Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

12.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/51519

⸱

24 Temmuz 2014

 ,  ,  , 
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

Burada, ayrışmış tek hücrelerin koloni dışı tip tek tabakalı (NCM) büyümesine dayanan insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür protokollerini sunuyoruz. Rho ile ilişkili kinaz inhibitörleri veya laminin izoform 521 (LN-521) kullanan bu yeni yöntem, büyük miktarlarda homojen hPSC'lerin üretilmesi, genetik manipülasyon ve ilaç keşfi için uygundur.

Özet

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), rejeneratif tıp ve biyofarmasötik uygulamalar için büyük umut vaat ediyor. Şu anda, optimal kültür ve büyük miktarlarda klinik dereceli hPSC'lerin verimli bir şekilde genişletilmesi, hPSC tabanlı tedavilerde kritik konulardır. Geleneksel olarak, hPSC'ler hem besleyici hem de besleyici içermeyen kültür sistemlerinde koloniler halinde çoğaltılır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin, düşük hücre verimleri ve heterojen olarak farklılaşmış hücrelerin üretilmesi dahil olmak üzere birkaç önemli sınırlaması vardır. Mevcut hPSC kültür yöntemlerini iyileştirmek için, yakın zamanda, ayrışmış tek hücrelerin koloni tipi olmayan tek tabakalı (NCM) kültürüne dayanan yeni bir yöntem geliştirdik. Burada, Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632'ye dayalı ayrıntılı NCM protokolleri sunuyoruz. Ayrıca Y-39983 (ROCK I inhibitörü), fenilbenzodioksan (ROCK II inhibitörü) ve tiazovivin (yeni bir ROCK inhibitörü) gibi farklı küçük moleküllerle NCM kültürü hakkında yeni bilgiler sağlıyoruz. ROCK inhibitörleri kullanmadan laminin izoform 521 (LN-521) gibi tanımlanmış hücre dışı proteinler üzerinde hPSC'leri yetiştirmek için temel protokolümüzü daha da genişletiyoruz. Ayrıca, NCM'ye dayanarak, plazmid DNA'larının, lentiviral partiküllerin ve oligonükleotid bazlı mikroRNA'ların, bu hücreleri moleküler analizler ve ilaç keşfi için genetik olarak modifiye etmek amacıyla hPSC'lere verimli bir şekilde transfeksiyonunu veya transdüksiyonunu gösterdik. NCM tabanlı yöntemler, koloni tipi kültürün ana eksikliklerinin üstesinden gelir ve bu nedenle gelecekteki klinik tedaviler, kök hücre araştırmaları ve ilaç keşfi için büyük miktarlarda homojen hPSC'ler üretmek için uygun olabilir.

Giriş

Multilinaj yetişkin dokulara doğru ayırt etmek hPSCs kapasitesi kardiyovasküler, hepatik, pankreatik ve nörolojik sistemleri 1-4 içeren ciddi hastalıklardan muzdarip hastaların tedavisinde yeni yollar açtı. HPSCs türetilen çeşitli hücre tipleri de hastalık modelleme, genetik mühendisliği, ilaç tarama ve toksikolojik test 1,4 için sağlam hücresel platformlar sağlayacaktır. Onların gelecekteki klinik ve farmakolojik uygulamaları sağlayan temel konu, in vitro hücre kültürü yoluyla klinik dereceli hPSCs çok sayıda nesil. Ancak, mevcut kültür sistemleri koloniler 5,6 olarak hPSCs çeşitli besleyici ve besleyici ücretsiz kültürleri içeren, yetersiz ya da doğal olarak değişken ya vardır.

HPSCs erken hisse memeli embriyoların iç hücre kütlesinin (ICM) birçok yapısal özelliği de koloni tipi büyüme. ICM üç germ-tabaka halinde ayırt eğilimliheterojen olması nedeniyle sinyal degradelerin varlığının bir çok hücreli bir ortamda. Bu nedenle, erken dönemde embriyo gelişimi içinde heterojenite edinimi farklılaşması için gerekli bir süreç olarak kabul edilir, ancak hPSC kültür istenmeyen bir özelliktir. HPSC kültür içinde heterojenite nedeniyle genellikle optimal büyüme koşulları aşırı apoptotik sinyallerin ve kendiliğinden farklılaşma tarafından indüklenir. Bu nedenle, koloni tipi kültür, heterojen hücreleri genellikle kolonilerin 7,8 periferinde gözlenmektedir. Aynı zamanda, insan embriyonik kök hücre (HESC) in hücreleri, BMP-4, 9 gibi sinyal moleküllerine sergi farklı yanıtlar kolonilerinin gösterilmiştir. Ayrıca, koloni kültürü yöntemleri nedeniyle kontrol edilemeyen büyüme oranları ve apoptotik sinyal 6,9 yolaklar düşük hücre verimi yanı sıra kriyokorunması çok düşük hücre kurtarma oranları üretmek. Son yıllarda çeşitli süspansiyon kültürleri, kültürleme hPSCs için Partikül geliştirilmiştirbesleyici-ve matris içermeyen koşullar 6,10-13 içinde hPSCs büyük miktarda genişletilmesi için as ı. Açıkçası, farklı kültür sistemleri kendi avantajları ve dezavantajları var. Genel olarak, hPSCs heterojen doğası genetik mühendisliği 6 hPSCs içine DNA ve RNA malzemeleri bırakmak için optimal olan koloni tipi ve toplanmış kültür yöntemleri en önemli dezavantajları, birini temsil eder.

Açıkçası, mevcut kültür yöntemleri bazı eksikliklerini aşmak yeni sistemler geliştirmek için bir zorunluluk ihtiyaç vardır. Tek hücre canlılığını artırmak (örneğin ROCK inhibitörü Y-27632 ve JAK inhibitörü 1 gibi) küçük molekül inhibitörleri keşifler ayrışmış-hPSC kültür 14,15 için yol açmıştı. Bu küçük moleküllerin kullanımı ile, son zamanlarda non-koloni Çeşidi ayrışmış-hPSCs 9 (NCM) büyüme göre bir kültür yöntemi geliştirdik. Bu yeni kültür yöntemi tek hücreli pasajlanmasını ve yüksek yoğunluklu hem birleştiriryöntemleri kaplama bize majör kromozom anomalili 9 olmaksızın tutarlı bir büyüme çevrimleri altında homojen hPSCs büyük miktarlarda üretmek için izin. Seçenek olarak ise, NCM kültür geniş uygulamalar için kültür yöntemi optimize etmek amacıyla, farklı küçük moleküller (örneğin laminins gibi) gibi tanımlanmıştır matrisler ile uyarlanabilir. Burada, biz NCM kültürüne dayalı birçok ayrıntılı protokoller sunmak ve genetik mühendisliği için detaylı prosedürler tasvir. NCM protokollerin yönlülüğünü göstermek için, biz de farklı ROCK inhibitörleri ile ve tek laminin izoformlu 521 (yani, LN-521) ile NCM kültürü test.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

HPSCs tek hücre tabanlı olmayan koloni tipi tek tabaka (NCM) kültürü.

1.. Hazırlıklar

  1. % 10 FBS, 2 mM L-glutamin, ve 0.1 mM temel olmayan amino asitler (NEAA) ile takviye edilmiş DMEM ortamı: fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) ve kültür ortamının 500 ml olun.
  2. Fare embriyonik fibroblastlar DMEM ortamı içinde% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu hücre kültürü plakasının üzerinde rutin bir protokol 16 ve Kültür MEF'ler sonra CF1 suşundan türetilmiş (MEF'ler) hücreleri izole edin. Alternatif olarak, ticari kaynaklardan pasaj 3'de MEF hisse senedi satın.
  3. Matrigel tabak hazırlayın.
    1. Bir -20 ° C dondurucu içinde% 50 küçük parçalar halinde 5 (~ 4 ° C'de soğutulmuş) DMEM/F12 ortamı ml ve mağaza ile HESC nitelikli Matrigel stoklar 5 ml seyreltin. Bir buzdolabı (~ 4 ° C) O / N donmuş Matrigel stok çözülme ve daha fazla (% 2.5 'çalışma konsantrasyonuna neden vermek üzere), soğuk DMEM/F12 ortamı içindeki Matrigel seyreltin.
    2. oyuk başına 1.5 ml 2.5% 'si Matrigel ile kaplayın 6 oyuklu hücre kültürü plakaları, soğutma O / N kaplanmış plakalar saklamak (Not: 2 hafta içinde Matrigel kaplı plaka kullanın).
    3. Plaka 10 ile 30 dakika boyunca hücre kültürü kaputu (Not: Bir hücre kültürü inkübatör plaka sıcak değil) içinde oda sıcaklığında ısıtın, buzdolabından Matrigel plakasını çıkarın ve aspirat DMEM orta önce hPSCs kaplama için.
  4. 500 ml HESC orta edin:% 80 DMEM/F12 ortamı,% 20 KSR, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM temel olmayan amino asitler, 0.1 mM β-merkaptoetanol ve 4 FGF-2 ng / ml.
  5. ,% 60 FBS,% 20 DMSO ve mTeSR1 ortamı içinde 20 uM Y-27632, filtrasyon ile sterilize ve 1 hafta içinde ortamını kullanmak: 2X hPSC dondurma ortamı 10 ml hazırlayın.

. 2. Protokol 1 (Temel): yemlikler üzerine hPSC Kolonileri büyütün

  1. Tutarlı resul almak için hPSC kültür için 5 veya 6 (P5 ve P6 olarak adlandırılan) at MEF pasaj numaraları kullanınts. Mitotik 37 ° C'de 3 saat boyunca 10 ug / ml mitomisin C ile hücrelerin işlemden geçirilmesi ile MEFS inaktive, yıkama hücreler, 1X Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) ile 3 kez ve daha sonra 0.53 mM% 0.05 tripsin ile MEFS ayırmak EDTA. Alternatif olarak, bir X-ışını ışınlama ile 8000 rad bir dozda MEFS ışın.
  2. Mikroskop altında Trypan Blue leke çıkarma yöntemi kullanılarak hücre sayısı sayılır. Alternatif olarak, otomatik bir hücre sayacı kullanmak.
  3. 6-yuvalı polistiren plakaları üzerine Plate ışınlanmış MEF'ler oyuk başına 1.88 x 10 5 hücre (örneğin, 1.96 x 10 4 hücre / cm2) bir yoğunlukta% 0.1 jelatin ile kaplanmıştır. 37 ° C'de inkübe edin ve hücreleri,% 5 CO2 24 saat karıştırıldı.
  4. Pasteur pipeti (: bu zamanda gerekli hiçbir yıkama adımları Not) aspirasyon ile MEF kültür ortamı çıkarın.
  5. Küçük öbekler halinde önceki kültürden öğütün hPSC koloniler, fr değişen boyutlarını sağlamak için mikroskop altında incelemek topaklarom 50 çaplarda um ila 100, ve de hPSC ortamının 2 ml birinde MEF besleyici tabakalarının üstüne hPSC kümeleri plaka.
  6. Herhangi bir morfolojik değişmiş veya farklılaşmış kolonileri (~% 5) işaretlemek, fotoğraf tarafından 3 ila 5 gün, kayıt koloni büyüme için HESC orta günlük değişim, ve elle bir Pasteur pipeti ile hafifçe aspirasyon ile işaretlenmiş koloniler çıkarın.
  7. Iki MEF'ler kalan koloniler (2 dakika D-PBS ile her biri) yıkayın ve 2 ml 1 mg / 10-30 dakika boyunca hPSC ortamı içinde ml kollajenaz IV) ile inkübe koloniler ve ikinci hPSC kolonilerin kopmasını incelemek MEF-kaplanmış yüzey (Not: koloniler sıkıca plakasına bağlı olan yalnızca dekolmanı sürecine yardımcı olmak için bir kazıyıcı kullanın).
  8. , Bir 15 ml tüp enzimatik reaksiyonlar, transfer koloniler en aza indirmek hPSC koloniler oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca tortu olanak sağlar ve c doğrudan görselleme yoluyla kolonilerin tortulaşmayı sağlamak için her bir oyuğa hPSC orta 5 mltüpün altındaki arşın (Not: Bu aşamada tüp santrifüj değil).
  9. Kalıntı MEFS içeren süpernatantlar çıkarın ve tek hücreler ayrışmış, HESC 5 ml ortam ile tekrar süspansiyon koloniler ve iki kez sedimantasyon adımı tekrarlayın.
  10. Hücre geçiş için bir 6-plaka üzerine (1 de dondurulmuş vialde konflüent) ya da levha dondurulması için orta (veya CryoSTORE CS10 donma orta) dondurma 1X hPSC küçük topaklar, mağaza içine orta, çiğnemek hPSC koloniler çıkarın.

3 Protokol 2:. NCM'ye için hPSC Kolonileri yemlikler dönüştürme

  1. , Bir kere daha D-PBS içinde hPSC pelet, 10 dakika boyunca çalkalayın 1X Accutase 1 ml ile inkübe granül ve tek hücreli ayrışmasını sağlamak için bir mikroskop altında enzimatik reaksiyonu inceleyin.
  2. Yavaşça Y-27632, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 200 x g'de santrifüj ile ve ardından 10 uM içeren mTeSR1 ortamın 5 ml hücreleri asılı enzimatik reaksiyonları sonlandırma(Hücre hasarına neden aşırı santrifüj kuvvetleri kullanmak istemiyorum, Not).
  3. Topağa mTeSR1 orta 5 ml, tek bir hücre olarak pelet tekrar süspansiyon ve filtre, bir 40 mikron hücre süzgecinden (herhangi bir artık hücre birikimlerin çıkması için) üzerinden hücreleri ayrışmış.
  4. Bir kuyu içine tohum 1.3-2 x 10 6 hPSCs% 2.5 HESC nitelikli Matrigel ile kaplanmış bir 6-yuvalı plakanın (1.4-2.1 x 10 5 hücre / cm 2), 2,5 ml kadar mTeSR1 orta ekleyin ve 10 uM içerir bir ortam içinde Y-27632 (ilk 24 saat, tek hücreli bir kaplama kolaylaştırmak için). 1 uM Y-39983 (I inhibitör ROCK), 1 uM phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitörü), 1 uM thiazovivin (yeni bir ROCK inhibitörü): Seçenek olarak ise, geliştirme, tek hücreli bir kaplama için 10 uM Y-27632 değiştirmek için aşağıdaki küçük moleküller kullanmaktadır ve 2 uM JAK önleyici 1.
  5. (24 saat içinde), bir sonraki gün ilaçsız mTeSR1 ortam ile orta yerine, ilave bir ila hücreleri ayırmakiyi ve tek hücreli kaplama etkinliğini belirlemek için, hücre sayısını (Not: yaklaşık olarak bu aşamada elde edilebilir, tek hücreli bir kaplama verimliliğinin 50-90%).
  6. Hücreler mTeSR1 ortam 3 ml ile bir kaç gün için tek hücreli bir şekillendirilmiş tek katman olarak çoğalmıştır izin verin. Günlük orta değiştirin.
  7. Ampirik hücre yoğunluğuna bağlı olarak adapte NCM pasaj yapmak için takvimi belirlemek. Hücre büyümesi 3 gün veya günde 4 izdiham, ya da hücre-hücre sınırlarının kaybolması sonra 4 saat zaman noktasında ulaşır Passage. Bir 1-3 bölme oranını (örneğin, 6 oyuklu plakanın yuvaları içinde plaka 3 hücrelerinin konfluent 1) hücre geçiş için kullanın Accutase 1 ml hücreleri ayırmak ve 5 kısım tarafından adapte NCM stabilize.
  8. Hücre dondurma
    1. Bir dondurulmuş şişe için, bir konfluent kuyu (~ 5-6 x10 6 hücre) kullanmaktadır: de, 10 dakika boyunca Accutase 1 ml bir konfluent hücreler çözülür.
    2. W sulandırmakith 5 yukarıda tarif edildiği gibi mTeSR1 orta ve santrifüj hücre ml.
    3. MTeSR1 ortamının 500 ul pelet yeniden süspanse edin ve daha sonra yavaş yavaş, bir kriyokoruma şişe içinde (20 uM Y-27632 ihtiva eden) 2X hPSC dondurma ortamı içinde 500 ul ekleyin. Seçenek olarak ise, 10 uM Y-27632 ya da 2 ya da uM JAK önleyici 1 varlığında, 2 uM JAK inhibitörü 1 veya 1X CryoStor CS10 ortam içeren 1X hPSC dondurma ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
    4. Bir buz soğutulmuş cryocontainer (isopranol ile alt-dolu) içine dondurulmuş şişeleri yerleştirin ve hemen -80 ° C dondurucu cryocontainer aktarın.
    5. Uzun süreli dondurulması için (bir sonraki günde) bir sıvı azot tankına -80 ° C dondurucu transfer hücreleri.
  9. Hücre çözdürme
    1. 6-plaka 1 kuyu kaplama için bir dondurulması flakon yararlanın.
    2. 2 dakika için aynı su banyosu içerisinde 10 dakika, erime hücreler için bir 37 ° C su banyosu içinde önceden sıcak mTeSR1 ortamı,damla damla 10 uM Y-27632 içeren önceden ısıtılmış mTeSR1 ortamın 5 ml hücreleri ekleyin ve yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj.
    3. Yavaşça 10 uM Y-27632 içeren mTeSR1 ortam 2 ml hücre topakları tekrar süspansiyon ve yavaş yavaş da iyi Matrigel ile önceden kaplanmış hücreleri transferi (Not: hava kabarcıkları üretmek kaçının).
    4. Günlük orta değiştirin ve hPSC büyüme günde 3 veya 4 de izdiham ulaşmasını bekliyoruz.

4 Protokol 3:. NCM Kültür Matrigel hPSC Kolonileri dönüştürün

  1. , Buzdolabı bir Matrigel kaplı plaka çıkarmak 10-30 dakika boyunca doku kültürü kaputu levhayı, plakanın her gelen orta kaldırmak ve de her bir önceden ısıtılmış mTeSR1 ortamının 2 ml ekleyin.
  2. Aktarım Yukarıdaki Matrigel plakasına besleyici kültür (temel protokol Adım 2.10) için hPSC kümeleri ezilerek karıştırıldı. Her bir 2.5 ml nihai hacme kadar mTeSR1 orta ekleyin.
  3. 3-4 gün için her gün ortam değiştirmekoloniler kadar s% 80-90'ını izdiham ulaşmak.
  4. Hücre geçirilmesi için: iki kez D-PBS ile durulayın kolonileri 15-20 dakika boyunca 37 ° C 'de 2 mg / ml dispase 1 ml ile hücrelerin tedavi ve topaklar halinde sediment ve geçiş hücreleri.
  5. NCM kültürü için: 3,1-3,9 Protokol 2'de anlatılan adımları tekrarlayın.

5 Protokolü 4:. Üzerine hPSCs NCM Kültür LN-521

  1. Kullanım bir gün önce, 4 ° C 'de rekombinant LN-521 çözeltisi çözülme ve bir son konsantrasyon için (Ca 2 + / Mg2 + ihtiva eden) 1X D-PBS ile çözülmüş laminin seyrelterek laminin kaplama çözeltisi (LCS) yapmak 10 ug / ml.
  2. (: Kuru-out kaplama işlemi sırasında önlemek not) 6 oyuklu bir plaka içerisinde birine LCS 1 ml ilave edilir.
  3. Buharlaşmasını önlemek ve buzdolabında (4 ° C) O / N (: 1 hafta içinde plaka kullanmak notu) olarak plaka saklamak için Parafilm ile kaplanmış plaka mühür.
  4. Yavaşça olmadan bir Pasteur pipeti ile LCS çıkarınkaplanmış yüzeyi uching ve iyi birine mTeSR1 orta 2 ml ekleyin.
  5. 25 dakika için bir 37 ° C su banyosunda (D-PBS dahil) tüm kültür çözümler ısıtın.
  6. HPSC koloniler NCM'ye dönüştürme
    1. Protokol 2 de tarif edildiği gibi Accutase ile tek bir hücre için hücre agregatları ayrıştırmaları.
    2. Bir tohum içine 1.3-2 x 10 6 hPSCs iyi LN-521 kaplı (1.4-2.1 x 10 / cm 2 5 hücreleri) ROCK inhibitörlerinin varlığı olmadan.
    3. 3-4 gün boyunca her gün ortam değiştirin.
    4. Bir 1-3 bölme oranını kullanarak bir sonraki hücre geçiş için günde 3 ya da 4 ° C'de Accutase 1 ml hücreleri ayırmak.

. 6 Protokol 5: Kültür NCM Plasmid DNA Transfeksiyonu için

  1. 4 Protocols 2'de tarif edildiği gibi kültüre NCM hPSC koloniler uyum.
  2. Levha 10 uM Y-2763 mevcudiyetinde mTeSR1 ortamı içinde 5 hücre / oyuk 10 x 7.5 'lik bir hücre yoğunluğunda 12 oyuklu bir plaka içerisinde hPSCs ayrışmış2.
  3. Hücreleri kaplama yapıldıktan sonra 4-8 saat arasında ilaç içermeyen mTeSR1 orta mTeSR1 orta yerine.
  4. Her bir transfeksiyon için, (örneğin, pmaxGFP) ekspresyon plazmidleri 2.5 ug seyreltilmiş ve 125 ul Opti-MEM her ayrı Eppendorf tüpleri içinde Lipofectamine 2000 5 ul serum Orta azalır.
  5. 5 dakika sonra, seyreltilmiş reaktifleri karıştırmak ve oda sıcaklığına (transfeksiyon kompleksler oluşturmak üzere) 20 dakika boyunca inkübe edin.
  6. 1 ml mTeSR1 ortam içinde içeren her hPSCs için 250 ul transfeksiyon kompleksi ilave edin ve 24 saat boyunca bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de hücreleri inkübe edin.
  7. Flöresanlı bir mikroskop ve gerçek transfeksiyon verimliliğinin hesaplanması için rasgele fotoğraf altında transfeksiyon verimi inceleyin.

. 7 Protokol 6: NCM Kültür microRNA Transfaksiyon için

  1. 6'da oyuk başına Accutase 1 ml ilave etmek suretiyle NCM koşullar altında 2 gün yarı-birleşik hPSCs ayrıştırmaları Oyuklu plaka.
  2. 5 dakika boyunca 200 x g enzimatik reaksiyonlar ve santrifüj seyreltilmesi mTeSR1 ortamı 10 ml ilave edilir.
  3. , MTeSR1 orta hücre pelletini 10 uM Y-27632 içeren mTeSR1 ortamı içinde bir 12-çukurlu plaka içinde gözenek başına 7.5 x 10 5 hücre yoğunluğunda hücreler tohum ve hücreler, 4 saat boyunca birleşmeye izin verin.
  4. Y27632-ücretsiz mTeSR1 orta orta yerine.
  5. Piyasada mevcut microRNA (örneğin, Dy547 ile etiketlenmiş olmayan bir hedefleme miRIDIAN miRNA Transfection Denetimi) kullanın. Sağlanan reaktifler kullanılarak 0-160 nM arasında değişen konsantrasyonlarda titre ve üreticinin talimatlarını izleyin.
  6. Transfeksiyondan 24 saat sonra bir mikroskop altında canlı hücre Dy547 flüoresan görüntüleme ile hPSC çizgilerle her bir konsantrasyonu için transfeksiyon verimi optimize.
  7. Görüntülenen tüm hücreleri üzerinde Dy547 pozitif hücrelerin yüzdesi göre transfeksiyon verimliliği hesaplayın.
. tle "> 8 Protokol 7: Lentiviral Vector İletim için NCM Kültür

  1. Tekrar Protokol'ün 6 7,1-7,4 adımları.
  2. Transdüksiyon için kullanılacak viral parçacıkların miktarda hesaplayın: aşağıdaki formül kullanılır: TU = TU birimlerinin dönüşüm toplam sayıları temsil eder, oysa (MOI CN x) / VT, MOI kuyunun (İB veya enfeksiyon arzu edilen çok sayıda eşittir TU / hücre), her bir oyuğa CN hücrelerin sayısını belirtir ve VT stok viral titreler (TU / ml) göstermektedir. Örneğin, SMART-shRNA vektörü için hazır viral titresi (bir ml için dönüştürme birimleri) 1 x 10 9 TU / ml eşit olduğu göz önüne alındığında, 7.5 x 10 5 transdüksiyon anda oyuk başına hücre ve 20 beklenen bir MOI: 15, kullanımı her bir kuyu için stok viral parçacıkların ul (not: Bu durum geçici Lentiviral indüksiyon için tavsiye edilir).
  3. 30 dakika boyunca polibren 10 mg / ml 'lik mTeSR1 ortamının önceden sıcak 300 ul.
  4. Stok viral parçacıkların 15 ul içine ekleyinönceden ısıtılmış mTeSR1 orta polybrene ihtiva eden ve çözelti yavaşça karıştırın.
  5. Viral parçacıkları içeren, önceden ısıtılmış ortam 300 ul hücre kültür ortamı değiştirin.
  6. 4 saat inkübe edildikten sonra, iletim etkinliğini belirlemek için turboGFP floresan (shRNA ekspresyonu için bir yapıcı) inceleyin.
  7. Hücreler turboGFP ifade başladığınızda iyi Transdükleme ek mTeSR1 orta 300 ul ekleyin.
  8. 12-16 saat inkübasyondan sonra, turbo-GFP ifade yeniden gözden.
  9. 72 saat içinde bu transdüksiyona hücrelerle istenen takip deneyler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

NCM kültürünün genel bir şema

Şekil 1, bu ROCK inhibitörü Y-27632 varlığında, yüksek yoğunluklu tek hücreli sonra kaplama hPSCs dinamik değişiklik gösteren tipik bir NCM kültür şemasını temsil etmektedir. Bu morfolojik değişiklikler, hücre kümeleri oluşumu kaplama ve hücre yoğunlaştırma ile ve ardından üssel hücre büyümesi (Şekil 1A) sonra hücreler arası bağlantıları vardır. Temsili deney 1. günde 10 uM Y-27632 mevcudiyetinde / cm 2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Konvansiyonel (besleyiciler veya hücre dışı matrisler üzerinde hücrelerin) koloni tipi kültür ve besleyiciler 6 olmadan agrega olarak hPSCs süspansiyon kültürü: in vitro kültür hPSCs iki ana yolu vardır. Koloni tipi ve süspansiyon hem kültür yöntemleri sınırlamalar birikmiş heterojenliği ve kalıtsal epigenetik değişiklikleri içerir. NCM kültür, tek hücreli bir pasaj ve yüksek yoğunluklu bir kaplama her iki hücre göre, 6,18 hPSC büyüme için yeni bir kültür yöntemi temsil eder. Çeşitli tek h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü'ndeki Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (NIH) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Bu proje hakkındaki tartışması ve yorumları için Dr. Ronald D. McKay'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kontes otomatik hücre sayacıInvitrogen Inc.C10227Otomatik hücre sayma
Faxitron Kabini X-ray SistemiFaxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL Model RX-650MEF'lerin X-ışını ışınlaması
MULTIWELL 6 kuyulu plakalarBecton Dickinson Labware353046Polistiren plakalar
DMEMInvitrogen Inc.11965– 092MEF ortamı
Mitomisin CRoche107409Mitotik inhibitör
TripsinInvitrogen Inc.25300-054MEF ayrışması için
DMEM / F12Invitrogen Inc.11330– 032hPSC ortamı için
Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı Canlandırıcı A.Ş.31985-062hPSC transfeksiyonu için
Isı ile İnaktive Edilmiş FBSInvitrogen Inc.16000 inç; 044MEF ortamı
Nakavt Serum DeğiştirmeInvitrogen Inc.10828– 028KSR, hPSC ortamı
Dulbecco'nun bileşeni s Fosfat Tamponlu SalinInvitrogen Inc.14190-144D-PBS, Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup>
esansiyel olmayan amino asitlerInvitrogen11140 ve ndash; 050NEAA, hPSC ortamı
L-GlutaminInvitrogen'in bileşeni 25030– 081hPSC ortamı
mTeSR1 bileşeni & TakviyelerKök Hücre Teknolojileri5850Hayvansal protein içermeyen
TeSR2 & Takviyeler Kök Hücre Teknolojileri5860Xeno içermeyen orta
β-merkaptoetanolSigma M7522hPSC orta

MEF (CF-1) ATCC		Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) bileşeni SCRC-1040hPSC'lerin besleyici kültürü için
hESC nitelikli MatrigelBD Bioscience354277hPSC'lerin besleyicisiz kültürü için
Laminin-521BioLaminaLN521-02İnsan rekombinant proteini
FGF-2 (rekombinant FGF, bazik)Ar-Ge D Systems, MN223-FBhPSC ortamında
büyüme faktörü CryoStor CS10Kök Hücre Teknolojileri7930
AccutaseYenilikçi Hücre TeknolojileriAT-1041X karışık enzimatik çözelti
JAK inhibitörü IEMD4 Biosciences420099Janus kinaz
Y-27632EMD4 inhibitörü Biosciences688000ROCK inhibitörü
Y-27632Stemgent04-0012ROCK inhibitörü
Y-39983Stemgent04-0029ROCK I inhibitörü
FenilbenzodioksanStemgent04-0030ROCK II inhibitörü
ThiazovivinStemgent04-0017Yeni bir ROCK inhibitörü
BD Falcon Hücre SüzgeciBD Bioscience35234040 & mikro; m hücre süzgeci
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 & derece; CThermo Scientific C6516F-1"Bay Soğuk" Dondurma Kabı
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027Transfeksiyon reaktifleri
DharmaFECT Duo ThermoScientificT-2010-02Transfeksiyon reaktifi
Hedeflemeyen miRIDIAN miRNA Transfeksiyon KontrolüThermo ScientificIP-004500-01-05MikroRNA'ların dağıtımını izlemek için Dy547 ile etiketlenmiştir;
SMART-shRNATermo Bilimsel BelirlenecekLentiviral vektör
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)Her transfeksiyon kitine dahildirTransfeksiyon kontrolü için ekspresyon plazmidi
Ekim-4Santa Cruz Biyoteknolojisc-5279Fare IgG2b, pluripotent işaretleyici
SSEA-1Santa Cruz Biyoteknolojisc-21702Fare IgM, farklılaşma belirteci
SSEA-4Santa Cruz Biyoteknolojisc-21704Fare IgG3, pluripotent işaretleyici
Tra-1-60Santa Cruz Biyoteknolojisc-21705 Fare IgM, pluripotent işaretleyici
Tra-1-81Santa Cruz Biyoteknolojisc-21706Fare IgM, pluripotent belirteç
CK8 (C51)Santa Cruz Biyoteknolojisc-8020Fare IgG1, sitokeratin 8
&alfa;-fetoproteineSanta Cruz Biyoteknolojisc-8399AFP, fare IgG2a
HNF-3 ve beta; (SAYFA-19)Santa Cruz Biyoteknolojisc-9187FOXA2, keçi poliklonal antikoru
Troponin T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0Fare IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1Tavşan IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc, JaponyaRCAB0004P-FPoliklonal antikor 
Sıçan anti-GFAPZymed13-0300Glial fibriler asidik protein
Albümin (klon HSA1 / 25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513AFare IgG1
Düz kas aktini (klon 1A4)DakoCytomation IncIR611 / IS611Fare IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326Tavşan poliklonal antikoru
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, fare IgG2a
HNF4 ve alfa; (C11F12)Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri3113Tavşan monoklonal antikoru
Paraformaldehit (çözelti)Elektron Mikroskobu Bilimleri15710PFA, fiksatif, D-PBS'de seyreltilmiş
için Bileşeni karşı

Kaynaklar

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167(2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İnsan Pluripotent Kök HücreleriMonotaba KültürüROCK İnhibitörü Y-27632Laminin 521 KültürüGenetik ModifikasyonHücre TransfeksiyonuKök Hücre EkspansiyonuTanımlanmış Protein KültürüKüçük Molekül İnhibitörleriKolonisiz Kültür
İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.