |
| Kömürle soyulmuş fetal sığır serumu | Life Technologies | 12676 | CS-FBS olarak belirlenmiştir |
| Fetal sığır serumu | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | FBS |
| olarak belirlenmiştirKömürden sıyrılmış fetal sığır serumu | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | CS-FBS olarak belirlenmiştir |
Kaynaklar
- Weinberg, R. A. The Biology of Cancer. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201(2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
