Burada, ayrışmış tek hücrelerin koloni dışı tip tek tabakalı (NCM) büyümesine dayanan insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür protokollerini sunuyoruz. Rho ile ilişkili kinaz inhibitörleri veya laminin izoform 521 (LN-521) kullanan bu yeni yöntem, büyük miktarlarda homojen hPSC'lerin üretilmesi, genetik manipülasyon ve ilaç keşfi için uygundur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), rejeneratif tıp ve biyofarmasötik uygulamalar için büyük umut vaat ediyor. Şu anda, optimal kültür ve büyük miktarlarda klinik dereceli hPSC'lerin verimli bir şekilde genişletilmesi, hPSC tabanlı tedavilerde kritik konulardır. Geleneksel olarak, hPSC'ler hem besleyici hem de besleyici içermeyen kültür sistemlerinde koloniler halinde çoğaltılır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin, düşük hücre verimleri ve heterojen olarak farklılaşmış hücrelerin üretilmesi dahil olmak üzere birkaç önemli sınırlaması vardır. Mevcut hPSC kültür yöntemlerini iyileştirmek için, yakın zamanda, ayrışmış tek hücrelerin koloni tipi olmayan tek tabakalı (NCM) kültürüne dayanan yeni bir yöntem geliştirdik. Burada, Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632'ye dayalı ayrıntılı NCM protokolleri sunuyoruz. Ayrıca Y-39983 (ROCK I inhibitörü), fenilbenzodioksan (ROCK II inhibitörü) ve tiazovivin (yeni bir ROCK inhibitörü) gibi farklı küçük moleküllerle NCM kültürü hakkında yeni bilgiler sağlıyoruz. ROCK inhibitörleri kullanmadan laminin izoform 521 (LN-521) gibi tanımlanmış hücre dışı proteinler üzerinde hPSC'leri yetiştirmek için temel protokolümüzü daha da genişletiyoruz. Ayrıca, NCM'ye dayanarak, plazmid DNA'larının, lentiviral partiküllerin ve oligonükleotid bazlı mikroRNA'ların, bu hücreleri moleküler analizler ve ilaç keşfi için genetik olarak modifiye etmek amacıyla hPSC'lere verimli bir şekilde transfeksiyonunu veya transdüksiyonunu gösterdik. NCM tabanlı yöntemler, koloni tipi kültürün ana eksikliklerinin üstesinden gelir ve bu nedenle gelecekteki klinik tedaviler, kök hücre araştırmaları ve ilaç keşfi için büyük miktarlarda homojen hPSC'ler üretmek için uygun olabilir.
Giriş
Multilinaj yetişkin dokulara doğru ayırt etmek hPSCs kapasitesi kardiyovasküler, hepatik, pankreatik ve nörolojik sistemleri 1-4 içeren ciddi hastalıklardan muzdarip hastaların tedavisinde yeni yollar açtı. HPSCs türetilen çeşitli hücre tipleri de hastalık modelleme, genetik mühendisliği, ilaç tarama ve toksikolojik test 1,4 için sağlam hücresel platformlar sağlayacaktır. Onların gelecekteki klinik ve farmakolojik uygulamaları sağlayan temel konu, in vitro hücre kültürü yoluyla klinik dereceli hPSCs çok sayıda nesil. Ancak, mevcut kültür sistemleri koloniler 5,6 olarak hPSCs çeşitli besleyici ve besleyici ücretsiz kültürleri ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
HPSCs tek hücre tabanlı olmayan koloni tipi tek tabaka (NCM) kültürü.
1.. Hazırlıklar
- % 10 FBS, 2 mM L-glutamin, ve 0.1 mM temel olmayan amino asitler (NEAA) ile takviye edilmiş DMEM ortamı: fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) ve kültür ortamının 500 ml olun.
- Fare embriyonik fibroblastlar DMEM ortamı içinde% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu hücre kültürü plakasının üzerinde rutin bir protokol 16 ve Kültür MEF'ler sonra CF1 suşundan türetilmiş (MEF'ler) hücreleri izole edin. Alternatif olarak, ticari kaynaklardan pasaj 3'de MEF hisse senedi satın.
- Matrigel tabak hazırlayın.
- B....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
NCM kültürünün genel bir şema
Şekil 1, bu ROCK inhibitörü Y-27632 varlığında, yüksek yoğunluklu tek hücreli sonra kaplama hPSCs dinamik değişiklik gösteren tipik bir NCM kültür şemasını temsil etmektedir. Bu morfolojik değişiklikler, hücre kümeleri oluşumu kaplama ve hücre yoğunlaştırma ile ve ardından üssel hücre büyümesi (Şekil 1A) sonra hücreler arası bağlantıları vardır. Temsili deney 1. günde 10 uM Y-27632 mevcudiyetinde / cm 2
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Konvansiyonel (besleyiciler veya hücre dışı matrisler üzerinde hücrelerin) koloni tipi kültür ve besleyiciler 6 olmadan agrega olarak hPSCs süspansiyon kültürü: in vitro kültür hPSCs iki ana yolu vardır. Koloni tipi ve süspansiyon hem kültür yöntemleri sınırlamalar birikmiş heterojenliği ve kalıtsal epigenetik değişiklikleri içerir. NCM kültür, tek hücreli bir pasaj ve yüksek yoğunluklu bir kaplama her iki hücre göre, 6,18 hPSC büyüme için yeni bir kültür yöntemi temsil eder. Çeşitli tek h.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü'ndeki Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (NIH) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Bu proje hakkındaki tartışması ve yorumları için Dr. Ronald D. McKay'e teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kontes otomatik hücre sayacı | Invitrogen Inc. | C10227 | Otomatik hücre sayma |
| Faxitron Kabini X-ray Sistemi | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | MEF'lerin X-ışını ışınlaması |
| MULTIWELL 6 kuyulu plakalar | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polistiren plakalar |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965– 092 | MEF ortamı |
| Mitomisin C | Roche | 107409 | Mitotik inhibitör |
| Tripsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | MEF ayrışması için |
| DMEM / F12 | Invitrogen Inc. | 11330– 032 | hPSC ortamı için |
| Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı | Canlandırıcı A.Ş. | 31985-062 | hPSC transfeksiyonu için |
| Isı ile İnaktive Edilmiş FBS | Invitrogen Inc. | 16000 inç; 044 | MEF ortamı |
| Nakavt Serum Değiştirme | Invitrogen Inc. | 10828– 028 | KSR, hPSC ortamı |
| Dulbecco'nun bileşeni s Fosfat Tamponlu Salin | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup> |
| esansiyel olmayan amino asitler | Invitrogen | 11140 ve ndash; 050 | NEAA, hPSC ortamı |
| L-Glutamin | Invitrogen'in bileşeni | 25030– 081 | hPSC ortamı |
| mTeSR1 bileşeni & Takviyeler | Kök Hücre Teknolojileri | 5850 | Hayvansal protein içermeyen |
| TeSR2 & | Takviyeler Kök Hücre Teknolojileri | 5860 | Xeno içermeyen orta |
| β-merkaptoetanol | Sigma | M7522 | hPSC orta |
MEF (CF-1) ATCC | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) bileşeni | SCRC-1040 | hPSC'lerin besleyici kültürü için |
| hESC nitelikli Matrigel | BD Bioscience | 354277 | hPSC'lerin besleyicisiz kültürü için |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | İnsan rekombinant proteini |
| FGF-2 (rekombinant FGF, bazik) | Ar-Ge D Systems, MN | 223-FB | hPSC ortamında |
| büyüme faktörü CryoStor CS10 | Kök Hücre Teknolojileri | 7930 | |
| Accutase | Yenilikçi Hücre Teknolojileri | AT-104 | 1X karışık enzimatik çözelti |
| JAK inhibitörü I | EMD4 Biosciences | 420099 | Janus kinaz |
| Y-27632 | EMD4 inhibitörü Biosciences | 688000 | ROCK inhibitörü |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitörü |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitörü |
| Fenilbenzodioksan | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitörü |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | Yeni bir ROCK inhibitörü |
| BD Falcon Hücre Süzgeci | BD Bioscience | 352340 | 40 & mikro; m hücre süzgeci |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 & derece; C | Thermo Scientific | C6516F-1 | "Bay Soğuk" Dondurma Kabı |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfeksiyon reaktifleri |
| DharmaFECT Duo Thermo | Scientific | T-2010-02 | Transfeksiyon reaktifi |
| Hedeflemeyen miRIDIAN miRNA Transfeksiyon Kontrolü | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | MikroRNA'ların dağıtımını izlemek için Dy547 ile etiketlenmiştir; |
| SMART-shRNA | Termo Bilimsel | Belirlenecek | Lentiviral vektör |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Her transfeksiyon kitine dahildir | Transfeksiyon kontrolü için ekspresyon plazmidi |
| Ekim-4 | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-5279 | Fare IgG2b, pluripotent işaretleyici |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-21702 | Fare IgM, farklılaşma belirteci |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-21704 | Fare IgG3, pluripotent işaretleyici |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-21705 | Fare IgM, pluripotent işaretleyici |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-21706 | Fare IgM, pluripotent belirteç |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-8020 | Fare IgG1, sitokeratin 8 |
| &alfa;-fetoproteine | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-8399 | AFP, fare IgG2a |
| HNF-3 ve beta; (SAYFA-19) | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-9187 | FOXA2, keçi poliklonal antikoru |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Fare IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Tavşan IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japonya | RCAB0004P-F | Poliklonal antikor |
| Sıçan anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibriler asidik protein |
| Albümin (klon HSA1 / 25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Fare IgG1 |
| Düz kas aktini (klon 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611 / IS611 | Fare IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Tavşan poliklonal antikoru |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, fare IgG2a |
| HNF4 ve alfa; (C11F12) | Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri | 3113 | Tavşan monoklonal antikoru |
| Paraformaldehit (çözelti) | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | PFA, fiksatif, D-PBS'de seyreltilmiş |
Kaynaklar
- Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
