Yöntem makalesi

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

8.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51518

⸱

18 Ağustos 2014

 , 
1NYU Neuroscience Institute, New York University School of Medicine, 2Brain and Mind Research Institute, Weill Cornell Medical College

Bu makalede

Özet

Bu prosedür, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare ön beynindeki internöronların nasıl hedefleneceğini gösterir. Bu teknik, korteksin yüzeysel katmanlarına yönelik internöron alt tiplerinde seçici gen ekspresyonu elde etmek için özellikle etkiliydi.

Özet

Merkezi sinir sistemi (CNS) olgunlaşma çalışma sinirsel genetik hedefleme dayanır. Bununla birlikte, özel nöron alt tiplerine ilgi genlerinin ekspresyonunu kısıtlama görev nedeniyle spesifik promoter elementlerinin nispeten kıt olması oldukça zor olduğu kanıtlanmıştır. GABA'erjik internöron geniş genetik ve morfolojik çeşitliliği olan bir nöronal nüfus oluşturmaktadır. Gerçekten de, GABAerjik internöron fazla 11 farklı alt tipi fare korteksi 1 ile karakterize edilmiştir. Burada GABAerjik nüfus seçici hedefleme için uyarlanmış bir protokol mevcut. Bu homeobox transkripsiyon enhanser elemanını kullanarak, GABAerjik internöron alt tip seçici olarak hedeflenmesini elde utero elektroporasyon spesifik genlerin ekspresyonunu ile sürücü ve Dlx5 Dlx6, Drosophila uzak-az (DLL) geni 2,3 homologlarını, faktörüdür.

Giriş

Kortikal GABAerjik internöronlar toplu medial ve kaudal ganglion eminences (sırasıyla MGE ve JMO) adında iki geçici embriyonik yapılarından kaynaklanan 4. Parvalbumin ve somatostatin ifade internöron internöron JMO'ya kaynaklanan ifade Kalretinin ise MGE (Cr), Vasointestinal peptid (VIP) ve Reelin (Re) köken. Bu interneuron alt tipler kendi doğum günlerinin ile ayırt edilebilir. MGE türetilmiş alt tipler embriyonik gün 9.5 (E9.5) ve e16.5 5,6 arasında doğarlar. Buna karşılık, JMO türetilmiş internöron üretim E15.5 6 seviyesinde zirve ile E18.5 yoluyla E12.5 doğar. Bu geç doğdu nüfusun genetik hedefleme, ancak, zor kalır.

Kemirgen distal-az (Dlx) genler sadece gelişmekte olan ventral önbeyin 3 olarak ifade edilmiştir. GABAerjik internöron ve striatum projeksiyon nöronları değil, kortikal piramidal hücreleri Dlx1 ifade, Erken gelişim evrelerinde 3 de 2,5, ve 6 genler. Gerçekten de, dlx genlerinin hepsi GABA'erjik atalarda MGE ve CGE subventricular (SVZ'una) olarak ifade edilmiştir. Bu genlerin sentezlenmesi postmitotik aşamalarında 7-9 de alt tiplerini belirlemek için kısıtlanır. Önceki deneysel kanıtlar Dlx5 / 6 arttırıcı bir eleman transgenik fare modellerinde 2 GABAerjik soy seçici hedefleme için izin verdiğini gösterdi. Bu, gelişmekte olan fare beyin epizomal ifade bağlamında bu zenginleştirici elemanların birinin kullanılmasını test edilmiştir. Bir minimal promotör ve Bluescript (BS) omurga plasmid olarak gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) (Şekil 1) ile birlikte Dlx5 / 6 güçlendirici elemanın alt klonlandı. Burada özellikle Cr, VIP hedef E15.5 rahimde elektroporasyon suretiyle plazmid tanıtıldı ve Yeniden 3,8,10 alt tip. Bizim teknik kolaylaştırır seyrek elektroporasyon, sağlarateşten hücrelerin morfolojik özellikleri yeniden. Buna ek olarak, kortikal nöronlarda GABAerjik gen ekspresyonu son derece yüksek seviyelerde fonksiyonel çalışmalarda da sağlar. Biz kaybı ve çeşitli yabani tip ve dominant negatif genler 11 ile fonksiyon testleri kazancını gerçekleştirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvanlar Tıp NYU Okulu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu yönetmelik ve yönergelere uygun olarak tedavi edildi.

Fare Suşlar
Taconic tarafından sağlanan İsviçre Webster dişi farelerine, bu deneylerde kullanıldı. Özellikle yüzeysel katman hedef nöronları için, embriyolar E15.5 kullanılmıştır.

Not: standart klonlama teknikleri kullanılarak elde edilen bu çalışma (Dlx5 / 6.eGFP plazmid 3 ug / ml) kullanılan plazmid. EGFP cDNA Dlx5 / 6-Pmin-Poli A plazmidi içine klonlandı. Bu plazmid istek (demarn02@nyumc.org) üzerine mevcuttur.

Mikroenjeksiyon Pipetler hazırlanması 1.

  1. 860 çektirmesi Isı 2. ayarlayın.
  2. Yerleştirin ve filamanın yakın cam kılcal sabitleyin. Pipet dış çapı (OD) kabaca 30 mikron olup olmadığını kontrol edin.
  3. "Çekme" düğmesine basın.
  4. Dikkatlice kılcal çıkarın. Taban kısmı, bir iğne. Üst kısmını atın.

2. Anestezi Prosedürü

  1. Izofluran içeren odayı hazırlayın. Not: İsofluranın nedeniyle hızlı hareket ve yan etki azlığı için tercih edilen anestezi olduğunu. Pentobarbital başka bir seçenektir; Bununla birlikte, bu ilaç tolerans değişkendir ve izofluran daha yüksek bir ölüm oranına neden olabilir.
  2. 0.5-1 L / dk O 2% 4-5 kadar izofluran akışını ayarlayın.
  3. Kafa adaptörü için vana kapalı iken odası için vanasının açık olduğundan emin olun.
  4. Odacık içinde hamile fare yerleştirin.
  5. Fare anestezi etkisi altında gitmek için izin verin. Bu yaklaşık 2-3 dakika sürer. Solunum hızını kontrol edin. Fare ım başlarsa, izofluran dozunu.
  6. Fare anestezi sonra derhal, bölmeden çıkarın. Isıtma yastığı ventral tarafta yerleştirin ve iameliyat boyunca izofluran tedarik etmeye devam edecek maskesi kafasını nsert. Kafa adaptörü bağlantı parçasını boru odacıktan izofluran akışını değiştirmek için emin olun. Her gözün göz yağlayıcı bir damla koyun ve gözlerinizi kapatın.
  7. Hipotermi en aza indirmek için 36 ° C dereceye ısıtma yastığı ayarlayın.
  8. Arka pençeleri ve kuyruk kısma ayak ve kuyruk reflekslerin yokluğu kontrol edin.

3. Cerrahi

  1. % 70 etanol ile karın kapsayan cildi temizlemek.
  2. Yukarı cilt çekmek için forseps kullanabilir. Her ameliyat sonrası, deterjan ve su ile tüm enstrümanları yıkayın ve 72 ° CO / N sterilize.
  3. Meme bezlerinin üçüncü ve dördüncü çiftleri arasındaki yarıda başlayan orta hat boyunca küçük bir düşey kesi (yaklaşık 2 cm) olun. Ince cerrahi makas kullanın. Karın duvarına zarar değil dikkat edin.
  4. Yavaşça periton cilt ayırmak.
  5. Arterleri görselleştirmekve karın duvarı üzerinde damarlar. Karın boşluğuna maruz (damarları kaçınarak) karın zarı aracılığıyla başka bir 2 cm kesi yapın.
  6. Arterleri sıkma kaçınarak her tarafta deri ve karın duvarı Kelepçe. Not: arterler yanlışlıkla delinirse, servikal çıkık veya izofluran doz aşımı yaparak hayvanı hemen kurban.
  7. 37 ° C'ye kadar ısınmaya öncesi steril PBS. Kim mendil nemli PBS ile kelepçeleri örtün.
  8. PBS ile maruz karın boşluğuna nemlendirir. Ameliyat yaparken bu adımı birkaç kez tekrarlayın.
  9. Yuvarlak forseps kullanarak, yavaşça uzak boşluğundan embriyonik zinciri (E15.5) çekin. Islak mendillerin üzerindeki zincir ömür. Birinci rahim yarısını ortaya başlayın. Içinde embriyolar elektroporasyona sonra,, içine geri getirmek ardından ikinci yarıda çalışır.

4. Elektroporasyon

  1. Embriyolar işlemek için yuvarlak forseps kullanmaya devam edin.
  2. Viyanal ventriküller sualize. Orta hat (Şekil 1b) boyunca çalıştırın lateral ventriküller.
  3. Hızlı Yeşil (Stok:% 10 ağ / hac) eklemek için, bir 01:20 karışım için DNA solüsyonuna enjeksiyon sırasında görselleştirmek için. Damıtılmış su içinde standart bir maksi-hazırlık saflaştırma protokolü elde edilen pelet eritilerek DNA solüsyonu hazırlayın.
  4. Hızlı Yeşil DNA çözeltisi (Dlx5 / 6-eGFP, 3 ug / ml) 1 ml enjekte etmek için bir piston ile önceden çekilmiş mikropipetler kullanın. Pipet yüklemeden önce bir iğne ucunun sonuna omuz başlangıcından 6 mm uzunluk bırakmak için iyi bir forsepsle # 5 (Dumont) ile mikropipet ucu kesilir. Yuvarlak cımbız ile embriyo baş tutun. Orta hat yakınında bulunan lateral ventrikül amaçlayan bir 45 ° açıyla pipet ile beyin girin. İğne ventrikül ile nüfuz Eğer DNA enjekte pistonu kullanabilirsiniz gibi, yavaş yavaş pipet çekin. Ventrikül yeşile ne zamançözüm doldurmak başlar. Bu noktada, pipet hareket durdurmak ve DNA 1 ml enjekte edilir. Yavaşça, pipet çekilme.
  5. 950 msn ile aralıklı 50 milisaniye beş 45V bakliyat CUY21 elektrogözenekleme ayarlayın.
  6. E15.5 embriyolar 5 mm raket elektrotları kullanın. Etkili akım iletimi sağlamak için PBS içinde elektrotlar batırın.
  7. DNA çözümü içeren ventrikül olumlu kürek ile embriyonun başının etrafında elektrot kürekler. Biraz ganglionik tubera ile ventral akım yaratmak için negatif bir saygı ile pozitif raket indirin. Bu manipülasyon piramidal hücrelerinde ektopik ifadesini minimize edecektir.
  8. Elektrotlar yerleştirerek sonra, bir kez ayak pedalına basarak bir darbe teslim.
  9. Elektrotları çıkarın ve temiz silin. Tekrar her bir embriyo ile 4,6-4,9 adımları.
  10. Tüm embriyolar electroporating sonra, karın boşluğuna PBS 3 ml dökün ve karın boşluğunda onları geri.
  11. Üretim dikiş iğnesi ve kavisli bir 5-0 ipek dikiş ipliği daha sonra deri ile karın duvarı. Yaranın üzerine Lidokain (% 4) uygulayın. Analjezi için Aspirin içi periton 120 mg / kg yönetmek.
    Not: Bütün işlem 20 dakika veya daha kısa yapılmalıdır. Bu yeni başlayanlar sadece kısa çalışma süresini tutmak için bir kaç embriyolar electroporate önerilir. Uzun süreli ameliyatlar embriyoların hayatta kalma oranını azaltacaktır.
  12. Anestezi borudan hayvan çıkarın ve bir kağıt üzerinde ısıtma yastığı kurtarma silin sağlar.
  13. , Kafes hayvan dönün 37 ° C'de ısıtma yastığı üzerinde tutmak ve sağlık durumunu izlemek. Hayvanlar genellikle ameliyat iyi tolere ve anestezi tüp çıkarılır kısa bir süre sonra yavaş yavaş hareket etmeye başlar. Aşırı kanama ya da uyuşukluk görülürse, IACUC gibi servikal dislokasyon veya anestezi doz aşımı gibi ötenazi prosedürleri onaylanmış gerçekleştirerek hemen hayvan kurban.
  14. Viva kafesi dönrium. Dişiler daha doğum doğal verecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Biz olgunlaşan nöronların hücre tipi özel hedefleme ulaşmak için utero elektroporasyon tekniği adapte. CGE türevi internöronlarda eGFP ekspresyonunu tahrik etmek için, Dlx5 / 6 güçlendirici eleman ikinci ve E15.5 için enjeksiyon sınırlı aşama CGE türetilmiş internöronlar çoğunluğu oluştuğunda. Biz de P8 analizi gerçekleştirilir ve P15 11 (Şekiller 1 ve 2). Biz E15.5 eşit molar konsantrasyonlarda CAG-mCherry ve Dlx5 / 6-EGFP plazmidler elekt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tekniğin Sınırlamalar

Bu teknik, hücre süreçlerinin hücre özerk analizi için sağlar, bu popülasyon analizi için uygun değildir. Electroporations beyin başına elektropore az bin hücreleri ile çok seyrek. Bunun bir sonucu olarak, bu teknik CGE türetilmiş internöron genetik manipülasyon kaynaklanan davranış sonuçlarını değerlendirmek için kullanılamaz.

Elektroporasyon E13.5-E14.5 hedef MGE türetilmiş alt tiplerinde üzerinden taşınan, verimliliği düşük 10'du...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz teknik yardım için Lihong Yin minnettarız. NVD bir NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü bir alıcı ve aynı zamanda NIH (5 K99 MH095825-02) hibe tarafından desteklenmektedir. Fishell laboratuarında Araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ruh Sağlığı (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09) Ulusal Enstitüsü, Nörolojik Bozukluklar ve İnme (5 R01 NS081297-02 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen 1 P01 NS074972 -01A1) ve Simons Vakfı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Pedallı elektroporatörProtech InternationalCUY21
5 mm kürek elektrotları Protech InternationalCUY650P5
Isıtma yastığı Kent ScientificDCT-15
Sutter Aletleri P30 Çektirme Sutter Instruments3282322
Fluovac Anestezi SistemleriHarvard Aparatı726425
Hassas Ameliyat Makası 4.75" Düz Keskin/KeskinRobozRS-6702
5-0 İpek Siyah Örgü 18" C-1 Kutu 36 RobozSUT-1073-21
Forseps Uygulayan Mikro Klips 5.5"RobozRS-5410
2 Kelepçe makasıRobozRC-4894
Tutma forsepsi Güzel Bilim Araçları11031-15
Cam kılcal boru FHC27-30-0Borozil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID
Hızlı YeşilSigma-AldrichF7258 
Steril PBSYaşam Teknolojileri20012-027

Kaynaklar

  1. Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
  2. Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
  3. Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
  4. Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
  5. Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
  6. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
  7. Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
  8. Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
  9. Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
  10. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
  11. De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
  12. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Utero ElektroporasyonGABAerjik ntern ronlarDlx5 Dlx6 EnhanseriAlt Tip Se ici HedeflemeDNA EnjeksiyonuElektroporasyon ProtokolEmbriyonik Zincirlerin kar lmasGFP Ekspresyon G rselle tirmesiH cre Otonom Analiz

İlgili makaleler