Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

12K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51517

⸱

16 Ağustos 2014

 , 
1Biomedical Engineering, Wayne State University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, nöronları yönlendirmek için doku mühendisliği iskeleleri geliştirmek için elektrospinning ve mikroküreleri birleştirir. Sinir büyüme faktörü PLGA mikroküreleri içinde kapsüllendi ve Hyaluronik Asit (HA) fibröz iskelelere elektrospre edildi. Protein biyoaktivitesi, iskelelerin birincil civciv Dorsal Kök Gangliyonları ile tohumlanması ve 4-6 gün boyunca kültürlenmesi ile test edildi.

Özet

Bu prosedür, sinir hücresi büyümesini yönlendirmek için çok yönlü bir substrat üretme yöntemini açıklar. Bu sistem mekanik, topografik, yapışkan ve kimyasal sinyalleri içerir. Mekanik özellikler, elektroeğrilmiş lifleri imal etmek için kullanılan malzeme türü tarafından kontrol edilir. Bu protokolde yumuşak lifli bir iskele oluşturmak için ~500 Pa'lık bir gerilme modülüne sahip %30 metakrilatlanmış Hyaluronik Asit (HA) kullanıyoruz. Dönen bir mandrel üzerine elektrospinning yapmak, topografik bir işaret oluşturmak için hizalanmış lifler üretir. Yapışma, iskelenin fibronektin ile kaplanmasıyla sağlanır. Burada ele alınan birincil zorluk, iskelenin derinliği boyunca uzun süreler boyunca kimyasal bir sinyal sağlamaktır. Bu prosedür, Sinir Büyüme Faktörü (NGF) içeren poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) mikro küreciklerinin üretilmesini ve elektrospinning işlemi sırasında iskelenin bu mikro kürelerle doğrudan emprenye edilmesini açıklar. Yüksek saf kuvvetler ve elektrik yükleri de dahil olmak üzere zorlu üretim ortamı nedeniyle, protein canlılığı üretimden sonra ölçülür. Sistem, 60 günden fazla bir süre boyunca protein salınımı sağlar ve birincil sinir hücresi büyümesini desteklediği gösterilmiştir.

Giriş

Sinir doku mühendisliği devam eden zorluklardan biri sinirleri doğal olarak yetişen hücre dışı matris, taklit eden bir sinir kanalı (NC) yaratıyor. Araştırma hücreler, mekanik, topografik, yapışkan ve kimyasal sinyaller dahil olmak üzere 1-3 ortamında birçok faktöre yanıt göstermiştir. Bu alandaki başlıca sorunlardan biri, sinyallerin uygun kombinasyonunu belirlemek ve hücre büyümesini desteklemek için 4 uzun bir süre boyunca muhafaza ipuçlarını bir sistem imal edilir. Çevresel nöronlar yumuşak alt-tabakanın tercih ettikleri bilinmektedir hizalanır lifler tarafından yönlendirilebilir ve sinir büyüme faktörü (NGF) 5-7 yanıt. Hafta boyunca kimyasal ipuçları sağlayabilir NC'ler yakın allogreftlere, sinir onarımı 8,9 güncel altın standardın için geliştirilmiş fonksiyonel iyileşmeyi sağlamak için gösterilmiştir.

Malzemeler ve üretim yöntemleri, çeşitli mekanik ve topografik üretmek için kullanılabilirdiğerleri 10-13 işaret eder. Mekanik ipuçları 1,13 kritik uygulama için uygun malzeme seçimi yaparak, seçilen malzeme doğasında vardır. Üretim yöntemleri topografik ipuçları faz ayrılması, öz-montaj ve 1,13 electrospinning dahil kontrol etmek. Mikro uygulamalar, mikroflüidik, photopatterning, dağlama, tuz halindeki salamuralar, köpükler ya da gaz için, aynı zamanda 14-17 kullanılabilir. ELEKTROSPİNNİNG nedeniyle esneklik ve üretim 13,18-23 kolaylığı doku kültürü için elyaflı alt mühendisi en popüler yolu olarak ortaya çıkmıştır. Electrospun nanolifler kendini püskürtmek ve boşaltmak için 24, kısa bir aralık üzerinden germek için neden olan polimer solüsyonuna, bir yüksek voltaj uygulanarak imal edilmektedir. Bir hizalanmış iskele topraklanmış döner mandrel üzerine elyafların toplanması ile oluşturulabilir ve bağlantısız iskeleler ve durağan bir plaka 25 üzerinde toplanır. Yapışma sinyal elyaflı skafold wit kaplanması ile elde edilebilirs fibronektin veya 26 electrospinning önce HA gibi RGD gibi bir yapışma peptidi, konjuge.

Onlar kontrollü salım için bir kaynak gerekiyor çünkü bu tür büyüme faktörleri gibi kimyasal sinyalleri, uzun dönemler boyunca korumak için en zor. Birçok sistem başarı çeşitli düzeylerde ile electrospun lifli ağlara kontrollü salımını eklemek için denenmiştir. Bu yöntemler harman elektrospinning, emülsiyon elektrospinning, çekirdek-kabuk elektrospinning ve protein konjugasyon 27 içerir. Buna ek olarak, elektro geleneksel olarak bu nedenle proteinin biyo kabul edilmelidir muhafaza, proteinin 28 canlılığını etkileyebilen uçucu bir çözücü içinde yapılır.

Bu yaklaşım, özellikle periferik sinir büyüme için ayarlanabilir bir iskele oluşturmak için mekanik, topografik, kimyasal ve yapıştırıcı sinyalleri birleştirerek giderir. İskele mekanik tam sentetize edilmesi ile kontrol edilirMetakrilatlanmış Hyaluronik Asit (HA). Methacrylation siteleri fotoğraf reaktif crosslinkers bağlamak için kullanılır. Çapraz malzeme artık suda çözünür ve münhasıran enzimler 29 tarafından bozuldu. Çapraz bağlama miktarı degradasyon oranı, mekanik ve malzemenin diğer fiziksel özelliklerini değiştirir. ~ 500 Pa arasında bir gerilme modülüne sahiptir methacrylation% 30 ile HA kullanılarak, sinir dokusunun doğal mekanik yakındır ve tipik olarak nöronlar 26,29 tercih edilen yumuşak bir alt-tabakayı oluşturur. Dönen mandrel üzerinde Elektrospinning topografik bir işaret sağlayacak şekilde ayarlanır lifleri oluşturmak için kullanılır. Ile birlikte mikro-elektrospinning kullanma süreleri zarfında iskele içinde kimyasal sinyaller sağlar. Kimyasal sinyali oluşturmak için kullanılan NGF içeren nörit büyüme mikroküreler desteklemek için. NGF üretimi sırasında zorlu çözücüler karşılaşmasa bu yüzden çoğu electrospun malzemelerin aksine HA su içinde çözünür. SCA, yapışkan bir sinyali eklemek içinffold fibronektin ile kaplanır. NGF fibronektin (yapıştırıcı) ile kaplanmış mikroküreler (kimyasal) bırakmadan yumuşak (mekanik) hizalanmış (topografik) lifler: tamamlandı sisteminin yukarıda açıklanan sinyalleri dört türlerini içerir. Üretim ve bu sistemin test bu protokolü tarif edilmiştir.

Proses, bir su-içinde-yağ-içinde-su emülsiyonu ile çift mikrosferlerin üretimi ile başlar. Emülsiyon, bir yüzey aktif madde, polivinil alkol (PVA) ile stabilize edilir. İç su fazı protein içerir. Bu diklorometan (DCM) içinde çözüldü PLGA kabuk malzeme içeren, yağ fazına ilave edilir olarak, yüzey aktif madde DCM proteini koruyan fazlar arasında bir bariyer oluşturur. Bu emülsiyon, mikro kürelerin dış yüzeyini oluşturmak için polivinil alkol içeren bir su fazı içinde dağılmış daha uzundur. Kararlı bir emülsiyon, DCM buharlaşmasını sağlamak için karıştırılır. Durulama ve liyofılleme sonra kuru mikroküreler cont ile bırakılır, geri kalan proteini.

Mikroküreler tamamlandıktan sonra onlar iskelelerinin içine electrospun hazırdır. Öncelikle elektro solüsyon hazırlanır. Solüsyonun viskozitesi uygun elyaf formasyonu için çok önemlidir. Saf HA Çözümleri Bu zorunluluğa uymayan; PEO üretebilmektedir izin vermek için bir taşıyıcı polimer olarak ilave edilir. Bu mikrosferler, mikro-dağılmış olan elyaflı yapı iskeleti sonuçlanan çözeltisi ve electrospun eklenir.

Üretim işlemi tamamlandıktan sonra, protein, varlığını doğrulamak için test edilmelidir. Bunu yapmak için, NGF'ye tepki veren bir birincil hücre kullanılabilir. Bu protokol, 8-10 günlük tavuk embriyolarından sırt kök gangliyon (DRG) kullanır. Hücre demetleri NGF veya boş olanlar ile dolu küreleri içeren iskelelerinin üzerine ekilir. NGF hala canlı olup olmadığını NGF içeren iskelelerde gelişmiş akson büyümesini görmelisiniz. NGF artık geçerli değilse o olacakdeğil genişletmek için nevritlerle teşvik ve denetime benzer görünmelidir.

Burada tarif edilen prosedür, kesin malzeme basit değişiklikler, electrospinning yöntemi ve sistemi, çeşitli doku ve hücre tipleri için optimize edilebilir proteinleri ile, ancak, sinir destek üzerinde odaklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Su / Yağ / Su Çift Emülsiyon Mikroküre Üretimi

  1. Üretim ve% 2 iyonu giderilmiş suda bir polivinil alkol (PVA) v çözeltileri% 0.5 a / hazırlar. Berrak olana kadar 50 ° C de karıştırdıktan çözüm, bu birkaç saat alabilir. Deiyonize su içinde% 2 h / h İzopropil Alkol içinde bir çözeltisi hazırlandı.
  2. Arzu edilen hidrofilik, proteinin bir sulu çözelti hazırlayın. Aşağıdaki tablo, örnek formülasyonları sağlar.

figure-protocol-1
Tablo 1:. Örnek Protein Çözümleri aşağıdaki protein çözümleri başarıyla kapsüllü ve electrospun bu protokolü kullanarak edilmiştir. Gerektiğinde diğer hidrofilik, protein çözeltileri kullanılabilir.

  1. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine% 0.5 PVA çözeltisi 40 ml yerleştirin ve bir kenara.
  2. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 65:35 300 mg 'poli 3 ml diklorometan (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA). , Bir girdaplı karıştırıcı PLGA çözünmesini hızlandırmak için kullanılabilir.
  3. Protein çözeltisi ve 200 ul% 2 PVA-çözeltisinden 4 ul birleştirin. PLGA solüsyonu içine dökün protein (1.4 adım). Çözümler çoğunlukla ayrı kalacaktır.
  4. Buzlu su içeren bir deney kabı içine tüp yerleştirin. ~ 10 Watt (RMS) bir değnek sonikator kullanarak, bir üniforma kremsi beyaz emülsiyon oluşturulur kadar bir kaç saniye (5-10) için çözüm çalkalayın.
  5. % 0.5 PVA (adım 1.3) ihtiva eden 50 ml'lik bir tüp içine emülsiyonu dökün. ~ 20 saniye boyunca bir vorteks mikserde yüksek hızda çözüm karıştırın. Çözelti bulanık bir görünüm geliştirecektir.
  6. 2 dakika boyunca 350 rpm'de bir karıştırma plakası üzerinde 200 ml'lik bir cam ve yere emülsiyonu aktarın. Karıştırma plakası üzerinde beher% 2 izopropil alkol 50 ml ilave edilir. Karışım sertleştirmek üzere DCM buharlaşmaya izin vermek için 1 saat içinde ve en az bir PLGA için karıştırma devam etmesini sağlar.
  7. Transferi to santrifüj tüpleri içine mikro-küre çözeltisi.
  8. 3 dakika boyunca 425 x g'de santrifüj. Mikro küreler, bu tüpün altında toplanır ve beyaz görünür. Dikkatlice mikrosferler üzerinde tüpten çıkarın ve 500 ml'lik bir şişe içinde depolar.
  9. Tam tüpü üç çeyreği doldurulması ve sıvı içindeki mikro küreleri dağıtmak için sallama ile, iyonu giderilmiş su ile mikro küreleri durulayın.
  10. Tekrar 1.10 ve 1.11 dört kez yineleyin.
  11. Son durulama sonra, diğer örnekleri ile 500ml şişe içinde tekrar yer supernatant çıkarın. Daha sonra en az 24 saat boyunca liyofilize, santrifüj tüpü içinde toplanmıştır küreleri dondurun.
  12. Bir ışık mikroskobu altında veya bir Taramalı Elektron Mikroskobu ile mikroküreler gözünüzde canlandırın. 60 um'den daha büyük olmayan bir mikro-etkili üretebilmektedir içindir. Mikro-küreler çok büyük olursa, uzun sonikasyon veya girdaplama kere adım 1.6, 1.7 ya da gerekli olabilir.
  13. -20 ° C derin dondurucuda kurutulmuş mikroküreler saklayın.
  14. Opsiyonel: Aşama 1.10 30'dan 500ml şişe içinde protein miktarı test etmek için, üreticinin talimatlarına göre, bir protein deneyi kullanın. Bu mikro-kapsüllenmiş protein üretim sürecinde kullanılan ne çözeltide miktarının çıkarılması ile yüzde hesaplamak için kullanılır.

. Mikrosferde protein yer PLGA solüsyonu 31 ml x 2 Rhodamine ug / ekleyin ve bir FITC konjüge protein kapsüllemek görselleştirmek için 1 bir örneğini göstermektedir: Not.

Mikrokürelerin 2. Elektrospinning

  1. Önceki elektro çözeltisinin hazırlanması için, 37 ° C sıcaklıkta eritilmesi ile, iyonu giderilmiş su içinde foto-başlatıcı bir% 0.5 w / v solüsyonu oluşturmak. Bu işlem birkaç saat sürebilir.
  2. Hyaluronik asit (Meha) metaakrilat karşı 29,% 3 (Burdick ve ark. Sentez için bakınız) w / 2% oluşturma/ hac 900 kD poli (etilen oksid) (PEO) ve% 0.05 w / v, deiyonize su içinde foto başlatıcı ağırlık solüsyonu.
    1. İstenen hacme için Meha ve PEO doğru miktarını hesaplayın. Örneğin, çözelti, 10 ml electrospinning Meha, 200 mg ve 300 mg PEO gerektirir.
    2. Istenen son hacminin (9 Bu örnek için mi)% 90 deiyonize su içinde çözülür PEO. Bu işlem birkaç saat sürebilir, 37 ° C'de ısıtılmış bir karıştırma plakası veya su banyosu işlemi hızlandırmak için kullanılabilir.
    3. Sonraki Meha ekleyin ve berraklaşana kadar karıştırın çözelti üzere, bir girdaplı karıştırıcı kullanılır. Bu sadece bir kaç dakika sürer.
    4. Son olarak geriye kalan% 10 hacim (bu, örneğin, 1 mi) doldurmak üzere% 0.5 foto başlatıcı çözeltisi ekleyin.
  3. 400 mg / ml kadar, istenen yoğunlukta mikro küreleri ekleyin. Bu mikrosferler, eşit çözelti içinde dağıtılır kadar vorteksli bir mikserde çözüm karıştırın.
  4. Bir şırıngaya çözüm aktarın ve 6 inç ve 18 kalibrelik bl iliştirmekulastırınız ucu iğne.
  5. Bir şırınga pompası şırınga ve 1.2 ml / saat olarak dağıtmak için ayarlanmış.
  6. Toplama plakası ya da bir mandrel üzerine bir alüminyum folyo tabakası bantlayın. Bu bitmiş skafoldun kolay temizlemek ve saklanmasına olanak vermektedir. Bir dönen mandrel uyumlu lifleri oluşturmak için kullanılır. Düz bir plaka ya da hareketsiz mandrel rasgele düzenlenmiş fiberlerin sonuçlanacaktır.
  7. Toplama aparatı ile yüksek gerilim güç kaynağından topraklama kablosu bağlayın. Iğne pozitif kablosunu bağlayın.
  8. Iğne ucu ve toplama yüzeyi arasında 15 cm olacak şekilde şırınga pompası ve bir toplama yüzeyi ayarlayın.
  9. Çözüm şırınganın ucunda görünür olduğunda, polimer pompalama başlatın, gerilim kaynağı açmak ve 24 kV DİKKAT gerilimini ayarlamak:. Sisteminin herhangi bir metal parçası dokunmayın üzerindeki gerilim açıldıktan sonra. Şarj ayrıca cilde elektrikli parçalardan kısa mesafelerde atlayabilir.
  10. D kadar çözüm çalıştırınesired iskele kalınlığı elde edilir. Tam bir gerilim kaynağı ve şırınga pompası kapattığınızda.
  11. Iskele ekli ile folyoyu çıkartın. Tamamlanan proteini içeren iskeleler -20 ° C dondurucu içinde saklanır.

3. Protein biyoaktivitenin test edilmesi

  1. Hücre kültürü ortamı hazırlayın. Ekleme,% 10 h / h Fetal Sığır Serumu Dulbecco Modified Eagle Medium,% 1 h / h, L-glutamin, ve% 1 hacim / hacim Penisilin-Streptomisin.
  2. Bir plaka tamamen içine sığacak seçiniz cam lamelleri.
  3. Üretici tarafından tarif edildiği gibi tedavi etmek için lamelleri 3-(trimetoksisilil) propil metakrilat kullanın. Methacrylation lamelleri iskele bağlılığı artırır.
  4. Electrospinning önce çıkarılabilir çift taraflı bant ile electrospinner toplanma alanına metakrile lamelleri takın. Lamelleri üzerine İplik işleme ve görüntüleme kolaylaştırır.
  5. Yukarıda tarif edildiği gibi arzu edilen kalınlığına Electrospin.
  6. Biryıkıldıktan sonra dikkatlice mandrelinden lamelleri çıkarın elektrospinning. Net azot odasına İSKELE kaplı lamelleri yerleştirin ve tüm oksijen temizlendi olduğundan emin olun.
  7. 15 dakika boyunca, 10 mW / cm 2, 365 nm ışık altında haznesi ve iskele yerleştirin. Uygun büyüklükte plaka içine bir yer çapraz bağlama sonrası. Iskele tarafı yukarı dönük olduğundan emin olun.
  8. 30 dakika boyunca bir antiseptik lamba altında Yer iskelelerinin sterilize etmek. İstenen fibronektin ya da diğer protein hücre yapışmasını geliştirmek için bir kaplama olarak kullanılırsa. Kat iskelelerinin için üreticinin talimatlarına uyun.
  9. Hasat Dorsal Kök Ganglia (DRG) gibi daha önce Hollenbeck 32 tarafından tarif. Bir DRG test edilen her iskele kaplı lamel için gerekli olacaktır.
  10. Oyuklu bir plaka içerisinde her bir platform üzerinde ortam 100-200 ul koyun. Dikkatlice ortam damlacık her bir platform üzerinde bir DRG yerleştirin. Kalın İskele için daha fazla medya gerekli olabilir; DRG tamamen batık ve FLOA değil gerekirting.
  11. Hücre iskeleti iskelesine yapışmasının sağlanması için 4 saat boyunca 37 ° C'de iskele ve DRG inkübe edin.
  12. Kuyunun için uygun seviyeye medyayı doldurun ve geri kuvöz içine yerleştirin. 4-6 gün inkübe devam edin.
  13. İnkübasyon süresinden sonra, dikkatli bir şekilde, her bir oyuktan ortamını çıkarın ve hafifçe bir kez PBS ile yıkayın. / Hac% 4 paraformaldehid ağırlık ile 30 dakika boyunca hücreleri saptamak.
  14. Nörofilament bir antikor leke kullanılarak Leke hücreleri. Bu ölçümü için nörit büyümesinin görselleştirme sağlayacaktır. DAPI ayrıca hücrelerin çekirdekleri görüntülemek için kullanılabilir. Bir örnek boyama protokolü Sundararaghavan ve arkadaşları 14 tarafından tarif edilmiştir.
  15. Bir floresan mikroskop kullanılarak hücrelerin görselleştirmek.
    1. Mikroskop sahnede plaka yerleştirin.
    2. DAPI'nin için filtre ve uyarma ayarları kullanarak hücre kitlesini bulun.
    3. Hücrenin kez genişletilmiş nevritlerle görselleştirmek için FITC'ye için filtreyi geçiş olduğunu. Utoplamak ve tüm yapıyı görmek için gerekli olduğunca çok fotoğraf birleştirmek mikroskop dikiş fonksiyonu şarkı. DAPI'nin, FITC'ye ve parlak bir alan için tekrarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

85 üzerinde% protein kapsülleme çapında mikroküreler ± 14 mikron 50 sürekli üretilen ve iskeleler içine electrospun edilmiştir. Ebat üç ayrı üretim serisi ikinci mikro-örnekleri görüntüleme ile saptanmıştır. Ticari laboratuar yazılımı kullanılarak ölçülür bir optik mikroskop ve uzunlukları üzerinde tutulmuş ve görüntüler. Şekil 1 boyut dağılımının bir histogramı gösterir. Encapsulation oranı da üretim sürecinde kaçan protein miktarının tarafından, üç ayrı Microsphere partilerden test edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Birçok çalışma, sinir hücreleri, topografik ipuçlarının (fiber hizalama) ve kimyasal uyaranlara (büyüme faktörleri) 1,2,10,11,35 yönettiği edilebileceğini göstermiştir. Elektro uyumlu lifleri oluşturmak için, basit bir yöntemdir. Büyüme faktörleri, sinir büyüme ancak sinir boruları (NC) içine dahil etmek için, uzun süreli salınımı için bir yöntem gereklidir ediyoruz. Her iki ipuçları ile daha sağlam bir sistem oluşturmak için, bu iki sinyal kombine edilmelidir. Çeşitli yöntemler, daha önce sinir rejenerasyonu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Richard Barber Vakfı ve Thomas Rumble Bursu (TJW) aracılığıyla finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DAPIInvitrogenD1306
Irgacure 2959BASF24650-42-8Işıktan koruyun
PEO 900 kDaSigma-Aldrich189456
Metakriloksetil tiyokarbamoil rodamin BPolysciences, Inc.23591-100DMSO
Şırınga PompasındaKD ScientificKDS100
Güç KaynağıGama Yüksek GerilimES30P-5W
MotorTriem Elektrik Motorları, Inc0132022-15Özel yapım bir mandrele takılmalıdır
TakometreAğ Aracı DeposuESI-330Mandrel hızını
izlemek için kullanınKolimasyon adaptörlü Omnicure UV Nokta Kürleme SistemiEXFOS1000
İğnelerFisher Scientific14-825-16H
LamellerFisher Scientific12-545-81
Polivinil AlkolSigma-AldrichP8136-250G
İzoporopol AlkolSigma-AldrichI9030-500mL
Sığır Serum Albümini (BSA)Fisher ScientificBP9703-100
BSA-FITCSigma-Aldrich080M7400
β-Sinir Büyüme Faktörü (NGF)R& D Systems1156-NG
65:35 Poli-Laktik-Glikolik-Asit (PLGA)Sigma-Aldrich1001554270
DiklorometanSigma-Aldrich34856-2L
Coomassie (Bradford) Protein TahliliTermo Bilimsel1856209
3- (Trimetoksisilil) propil metakrilatSigma-Aldrich1001558456
FibronektinSigma-AldrichF2006
DMEMLonza12-604F
FBSAtlanta BiyolojiS11150
PBSKlonSH30256.01
GlutaminFisher ScientificG7513
Pen-StrepSigma-AldrichP4333
ParaformaldehitAlfa AesarA11313 
stok çözeltisini hazırlayın

Kaynaklar

  1. Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
  2. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
  3. Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
  4. Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
  5. Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
  6. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
  7. Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
  8. Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
  9. Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
  10. Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
  11. Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
  12. Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
  13. Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
  14. Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
  15. Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
  16. Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
  17. Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
  18. Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W. Electrospinning technology in tissue regeneration. Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).
  19. Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
  20. Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
  21. Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
  22. Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
  23. Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
  24. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  25. Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
  26. Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
  27. Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
  28. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  29. Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
  30. Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
  31. Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
  32. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
  33. Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
  34. Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
  35. Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
  36. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
  37. Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
  38. Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
  39. Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
  40. Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
  41. Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikrok re retimiB y me Fakt r Sal n mLifli skeleSinir B y me Fakt rPLGA Mikrok relermm nofloresan MikroskopiDorsal K k GanglionlarProtein Enkaps lasyonuHizalanm Lifler
Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.