Yöntem makalesi

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin In vitro HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi

DOI:

10.3791/51506

⸱

31 Ağustos 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HIV-1 patogenezi hem viral özellikler hem de konak genetik faktörleri ile tanımlanır. Burada, gag gen dizisi varyasyonunun virüsün in vitro replikasyon kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için tekrarlanabilir ölçümlere izin veren sağlam bir yöntemi açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok HLA sınıf I alelinin HIV-1 patogenezi ve hastalığın ilerlemesi üzerindeki koruyucu etkisi, kısmen, HIV-1 genomunun zorlukla kaçan korunmuş kısımlarını hedefleme yeteneklerine atfedilir. Hücresel bağışıklık basıncına atfedilen dizi değişiklikleri, enfeksiyon sırasında genom boyunca ortaya çıkar ve Gag gibi genomun korunmuş bölgelerinde bulunursa, virüsün in vitro olarak çoğalma yeteneğini etkileyebilir. Gag'daki HLA'ya bağlı polimorfizmlerin HLA uyumsuz alıcılara iletilmesi, azaltılmış ayar noktası viral yükleri ile ilişkilendirilmiştir. Bunun, virüsün replikasyon kapasitesinin azalmasından kaynaklanabileceğini varsaydık. Burada, HIV-1'in in vitro replikasyonunu, alt tip C ile enfekte Zambiyalılardan akut zaman noktalarından izole edilen gag geninden etkilendiği şekilde değerlendirmek için yeni bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, gag genini ortak bir alt tip C HIV-1 proviral omurga olan MJ4'e yerleştirmek için kısıtlama enzimi bazlı klonlamayı kullanır. Bu, kronik olarak türetilmiş gag-pro dizilerinin in vitro replikasyonunu değerlendiren önceki rekombinasyon tabanlı yöntemlerden ziyade alt tip C dizilerinin incelenmesine daha uygun hale getirir. Bununla birlikte, protokol diğer alt tiplerden virüslerin çalışmaları için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, bu protokol, Gag-MJ4 kimerik virüslerinin CEM tabanlı bir T hücre hattı üzerindeki replikasyon kapasitesini değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntemi detaylandırır. Bu yöntem, akut olarak enfekte olmuş 149 alt tip C Zambiyalıdan türetilen Gag-MJ4 kimerik virüslerinin incelenmesi için kullanıldı ve Gag'da replikasyonu etkileyen kalıntıların tanımlanmasına izin verdi. Daha da önemlisi, bu tekniğin uygulanması, viral replikasyonun, ayar noktası viral yükü ve uzunlamasına CD4+ T hücresi düşüşü gibi erken HIV-1 patogenezinin parametrelerini nasıl tanımladığının daha derin bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ana ve HIV-1 patogenezi ve hastalığın ilerlemesi rasyonel aşı tasarımı için her şeyden önemlidir etkileyen viral özelliklerini hem belirlenmesi. Hücresel bağışıklık tepkisi, HIV-1 enfeksiyonu, insan bağışıklık tepkisinin temel bir bileşenidir. Sitotoksik T lenfositleri (CTL), akut viremi başlangıç ​​kontrolü için gerekli olan ve ana sabit bir düzeye (set noktası) virüs yükü, 1,2 kurmaya olanak verir. Bu efektör hücrelerin deneysel tükenmesi viral kontrole 3,4 kaybı ile sonuçlanır. Buna rağmen, mutasyon viral yönden enfekte hücreler 5-9 arasında CTL tanıması bozmak, viral genom içinde ortaya için dizayn edildi.

Belirli HLA allelleri düşük viral yük ve B * 57, B * 27 ve B * 81 10-15 olmak üzere yavaş hastalığın ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir. HLA sınıf I alelleri koruyucu yarar bir kısmı, örneğin Gag gibi genomunun işlevsel olarak sınırlı bölgeleri hedef gerçeğine atfedilebilirve in vitro 16-21 çoğaltmak virüsün yeteneğini azaltmak kaçış mutasyonları için seçin. Hücresel bağışıklık sistemi için bir kaçış I aleli seçme HLA sınıf bağlamında virüse yararlı olmakla birlikte, bu mutasyonlar etkisinin bir HLA-uyumsuz 22,23 münferit iletim üzerine ev için farklı sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, viral replikasyon kapasitesi üzerinde iletilen HLA ilişkili kaçış mutasyonların etkilerini anlamak erken HIV-1 patogenezinde anlayışımızı ilerletmek için önemli olacaktır.

Ben 24-29 kadar ilerleme allel spesifik HLA sınıf ile ilişkili bireysel kaçış mutasyonları fitness kusurları tespit ve karakterize etmek için yapılmış olmakla birlikte, doğal olarak, HIV-1 izolatları, HLA ilişkili polimorfizmlerin özel ve karmaşık bir ayak izleri büyük olasılıkla HLA kaynaklanan olarak oluşan Farklı immünogenetik geçmişlere 30 aracılıkh bağışıklık basıncı. Apnceki analizi, Goepfert ve diğ. 88 akut enfekte Zambiyalılar türetilen iletilen Gag dizilerinde HLA ilişkili bir mutasyon birikimi ayar noktası viral yükte 31 bir azalma ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu HLA uyumsuz alıcılara özel Gag zararlı kaçış mutasyonları iletim, bir klinik yarar sağlar ve viral replikasyon zayıflatılmış bağlı olabileceğini düşündürmektedir. İleride, bu tür çoğaltma kapasitesi ve erken çoğaltma sırayla HIV-1 klinik parametreleri ve geç-sahne nasıl etkileyebileceğini olarak iletilen virüsün özelliklerini tanımlamak için konser çalışmaları nasıl karmaşık Gag polimorfizmlerinin kombinasyonları doğal olarak oluşan izolatları içinde çalışmaya zorunlu olduğunu patogenezi.

Broekman et al. Birinci alt tip C ve hem de B enfeksiyonlarının kronik aşamalı enfeksiyon ve viral yükü sırasında izole gag-pro sekansları replikasyon kapasitesi arasında bir bağ göstermiştir32-35. Bu çalışmalarda sunulan deneysel yaklaşım, kronik olarak enfekte edilmiş bireylerden türetilen dizilerinin in vitro replikasyon kapasitesi incelenmesi için her ne kadar uygun olan, akut enfeksiyonlu bireyler zor alt tip C, HIV-1 replikatif kapasite ders yapmayı çok sayıda teknik belgesine ve sınırlamalar vardır. Bu yöntem LAV kısmen elde edildi alt tip B NL4-3 Provirüsün, içine nüfus tabanlı PCR çoğaltılmış dizi rekombinasyon dayanan, bir laboratuvar virüs stokları 36 uyarlanmıştır. Virüs üretimi PCR amplikonlarının bir CEM dayalı T hücre hattı 37 birlikte-transfeksiyonu ile gerçekleştirilebilir ve delta-gag-Pro NL4-3 DNA sindirildi. Bu yöntem, potansiyel olarak, in vivo olarak, viral quasi ile ilgili olarak geri kazanılan virüs stokunun doğasını eğriltme ve bu nedenle in vitro replikasyon kapasitesi ölçülmesini değiştirerek, haftalar ve aylar arasında bir süre içinde virüsünün gelişimini gerektirir. Bu yöntem, Ikronik olarak enfekte bireylerin büyük bir sayıda çok sayıda, farklı viral varyantları klonlama etkili yüksek kapasiteli replikatif virüs seçtiği, kronik olarak enfekte olmuş bireylerin incelenerek ve burada daha uygun s uygun bu nedenle oldukça emek yoğun değildir. Ancak, akut enfekte olmuş kişide, genel olarak 1-2 varyantları mevcut bulunmaktadır ve bu nedenle, in vitro seçme basınçları ile geri kazanılan virüs stokunun doğasını eğriltme riskini ortadan kaldırır, in vitro replikasyon kapasitesi daha doğru bir şekilde değerlendirilmesi için sağlar. İkincisi, bu yöntem bir alt tip B türetilmiş omurgası içine alt tip C gag-yanlısı dizileri birleştirilmesini gerektirir ve analiz içine omurga uyumsuzluk önyargıları tanıtmak olabilir. Bu sınırlamalar nedeniyle, dizilerin sayıda oluşan herhangi bir muhtemel yanlılığı üstesinden gelmek için analiz edilmelidir.

Burada alternatif bir deneysel bir yaklaşımı açıklamakalt tip C, akut olarak enfekte olmuş bireylerdeki türetilen sekansları üzerinde çalışmaya uygun ACH. Bu alt tip C Proviral omurgasına MJ4 olarak HIV-1 alt tip C enfekte bireylerin akut enfeksiyon zaman noktalarında elde edilen gag geninin katılması, bir kısıtlayıcı enzim bazlı klonlama stratejisi kullanın. Gag genleri klonlamak için ortak bir omurga olarak MJ4 kullanılması alt tipi C türetilmiş sekansların analizi için çok önemlidir. MJ4 nedeniyle omurga ve gag geni arasındaki alt tipi uyumsuzluk önyargı tanıtmak için daha az muhtemel olacağını, böylece primer izolat 38 türetilmiştir edilir ve. Proviral 293T hücreleri doğrudan transfekte edilmesi gereken yapıların ve klonlanmış gag dizisi ile aynı olan bir klonal virüs stokunun geri kazanımı için Buna ek olarak, kısıtlama enzim bazlı klonlama bölgesinin bir yaklaşım sağlar.

Aşağıda sunulan yöntem türetilmiş Gag-MJ4 alt tip C çoğaltma kapasitesini değerlendirmek için yüksek verimli bir yöntemdirsimerik virüslerin. 293T hücreleri içine transfeksiyonu basittir ve virüsün geri üç gün sürer. In vitro replikasyon kapasitesi. Brockman et al tarafından oluşturulan aynı CEM-CCR5 göre T-hücresi hattında 37 tahlil, ancak başarılı bir çoğaltma için gerekli olan önemli değişiklikler protokolü kullanarak alt tip C MJ4 simerik virüslerin. PBMC'ler daha çok, uygun bir T-hücresi çizgisinin kullanımı, yüksek tahlil üretilebilirliğine ile test edilecek olan alt tip C MJ4-simerik virüslerin çok sayıda sağlar. Son olarak, üstte yüzen madde içindeki virüs miktarının tayini için bir radyo-etiketli ters transkriptaz deneyi kullanılarak ticari olarak temin edilebilen ELISA kitleri kullanılarak P24 den daha düşük maliyetlidir. Ayrıca, aynı tahlilde, hem zayıf ve son derece kopyalayan virüs tespit etmek ve suşlar arasında çoğaltma ince farklar tespit edilmesi için önemli olan bir yüksek dinamik aralık verir.

Sonuç olarak, burada sunulan yöntem için izin verdiHIV-1 alt tip C türetilen öğürme dizilerinin çoğaltma kapasitesi derinlemesine çalışma akut Zambiya bireylerin enfekte ve yazılı olarak, ayrıca C popülasyonları enfekte diğer subtipini incelemek için genişletilmiş olabilir. Farklı Gag izolatlar arasında çoğaltma kapasitelerde varyasyon yüksek derecede gözlenmiştir. Ayrıca, üç yıllık bir süre üzerinde 39 CD4 + düşüş iletilen Gag çoğaltma kapasitesine ve set noktası viral yük arasındaki yanı sıra ile istatistiksel bir ilişki göstermek için başardık. Bu sonuçlar, bu tür çoğaltma kapasitesi nasıl bulaşan viral özellikleri, çalışmanın önemini vurgulamak, erken enfeksiyon sırasında patogenezi etkilemeye konak bağışıklık sistemi ile etkileşim ve etkin bir aşı müdahaleleri gibi tedaviler geliştirilmesinde ayrılmaz olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enfekte gelen HIV-1 gag geninin 1. Amplifikasyon, Dondurulmuş Plazma

  1. Bir ekstre etme kiti kullanılarak HIV-1 ile enfekte olan plazma çözülmüş 140 ul viral RNA çıkarmak.
    1. Mümkünse, hemen RNA ekstraksiyon olarak donmamış viral RNA iyi amplifikasyon sonuçları verir sonra cDNA sentezi geçin. Mümkünse, önce, viral RNA ekstraksiyonu için 4 ° C sıcaklıkta bir birinci tur DNA amplifikasyonu ve depolanmasını PCR ana karışım kadar ayarlayın.
  2. RNA'dan cDNA ters-transkribe edilmesi ve ters transkriptaz ve tek adımlı RT-PCR içinde bir termostabil DNA polimeraz kullanılarak, bir birinci tur DNA ürünleri yükseltmek.
    1. Oda sıcaklığında -80 ° C derin dondurucuda (donma gerekli ise) ve kısaca çözülme üzerinden RNA atın sonra soğuk blok yerleştirmek. Ana karışımı 45 ul ihtiva eden her bir PCR tüpü RNA 5 ul başına 50 ul'lik nihai bir hacim elde edildi. Hemen ° C derin dondurucuda -80 içine RNA örnekleri kalan yerleştirin.
    2. Enzimdir sonraİstenen reaksiyonların sayısı, her ince çeperli bir tüp içine PCR amplifikasyonu birinci fasıl PCR Master Mix (Tablo 1), kısım 45 ul DDEd. Örnekler arasındaki minimum çapraz bulaşmayı sağlamak için şerit kapaklar tek tek kapakları PCR tüpleri kullanmak değil emin olun. Isıya duyarlı RT enzim ve RNA şablonu korumak için soğuk bir blokta PCR tüpleri yerleştirin. Not: Numuneler yeterli viral quasispecies örneklemek amacıyla üç nüsha olarak çalıştırılmalıdır. Bu PCR ortaya yanlış katılmasının en aza indirmek için, yüksek doğrulukta bir DNA polimeraz enzimi ile bir ürün kullanılması da önemlidir. Önerilen ürün için reaktifler listesine bakınız.
    3. RNA şablonu Tüm reaksiyon tüplere ilave edildikten sonra, Tablo 1 B'de açıklanan döngüleyici programı kullanılarak bir PCR amplifikasyonu için PCR tüpleri aktarın. Not: Bu amplifikasyon PCR ürünü, iç içe bir ikinci tur kullanılacaktır.
  3. Gerçekleştirin iç içe geçmiş bir seDNA şablonu olarak ilk tur PCR amplifikasyonu (1.2) 1 ul kullanılarak iletken boyunca PCR amplifikasyonu.
    1. Kısım istenilen reaksiyonların sayısı, her ince duvarlı PCR tüpüne ikincil PCR ana karışımı (Tablo 2A), 49 ul. Aktarım, her bir reaksiyon tüpüne birinci fasıl PCR amplifikasyonundan 1 ul 50 ul'lik nihai bir hacim elde edildi. Not: Bu ikinci tur yükseltilmesi için şablon olarak DNA hizmet verecek. Bu PCR ortaya yanlış katılmasının en aza indirmek için çok yüksek doğrulukta ve düzeltme özelliklerine sahip bir DNA polimeraz kullanılması da önemlidir. Önerilen ürün için reaktifler listesine bakınız.
    2. Termalcycler için ikinci tur PCR reaksiyon karışımı ve Tablo 2B'de tarif çalışma programı aktarın. Not: programın tamamlanmasından sonra, bu reaksiyon ürünleri ürünün üretimini teyit etmek için agaroz jel üzerinde olacaktır.
  4. 5 & ​​# 5x yükleme boyası 3 ul ekleyin181; 50 ul ikincil reaksiyon hacmi içinde ilave edildi ve çözülene kadar bantları UV ile floresan bir DNA ihtiva etmeyen bir% 1 agaroz-TAE jeli üzerinde 120 V'ta tutuldu. Bir mavi ışık ışığını 1.6 kb bantları görselleştirmek (Şekil 1A bakınız).
  5. Bir DNA ihtiva etmeyen bir% 1 agaroz-TAE jeli üzerinde kalan 45 ul reaksiyon hacmi çalıştırın ve temiz bir jilet ile uygun bantları kesip.
    1. , Nükleaz içermeyen su içinde elüt, bir jel arıtma takımı kullanılarak jel dilimi DNA ekstrakte birey için üç pozitif reaksiyon birleştirebilir ve daha sonraki kullanım için -20 ° C'de dondurma ürünü.

Gerekli Kısıtlama site tanıtımı ile Klonlama 2. hazırlanması tıkaç amplikonlarının

  1. Uzun terminal tekrarı (LTR) kullanılmaktadır MJ4 plazmidin / 5 'UTR kısmını amplifiye (bakınız Tablo 3).
  2. Arındırmak 1.3 kb PCR ışığını ürünleri, tüketim olumlu amplıkonları, jel görselleştirmek ve daha önce dondurmatarif edildiği gibi (1.4,1.5 Şekil 1B'ye bakınız).
  3. "Bağlayıcı-örtüşme uzatma" ile MJ4 LTR, gag amplikonları kaynaşık oluşturma PCR'dir (bakınız Tablo 4).
  4. , Tüketim, görselleştirmek arındırmak ve 1.4,1.5 gibi 3.2 kb amplıkonları (Şekil 1C bakınız) dondurma.

MJ4, Tipi C, Bulaşıcı Moleküler klonlama içine 3. Klonlama Amplified öğürme Genler

  1. 1,5 MJ4 plazmid ug ve 50 ° C (Tablo 5A bakınız) 1.5 saat için Bcll (metilasyona duyarlı) restriksiyon endonükleaz ile arıtılmış, LTR, gag PCR ürününün 1.5 ug Digest.
  2. Sindirim reaksiyona NgoMIV 1 ul ilave edilir ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Daha önce azalan olarak klonlanması için gösterilen bantlar tepkileri restriksiyon dijest 5x yükleme boya ilave edin ve yavaş yavaş 100 V Visualize'nin, tüketim 1-2 saat boyunca bir DNA jel leke ihtiva eden bir% 1 agaroz-TAE jel üzerinde toplam hacmi electrophorese ve saflaştırılmasıribed (bakınız Şekil 2).
  4. Vektör oranı 1 insert: 3 saflaştırılmış Ltr- öğürme ekleme ve MJ4 vektör DNA kullanılarak ligasyon reaksiyonları hazırlayın. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe ligasyon reaksiyonları (Tablo 5B bakınız).
  5. Ligasyon ürünleri ile kimyasal olarak yetkin JM109 bakteri dönüşümü ve 100 ug / ml ampisilin ile LB agar plakaları üzerine yayılır ve 22 + saat boyunca 30 ° C'de büyütülmüştür.
    1. 15 dakika boyunca JM109'dan buz üzerinde yetkili hücreleri çözülme. Buz üzerinde 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler ve chill Etiket.
    2. JM109 hücrelerinden alikot 50-100 ul önceden soğutulmuş 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri. Hafifçe karıştırın tüp hafifçe ve hemen buz dönen, JM109 hücrelerine ligasyon reaksiyonu 2.5-5 ul ekleyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde ligasyon ürünü ile yetkili hücreleri inkübe edin.
    3. Isı şoku JM109 kompetan hücreler ve 45 saniye boyunca 42 ° C ısıya blok ligasyon reaksiyonu içeren ve en az 3 dakika için buza geri dönmek bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri.
    4. Her bir mikrosantrifüj tüpüne SOC ortam 50 ul ekle ve ampisilin, 100 ug / ml ile takviye edilmiş, oda sıcaklığı, LB-agar plakaları üzerine bütün transformasyon reaksiyonu plaka.
    5. 30 ° C inkübatör Transfer levhaları ve koloniler açıkça oluşturulan bir 20 saat boyunca, ya da kadar serbest bırakılır.
  6. Izole edilmiş koloniler ve 22 + saat boyunca 30 ° C'de 100 ug / ml ampisilin ile LB 4 ml büyür.
  7. , 15 dakika boyunca 3.200 xg'de kültürleri aşağı Spin suyu dökün, ve plazmid DNA ayıklayın.
  8. Aslına klonlama teyit etmek için, 2 saat boyunca 37 ° C 'de özet bir çift NgoMIV ve Hpal restriksiyon enzimleri ile kesilmiş miniprep DNA'sının. % 1 agaroz-TAE jeli üzerinde analiz (Tablo 5C bakınız).
  9. Sekans, aşağıdaki primerler kullanılarak her plazmid LTR-gag uç bölge: GagInnerF1, GagF2, Rev1, 3 Rev ve GagR6 (Tablo 6) sekans özdeşliği teyit etmek için.
  10. Nüfus dizileri der elde klonlanan karşılaştır1.5.1 Saflaştırılmış ilk amplikonundan ived. Not: Bu sonuçta herhangi bir in vitro replikasyon fenotipler klonlama işlemi sırasında oluşan omurga hataları nedeniyle değildir sağlamak amacıyla iki adet bağımsız klon çoğaltma kapasitesini değerlendirmek için önemlidir.

Çoğaltma Yetkili Gag-MJ4 simerik virüslerin 4. Üretimi ve titre

  1. Prince ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi 39 Fugene HD: 1 oranında bir 4 kullanılarak 293T hücrelerine kimerik MJ4 plazmid miniprep DNA 1,5 ug ile transfekte replikasyon yapabilen bir virüsün oluşturur.
  2. Al 39 altında ve Prens et açıklandığı gibi TZM-bl hücreleri üzerinde Titre hasat virüs stokları.
    1. Levha TZM-bl hücreler ertesi gün bir% 30-40 konfluent hücre tekli tabakası olması için virüs enfeksiyonundan önce 24 saat. Bu, genellikle, 24 oyuklu plakada oyuk başına 800 ul toplam hacim içinde 5 x 10 4 hücreler ekleyerek elde edilebilir.
    2. Oyuğuna ilave edildikten sonra hücreler, hafifçe, hücreleri verimli bir şekilde dağıtmak için yan sonra öne ve arka yüzü 24 oyuklu plaka hareket eder. Girdap yok - bu plakasının merkezinde biriken hücreler neden olur.
    3. Ertesi gün, DMEM,% 1 FBS hazırlamak; Bu, DEAE-dekstran seyreltilmesi için virüs stokları ve seyreltmek için kullanılır. Hazır DEAE-Dekstran 10 mg / ml veya 125x ve 80 ug / ml veya 1 x istenen bir nihai konsantrasyonu.
    4. Virüs stokları dışarı atın, oda sıcaklığında erimeye çalkalayıcı -80 ° C dondurucu ve yerden test edilecek.
    5. Bir çok kanallı pipet kullanarak, seri yuvarlak dipli bir doku kültüründe güçlü bir virüs stokları seyreltik kapağı ile 96 oyuklu plaka işlemden geçirildi. Bu, 3-kat seyreltme protokolüdür. Seyreltme düzeni için Tablo 7'ye bakın.
    6. Emin, hücre tekli tabakası rahatsız dikkat ederek bir vakum aspiratör ile tohumlanır TZM-bl 24-delikli plakadan ortamı çıkarın. Sadece bir seferde bir 24-plaka ortamı çıkarın hücreler yapmak o kadarkurumasına değil.
    7. Her bir göze, 1.000 ul pipet kullanarak DMEM karışımı içindeki 1x DEAE-Dekstran +% 1 FBS 150 ul ilave edin. Bu tek tabaka bozan olarak tekrar pipet kullanın etmeyin.
    8. Uygun oyuğuna Seyreltilmiş her bir virüs 150 ul ilave edin. Kuyunun merkezine virüs ekleyin ve eşit hücre mono tabakasının karşısında virüs dağıtmak için hafifçe karıştırılır. 37 ° C'de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, 2 saat ve% 5 CO 2 enfekte olmuş hücreleri inkübe edin.
    9. 2 saat inkübe edildikten sonra, her bir göze, DMEM içerisinde 0.5 ml% 10 FBS eklemek ve ek bir 48 saat boyunca inkübatör plakaları döner.
    10. 48 saat sonra, hücreler% 100 konfluent olmalıdır. MJ4 Bir çoğaltma yetkili virüs olduğundan, bazı hücre ölümü olabilir, ancak bu beklenebilir olacaktır.
    11. Her ortamı iyi çıkarın ve 400 ul / iyi çözüm (tarifi için Tablo 8A bakınız) sabitleme ekleyin. Bir seferde sadece bir tabak Fix. 1.000 ul pipet kullanarak çözüm sabitleme ekleyin ve 5 dk bekletinoda sıcaklığı.
    12. Sabitleme çözüm çıkarın ve Ca 2 + / Mg 2 + PBS ile 3x yıkayın. Yavaşça tek tabaka bozmamak için kuyunun tarafına PBS eklemek için bir püskürtme şişesi kullanın. Üçüncü yıkamadan sonra, emici kağıt üzerinde plaka kuru kurulayın.
    13. 400 ul / oyuk 24 oyuklu plakanın her oyuğuna boyama çözeltisi (tarifi için bakınız Tablo 8B) ve en az 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha uzun inkübasyon süreleri, kabul edilebilir, fakat inkübasyon süresi hassas olarak ölçülmesi deneyler arasında tutarlı olması gerekmektedir.
    14. Yıkama 2+ / Mg 2 + Ca PBS ile 2x ve enfeksiyon için puan veya daha sonra puanlama için 4 ° C'de PBS ve mağaza ekleyin. Plakalar sürece tek tabakalı hidre tutulur gibi, en fazla dört gün boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
    15. Enfeksiyonu için puan için, kadranın içine 24 çukurlu bir levhanın çukurlarına bölmek için kalıcı bir işaret kullanılır. Bir kez, 200X toplam büyütme kullanılarak, bir görüş alanı içindeki tüm mavi hücreleri saymakKuyunun dört kadranın her.
    16. Aşağıdaki gibi ul başına Enfeksiyon Birimleri hesaplayınız: / (virüs ilave ul) = IU / ul [(# mavi hücreler / 4) 67 x]. Her bir kuyucuğa ilave virüsün ul hacim Tablo 8C bakınız. Ortalama birkaç kuyu birlikte; Numaralar doğru titrasyon için nispeten ucuz olmalıdır.

In vitro çoğaltma Testi Kültür Medya ve GXR25 Hücrelerinin Yayılma 5. hazırlanması

  1. GXR25 hücrelerin yayılması için komple RPMİ'de (cRPMI) hazırlayın. NOT: En az 4 ay önce planlanmış çoğaltma deneylerinde kültür GXR25 hücreleri için son derece önemlidir (Tablo 9).
  2. Bölünmüş hücreler, haftada iki kez 01:10 ve korumak hücre yoğunluğu 10 6 x 05-02 Ekim x 1 arası hücre / ml olmuştur.

GXR25 (CEM-CCR5-GFP) olarak Gag-MJ4 Kimeralar in vitro replikasyonu 6. Hücreleri

  1. I önceki günbu enfeksiyonun gününde logaritmik büyüme böylece nfection bir konsantrasyonda, 5 ila 10 x 2-3 arası hücre / ml hücre ayrıldı.
  2. Enfeksiyonun gününde C dondurucu ve çözülme ° -80 virüs stokları çıkarın. Aşağıdaki formül kullanılarak 0.05 enfeksiyon çokluğunda 5 x 10 5 GXR25 hücrelerini enfekte etmek için TZM-bl hücresi tahlilinde ikinci U / ul titreye bağlı olarak her bir stoktan gerekli virüs hacmini hesaplayın:
    Enfeksiyonu (ul) için virüs hacmi = 1 ul / X IU x 0,05 x 500.000
    NOT: Bu test ettik virüs tüm logaritmik büyüme fazında sonuçlanır Biz 0.05 bir MOI'nin seçtiniz. Bu virüs, test edilecek için logaritmik büyüme yakalamak için en uygun MOI belirlemek için ilk deneyler önemlidir.
  3. Ve bir V-tabanlı doku kültürü bir kuyuya ilave (0.05 MOI elde etmek için) 100 ul bir hacme kadar seyreltin cRPMI virüs 96 oyuklu plaka işlemden geçirildi. Not: her iki dahil positireplikasyon deneylerinde her set (MJ4 WT ile enfekte edilmiş) ve bir negatif (sahte enfekte olmuş hücreler) ve denetimine. Her kolon oyuklar arasındaki çapraz kontaminasyonu sınırlamak için boş olduğu şekilde plaka ayarlayın. Deneysel suretin çoğaltma oranının bir ölçüsü olan çoğaltma yamaçları normalize etmek için, daha sonra, bir standart olarak kullanılacak şekilde, pozitif kontrol, zorunludur.
  4. , Otomatik bir hücre sayacı kullanılarak GXR25 hücre sayımı. Tüm enfeksiyonlar (5 x 10 5 x # enfeksiyonları) için toplam gereken hücre sayısını hesaplayın. 50 ml konik bir tüp ve hücrelerini pellet haline getirmek için santrifüje gerekli hacmi kısım. Gerekli her zaman daha% 25 daha fazla enfeksiyonları için hesaplar.
  5. 5 x 10 5 hücre / 100 ul bir konsantrasyonda cRPMI dikkatli bir şekilde aspire ortam ve tekrar süspansiyon.
  6. Steril bir çukur içine pipet hücreleri ve iyice karıştırın. Çok kanallı bir pipet kullanılarak, seyreltilmiş virüs içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 ul hücre ilave edin. Mix iyice.
  7. Her bir polibren 5 mg / ml (100 x) solüsyonu 2 ul iyi ekleyin ve iyice karıştırın hücreleri.
  8. 3 saat boyunca% 5 CO2 ile doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de inkübe edilir.
  9. Enfekte hücreleri yıkamak için, santrifüj 96 oyuklu V-tabanlı plaka hücrelerini pellet haline getirmek. Daha sonra dikkatli bir ortamın 150 ul çıkarın ve hücre pelletini bozmadan cRPMI taze 150 ul ile değiştirin. Yeterince hücreleri yıkamak için santrifüj (dahil) 2 kez daha tekrarlayın.
  10. Son santrifüj uygulanmış, ve 150 ul cRPMI ilave edildikten sonra, çok kanallı bir pipet ile hücre pelletini ve 24-çukurlu bir doku kuyuda cRPMI her biri de bağımsız bir şekilde 800 ul kadar tüm hücre / virüs karışımı (yaklaşık 200 ul) kültür plakası.
  11. 37 ° C'de% 5 CO2 doku kültürü inkübatöründe plaka.
  12. Her iki gün, kültür yüzer yüzeyinden 100 ul da ayrılması ve 96 oyuklu U transfer-Dip plaka ve mağaza virüs niceleme Deney yapılmadan kadar -80 ° C'de donduruldu. NOT: 96 oyuklu plakalar içinde yüzer dikkatli düzenlemesi, radyo-etiketli ters transkriptaz (RT) deneyi ile viryon ölçümü sırasında, kültür yüzer madde, çok kanallı bir pipet transferi sağlayacaktır. Her plaka RT deneyi okuma arası plaka değişimi normalleştirmek amacıyla bir enfeksiyon standart numuneler içermelidir.
  13. Iyice yeniden süspanse edilmesi hücreler tarafından 2 ve geriye kalan hacim (450 ul) yarısını uzaklaştırılması: split hücreleri 1 her 100 ul numune alınmasından sonra çekilmesi. Her bir oyuğa taze 550 ul cRPMI ekleyerek orijinal hacmi (1 mi) yükleyin.

Hücre kültür süpernatanlarından Ters transkriptazın 7. Analiz (RT)

Protokol Ostrowski ve diğ 40 uyarlanmıştır.

  1. Radyoaktif maddeler ile kullanım için bir BSL-3 tesis biyolojik güvenlik kaputu ayarlayın.
    1. Hoo emici kağıt yerleştirinAspiratör d ve yerine aspiratör radyoaktif kullanımı için belirlenmiş. Not: Tüm radyoaktif atıklar uygun güvenlik düzenlemelerine uygun olan atılmalıdır.
  2. RT ana karışımı her biri 1 mi kana [33 P α-] dTTP'nin 10 mCi / ml ve 1 M ditiyotreitol (DTT) 4 ul 1-2 ul (Tablo 10 ve Ostrowski ve ark. 40).
  3. Dikkatlice steril bir çukur 1.000 ul pipet ve transfer ile RT master mix, DTT ve [33 P α-] dTTP'nin her 1.5 ml mikrosantrifüj tüp karıştırın.
  4. Etiketli RT 25 ul, 96 oyuklu ince duvarlı PCR plakanın her oyuğuna karıştırın dağıtın. Not: pozitif bir kontrol (MJ4 WT enfeksiyonu) ve negatif bir kontrol (sahte enfeksiyon) için boşluk içerir.
  5. RT ana karışımı ihtiva eden PCR plakaya her bir süpernatanın 5 ul ekleyin.
  6. Yapışkan PCR folyo ile plaka sızdırmaz şekilde kapatılır ve bir PCR, 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir. Güvenlik nedenleriyle, rinse pipet Amphyl ile ipuçları ve daha sonra radyoaktif atık bertaraf edilecektir Amphyl atık içeren küçük bir kapta ipuçları, atmayın.
  7. Kuluçkadan sonra, 200 ul, çok kanallı bir pipet kullanarak bir folyo küçük delik açmak. Not: pipet uçları kuyudaki sıvı temas ederse, bir sonraki sütun veya satıra geçmeden önce ipuçları değiştirin.
  8. Karışım örnekler 5x ve DE-81 kağıdı için her numunenin transferi 5 ul. Hava 10 dakika kurutulur.
  9. Yıkama lekeler, 1x SSC (sodyum klorür, sodyum sitrat) ile 5 kat, ve, yıkama başına 5 dakika% 90 etanol ile sonra 2 x. Kendine kurumaya bırakın.
    1. Blot kapak ve 5 dakika boyunca çalkalanır kadar yıkama tamponu (1 x SSC ve% 90 EtOH) ekleyin, bu gibi bir sandviç muhafaza kutusu gibi ayrı bir yıkama kabı, her blot yerleştirin.
    2. Ayrı bir kapta ve tekrar yıkama tamponu içine dökün. Not: İlk 3 yıkar radyoaktif kabul edilir ve düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir. Son 2 yıkar düzenli bertaraf edilebilir.
  10. Kuruduktan sonra, araçefully Saran leke sarın ve gece boyunca oda sıcaklığında, sıkıca yalıtılmış küçük bir kaset içinde phosphoscreen maruz sarın.
  11. Bir phosphorimager ile phosphoscreens Analiz ve radyoaktif transkript ölçmek.
  12. OptiQuant yazılımını kullanarak her radyoaktif sinyalin etrafında bir çember çizin. Çoğaltma eğrilerini oluşturmak için Dijital Işık Birimi (DLU) değerlerinin grafiğini.
  13. Replikasyon kapasitesi skorlarını oluşturmak amacıyla, DLU değerleri Geçmiş 10 -transformed ve eğimleri 2, 4 ve 6 gün zaman noktalarında kullanılarak hesaplanmıştır. Çoğaltma yamaçları sonra sipariş oluşturmak çoğaltma kapasite skorları WT MJ4 eğimi ile ayrılır. Bu deney içi değişkenliği azaltmak için aynı RT plaka elde MJ4 WT değerlerine göre normalize etmek önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düzgün tam fonksiyonel, bulaşıcı Gag-MJ4 şimeralar montaj yeteneğine sahip bir proviral plazmid oluşturur bu protokolü, yürütmek amacıyla, büyük bakım uygun PCR amplıkonları oluşturmak için alınmalıdır. PCR uygun büyüklükte öğürme Amplikon'u üretti olmadığının saptanması önemlidir. Ürünler, şekil 1A'da gösterilen yaklaşık olarak 1700 bp'lik bir amplikon, 100 baz çifti (bp) içinde olmalıdır. Bu fragmanın tam uzunluğu, çalışma kapsamında gag geni bağlı olarak değişecektir. Daha sonra, MJ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nedeniyle uzunluk ve bu protokol, teknik doğası nedeniyle, kimerik Gag-MJ4 plasmidlerin kurulmasında her ikisi için önemli bir unsur olarak ayrıca viral replikasyon kapasitesinin ölçümü için olan birkaç adım vardır. Bu protokolde belirtilen MJ4 yabancı öğürme genlerin tanıtımı için kısıtlama enzim bazlı klonlama stratejisi önceden kullanılan rekombinasyon bazlı yöntemlere göre çok sayıda avantajları olmasına rağmen kritik adımlar tam uyulmadığı takdirde, protokol teknik olarak zor olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırmacılar, bu çalışmaya katılan Zambiya'daki tüm gönüllülere ve bu çalışmayı mümkün kılan Lusaka'daki Zambiya Emory HIV Araştırma Projesi'ndeki tüm personele teşekkür eder. Araştırmacılar, teknik yardım ve numune yönetimi için Jon Allen, Smita Chavan ve Mackenzie Hurlston'a teşekkür eder. Ayrıca Dr. Mark Brockman'a tartışmaları ve GXR25 hücrelerinin cömert bağışı için teşekkür etmek istiyoruz.

Bu çalışma R01 AI64060 ve R37 AI51231 (EH) ve Uluslararası AIDS Aşı Girişimi tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışma, kısmen Amerika Birleşik Devletleri Uluslararası Kalkınma Ajansı (USAID) aracılığıyla Amerikan halkının cömert desteğiyle mümkün olmuştur. İçerikler çalışma yazarlarının sorumluluğundadır ve USAID'in veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin görüşlerini yansıtmak zorunda değildir. Bu çalışma aynı zamanda kısmen Emory AIDS Araştırma Merkezi'ndeki Viroloji Çekirdeği (Grant P30 AI050409) tarafından da desteklenmiştir. DC ve JP kısmen Action Cycling Fellowships tarafından desteklendi. Bu çalışma kısmen Yerkes Ulusal Primat Araştırma Merkezi temel hibesi (2P51RR000165-51) ile desteklenmiştir. Bu proje aynı zamanda kısmen Ulusal Araştırma Kaynakları P51RR165 Merkezi tarafından finanse edilmiştir ve şu anda Araştırma Altyapısı Programları Ofisi / OD P51OD11132 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PCR Reaktifleri
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz giderme
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz giderme
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz giderme
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz
giderme MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz giderme
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz giderme
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz giderme
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz için3
: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz giderme
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz giderme
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz giderme
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDTDNAÖzel Oligo25 nmol, standart tuz giderme
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Nükleaz içermeyen suFisherSH30538FSHyclone
QIAamp Viral RNA Mini Kititarafından üretilmiştir Qiagen52906
Simport PCR 8 Şerit Tüpler, Mavi (Düz Kapak)DaiggerEF3647BX
SuperScript III tek adımlı RT-PCR sistemiYaşam Teknolojileri/Invitrogen12574035
Phusion Sıcak başlangıç II DNA polimerazFisherF-549L
PCR Nükleotid Roche4638956001
Agaroz, yüksek jel mukavemetiFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb DNA merdiveniFisherPRG5711Promega Sybr tarafından üretilmiştir
Güvenli DNA Jel Boyası, 10.000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Sihirbaz SV Jel ve PCR Temizleme SistemiPromegaA9282
Tıraş bıçakları, tek kenarlıFisher12-640Cerrahi Tasarım
Thermocycler tarafından üretilmiştir, PTC-200MJ Research
Mikrobiyoloji & Klonlama Reaktifleri
LB Ağar, MillerFisherBP1425-2
LB Et Suyu, LennoxFisherBP1427-2
Steril 100 x 15 mm polistiren Petri kaplarıFisher08-757-12
Ampisilin sodyum tuzuSigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml Polipropilen yuvarlak tabanlı tüplerBD Biosciences
NgoMIV kısıtlama endonükleazıNew England BioLabsR0564L
BclI kısıtlama endonükleazıNew England BioLabsR0160L
HpaI kısıtlama endonükleazıNew England BioLabsR0105L
T4 DNA Ligaz, 5 U/μ lRoche10799009001
JM109 yetkin hücreler, >108< / sup> cfu/μ gPromegaL2001
PureYield plazmid miniprep sistemiPromegaA1222
Güvenli Görüntüleyici 2.0 Mavi Işık TransilluminatorInvitrogenG6600
Mikrofüj 18 santrifüjBeckman Coulter367160
Hücre Kültürü Reaktifleri
Amphyl temizleyici/dezenfektanFisher22-030-394
Fugene HD, 1 mlVWRPAE2311Promega
Heksadimetrin bromür (Polibren)Sigma-AldrichH9268-5G
Costar Plakaları, 6 kuyulu, düzFisher07-200-83Corning Life tarafından üretilmiştir
Costar Plakaları, 24 kuyulu, düzFisher07-200-84Corning Life
Costar Plakaları, 96 kuyulu, yuvarlakFisher07-200-95Corning Life
Şişeleri tarafından üretilmiştir, Corning filtre üstü/eğimli boyun, 75 cm2Fisher10-126-37
Şişeler, Corning filtre üstü/eğimli boyun, 150 cm2Fisher10-126-34Corning Life tarafından üretilmiştir
Konik Tüpler, 50 ml, mavi kapaklıFisher14-432-22BD Biosciences tarafından üretilmiştir
Konik Tüpler, 15 ml, mavi kapaklıFisher14-959-70CBD Biosciences tarafından üretilmiştir
Tripsin-EDTAFisherMT25052CIMediatech
RPMI, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
Penisilin / Streptomisin/Glutamin, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS, magnezyum ve kalsiyum içeren, 500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS magnezyum ve kalsiyum içermeyenLife Technologies/Invitrogen20012-050
Sarstedt tüpleri, çeşitli renklerSarstedt72.694.996
Rezervuar Tepsileri Çok kanallı, 55 mlFisher13-681-501
DEAE-DextranFisherNC9691007
Corning 96 iyi berrak V alt doku kültürü ile tedavi edilmiş mikroplakaFisher07-200-96Corning Life
HEPES tarafından üretilmiştir, 1 M Tampon ÇözeltiLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, Tanımlı, 500 mlFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941Promega Glutaraldehyde tarafından üretilmiştir
, Grade II, H2O içinde %25Sigma-AldrichG6257-100ML
1 M Magnezyum klorür çözeltisiSigma-AldrichM1028-100ML
Moleküler biyoloji için formaldehit çözeltisi, %36,5Sigma-AldrichF8775-500ML
Potasyum hekzasiyanoferrat(II) trihidratSigma-AldrichP9387-100G
Potasyum hekzasiyanoferrat(III)Sigma-AldrichP8131-100G
Allegra X15-R santrifüjBeckman Coulter392932
TC10 otomatik hücre sayacıBio-Rad1450001
VistaVision ters mikroskopVWR
Ters Transkriptaz Miktar Tayini Test Reaktifleri
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci / mmol, 10 mCi / ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0Life Technologies/Invitrogen15568025KOH 2 M ile pH 7.8'e ayarlanmalıdır
Potasyum klorür (KCl)Life Technologies/InvitrogenAM9640GAyarlayın 1 M çözeltiye
0.5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
Poliadenlik asit (Poli rA) potasyum tuzu Midland Reaktif A.Ş.P-3001
Oligo d (T) primerYaşam Teknolojileri / Invitrogen18418-012
Ditiyotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
SR, Süper Çözünürlüklü Fosfor Ekran, KüçükPerkin-Elmer7001485
Corning Costar Thermowell 96 kuyulu plaka modeli (M) PolikarbonatFisher07-200-245Corning Life tarafından üretilmiştir
Corning 96 kuyulu Mikroplaka Alüminyum Sızdırmazlık Bandı, SterilOlmayan Fisher07-200-684Corning Life
tarafından üretilmiştir DE-81 anyon değişim kağıdıWhatman3658-915
Trisodyum sitrat dihidratSigma-AldrichS1804-1KG
Sodyum KlorürFisherS671-3
Otoradyografi kasetiFisherFB-CA-810
Siklon depolama fosfat ekranıPackard
352059tarafından üretilmiştir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 68, 6103-6110 (1994).
  2. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology. 68, 4650-4655 (1994).
  3. Jin, X., et al. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. The Journal of experimental medicine. 189, 991-998 (1999).
  4. Schmitz, J. E., et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science. 283, 857-860 (1999).
  5. Brumme, Z. L., et al. Marked epitope- and allele-specific differences in rates of mutation in human immunodeficiency type 1 (HIV-1) Gag, Pol, and Nef cytotoxic T-lymphocyte epitopes in acute/early HIV-1 infection. Journal of virology. 82, 9216-9227 (2008).
  6. Leslie, A. J., et al. HIV evolution: CTL escape mutation and reversion after transmission. Nature medicine. 10, 282-289 (2004).
  7. Phillips, R. E., et al. Human immunodeficiency virus genetic variation that can escape cytotoxic T cell recognition. Nature. 354, 453-459 (1991).
  8. Price, D. A., et al. Positive selection of HIV-1 cytotoxic T lymphocyte escape variants during primary infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 1890-1895 (1997).
  9. Goulder, P. J., et al. Late escape from an immunodominant cytotoxic T-lymphocyte response associated with progression to AIDS. Nature. 3, 212-217 (1997).
  10. Tang, J., et al. Favorable and unfavorable HLA class I alleles and haplotypes in Zambians predominantly infected with clade C human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 76, 8276-8284 (2002).
  11. Prentice, H. A., et al. HLA-B*57 versus HLA-B*81 in HIV-1 infection: slow and steady wins the race. Journal of virology. 87, 4043-4051 (2013).
  12. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 2709-2714 (2000).
  13. Leslie, A., et al. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection. Journal of virology. 84, 9879-9888 (2010).
  14. Kaslow, R. A., et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nature medicine. 2, 405-411 (1996).
  15. Altfeld, M., et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS. 17, 2581-2591 (2003).
  16. Kiepiela, P., et al. CD8+ T-cell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load. Nature medicine. 13, 46-53 (2007).
  17. Mothe, B., et al. Definition of the viral targets of protective HIV-1-specific T cell responses. Journal of translational medicine. 9, 208(2011).
  18. Peyerl, F. W., Barouch, D. H., Letvin, N. L. Structural constraints on viral escape from HIV- and SIV-specific cytotoxic T-lymphocytes. Viral immunology. 17, 144-151 (2004).
  19. Rolland, M., et al. Broad and Gag-biased HIV-1 epitope repertoires are associated with lower viral loads. PloS one. 3, e1424(2008).
  20. Wagner, R., et al. Molecular and functional analysis of a conserved CTL epitope in HIV-1 p24 recognized from a long-term nonprogressor: constraints on immune escape associated with targeting a sequence essential for viral replication. J Immunol. 162, 3727-3734 (1999).
  21. Wang, Y. E., et al. Protective HLA class I alleles that restrict acute-phase CD8+ T-cell responses are associated with viral escape mutations located in highly conserved regions of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 83, 1845-1855 (2009).
  22. Chopera, D. R., et al. Transmission of HIV-1 CTL escape variants provides HLA-mismatched recipients with a survival advantage. PLoS pathogens. 4, e1000033(2008).
  23. Crawford, H., et al. Evolution of HLA-B*5703 HIV-1 escape mutations in HLA-B*5703-positive individuals and their transmission recipients. The Journal of experimental medicine. 206, 909-921 (2009).
  24. Boutwell, C. L., et al. Frequent and variable cytotoxic-T-lymphocyte escape-associated fitness costs in the human immunodeficiency virus type 1 subtype B Gag proteins. Journal of virology. 87, 3952-3965 (2013).
  25. Brockman, M. A., et al. Escape and compensation from early HLA-B57-mediated cytotoxic T-lymphocyte pressure on human immunodeficiency virus type 1 Gag alter capsid interactions with cyclophilin A. Journal of virology. 81, 12608-12618 (2007).
  26. Crawford, H., et al. Compensatory mutation partially restores fitness and delays reversion of escape mutation within the immunodominant HLA-B*5703-restricted Gag epitope in chronic human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 81, 8346-8351 (2007).
  27. Martinez-Picado, J., et al. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 80, 3617-3623 (2006).
  28. Schneidewind, A., et al. Escape from the dominant HLA-B27-restricted cytotoxic T-lymphocyte response in Gag is associated with a dramatic reduction in human immunodeficiency virus type 1 replication. Journal of virology. 81, 12382-12393 (2007).
  29. Wright, J. K., et al. Impact of HLA-B*81-associated mutations in HIV-1 Gag on viral replication capacity. Journal of virology. 86, 3193-3199 (2012).
  30. Kawashima, Y., et al. Adaptation of HIV-1 to human leukocyte antigen class I. Nature. 458, 641-645 (2009).
  31. Goepfert, P. A., et al. Transmission of HIV-1 Gag immune escape mutations is associated with reduced viral load in linked recipients. The Journal of experimental medicine. 205, 1009-1017 (2008).
  32. Brockman, M. A., et al. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication capacity that may be largely compensated for in chronic infection. Journal of virology. 84, 11937-11949 (2010).
  33. Huang, K. H., et al. Progression to AIDS in South Africa is associated with both reverting and compensatory viral mutations. PloS one. 6, e19018(2011).
  34. Wright, J. K., et al. Gag-protease-mediated replication capacity in HIV-1 subtype C chronic infection: associations with HLA type and clinical parameters. Journal of virology. 84, 10820-10831 (2010).
  35. Wright, J. K., et al. Influence of Gag-protease-mediated replication capacity on disease progression in individuals recently infected with HIV-1 subtype. C. Journal of virology. 85, 3996-4006 (2011).
  36. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. Journal of virology. 59, 284-291 (1986).
  37. Brockman, M. A., Tanzi, G. O., Walker, B. D., Allen, T. M. Use of a novel GFP reporter cell line to examine replication capacity of CXCR4- and CCR5-tropic HIV-1 by flow cytometry. Journal of virology. 131, 134-142 (2006).
  38. Ndung'u, T., Renjifo, B., Essex, M. Construction and analysis of an infectious human Immunodeficiency virus type 1 subtype C molecular clone. Journal of virology. 75, 4964-4972 (2001).
  39. Prince, J. L., et al. Role of transmitted Gag CTL polymorphisms in defining replicative capacity and early HIV-1 pathogenesis. PLoS pathogens. 8, e1003041(2012).
  40. Ostrowski, M. A., Chun, T. W., Cheseboro, B., Stanley, S. K., Tremblay, M., et al. Detection assays for HIV proteins. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al.]. 12 (Unit 12 15), Forthcoming.
  41. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  42. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
  43. Bichara, M., Pinet, I., Schumacher, S., Fuchs, R. P. Mechanisms of dinucleotide repeat instability in Escherichia coli. Genetics. 154, 533-542 (2000).
  44. Ackerson, B., Rey, O., Canon, J., Krogstad, P. Cells with high cyclophilin A content support replication of human immunodeficiency virus type 1 Gag mutants with decreased ability to incorporate cyclophilin A. Journal of virology. 72, 303-308 (1998).
  45. Dudley, D. M., et al. A novel yeast-based recombination method to clone and propagate diverse HIV-1 isolates. BioTechniques. 46, 458-467 (2009).
  46. Ganser-Pornillos, B. K., von Schwedler, U. K., Stray, K. M., Aiken, C., Sundquist, W. I. Assembly properties of the human immunodeficiency virus type 1 CA protein. Journal of virology. 78, 2545-2552 (2004).
  47. Forshey, B. M., von Schwedler, U., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. Journal of virology. 76, 5667-5677 (2002).
  48. Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G., Haseltine, W. A. Effect of mutations affecting the p6 gag protein on human immunodeficiency virus particle release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 3195-3199 (1991).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

HIV 1 Replication CapacityGag MJ4 Chimeric VirusesRestriction Enzyme CloningSubtype C HIV 1CEM Based T Cell LineRadio Labeled Reverse Transcriptase AssayViral Stock TiteringNested RT PCR AmplificationBCL One Restriction DigestionGXR25 Cell Infection

İlgili makaleler