Yöntem makalesi

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez

DOI:

10.3791/51526

⸱

12 Ocak 2015

 ,  ,  ,  , 
1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis embriyosu, büyük boyutu ve manipülasyon kolaylığı nedeniyle erken gelişim çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor. Bu model sistemde belirli organların tanımlanmasında kullanılabilecek tam montajlı in situ hibridizasyon protokolü için basitleştirilmiş bir protokol sağlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organogenez, organların nasıl belirlendiğinin ve daha sonra gelişim sırasında belirli şekil ve işlevlerini nasıl elde ettiklerinin incelenmesidir. Xenopuslaevis embriyosu, organogenezi incelemek için çok faydalıdır, çünkü büyük boyutları onları organogenezin en erken aşamalarında organları tanımlamak için çok uygun hale getirir. Şu anda, belirli bir organı veya primordium'u tanımlamak için kullanılan birincil yöntem, ilgilenilen organda eksprese edilen bir gene özgü etiketli antisens RNA probları ile tam montajlı in situ hibridizasyondur. Ek olarak, Xenopus'ta genleri veya sinyal yollarını manipüle etmek nispeten kolaydır ve in situ hibridizasyon, bir hedef organın varlığındaki veya morfolojisindeki değişiklikler için test yapılmasına izin verir. Tam montajlı yerinde hibridizasyon, birçok adımın dahil olduğu çok günlük bir protokoldür. Burada, rutin tahliller için iyi çalışan, daha az sayıda adım ve kullanılan reaktiflerle basitleştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Yerinde hibridizasyon robotları süreci büyük ölçüde kolaylaştırdı ve bu teknolojiyi süreçte nasıl ve ne zaman kullandığımızı detaylandırıyoruz. Yerinde hibridizasyon tamamlandıktan sonra, sonucun en iyi görüntüsünü yakalamak sinir bozucu olabilir. Yerinde hibridizasyon sonuçlarının görüntülenmesinin nasıl optimize edileceği konusunda tavsiyelerde bulunuyoruz. Protokol, Xenopus laevis'teki organogenezin değerlendirilmesini tanımlasa da, aynı temel protokol neredeyse kesinlikle Xenopus tropicalis ve diğer model sistemlere uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli bir genin ekspresyon paterni, o genin belirli bir organ veya hücre tipinin gelişimindeki potansiyel rolünü belirlemede önemli bir bilgi parçasıdır. Basitçe söylemek gerekirse, doğru zamanda ve yerde ifade edilmezse, kilit bir rol oynaması olası değildir. Xenopus'ta, çoğu erken embriyoda olduğu gibi, bir genin ekspresyonunu tespit etmek için en yaygın olarak kullanılan test, etiketli antisens RNA probları kullanılarak tam montajlı in situ hibridizasyondur. Araştırmacılar, Xenopus'taki bir genin ekspresyonunu değerlendirmek için antikor boyamanın kullanılması, araştırmacıların genellikle memeli proteinlerine karşı yükselen, Xenopus homologuna çapraz reaksiyona giren veya kendi 1-3'lerini üreten antikorları keşfetmesiyle daha yaygın hale gelmektedir. Bununla birlikte, Xenopus organogenezi ile ilgili çalışmaların büyük çoğunluğu hala antisens RNA problarını kullanmaktadır. Antikorlar kullanıldığında, her bir antikor genellikle birincil antikor konsantrasyonu veya fiksasyon protokolleri için optimizasyon gerektirir. Buna karşılık, in situ hibridizasyonlar için protokol, farklı problar için esasen değişmezdir. Temel konsept nispeten basittir ve mükemmel bir standart protokol iyi bir şekilde oluşturulmuştur 4. Protokolümüz, erken embriyoda gen ekspresyon modellerinin mükemmel bir şekilde tespit edilmesini sağlayan orijinal protokol 4'ün basitleştirilmiş bir versiyonudur. Embriyolar sabitlenir ve daha sonra, etiketli antisens RNA probunun hedef mRNA'sına yüksek sıkılıkta bağlanmasına izin verecek şekilde çözeltiler ve sıcaklıklar değiştirilerek hibridizasyon için hazırlanır. Bağlanmamış prob yıkanır ve embriyolar daha sonra RNA probları üzerindeki etikete karşı bir antikorun bağlanması için hazırlanır. Fazla antikor daha sonra yıkanır ve RNA probunun embriyoda bağlandığı yeri lokalize etmek için enzimatik bir renk reaksiyonu kullanılır. Şu anda belirli dokularda floresan proteinlerin ekspresyonunu sağlayan bir dizi Xenopus transgenik hattı var ve bunlar Woods Hole'daki Ulusal Xenopus Kaynağı gibi Xenopus stok merkezlerinde mevcut. Canlı embriyolarda organogenezin incelenmesini gerektiren birçok deney için çok yararlı olsa da, bu seçenek transgenik hatlar için ayrı bir yuva gerektirir.

In situ hibridizasyon, erken embriyoda belirli organların veya hücre tiplerinin nerede oluşacağını açıkça belirleyebilir (Şekil 1). Teknik, tek bir embriyoda az sayıda hücrede gen ekspresyonunun tespit edilebildiği göz önüne alındığında oldukça hassastır 5. Bununla birlikte, kolorimetrik boyamanın yoğunluğunu kullanan yerinde hibridizasyon, renk reaksiyonu doğrusal olmadığı için ölçülebilir olarak kabul edilmez. Lekelenme yoğunluğunu ölçmedeki zorluğa rağmen, ifadedeki değişiklikler genellikle oldukça belirgindir; özellikle in situ hibridizasyon, ekspresyon alanlarının boyutunda ölçülebilir artışlar veya azalmalar gösterdiğinde 6,7.

Tam montajlı in situ hibridizasyonun açık avantajları, onu erken gelişim çalışmasında kritik bir test haline getirir. Ancak, birkaç gün içinde birçok adım gerektiren zaman alıcı bir durumdur. Bu protokol, yerinde sonucun kalitesini düşürmeden birkaç adımı ortadan kaldıran standart protokolün basitleştirilmiş bir versiyonudur. Basitleştirme aynı zamanda değişkenlik kaynaklarını da ortadan kaldırarak, yerinde hibridizasyonun optimal olmadığı durumlarda sorun gidermeyi kolaylaştırır. Spesifik olarak, embriyonun proteinaz K ve RNAse tedavilerinin kullanımını, reaktif kalitesine bağlı olabilen ve aşırıya kaçıldığında sinyal yoğunluğunu da azaltabilen iki adım olan ortadan kaldırdık. Protokol ayrıca birkaç reaktifin kullanımını ortadan kaldırdığı için bir dereceye kadar maliyet tasarrufu sağlar. Son olarak, bu protokol aynı zamanda yerinde hibridizasyon sonuçlarının görüntülerinin daha iyi yakalanması için bazı basit yönergeler sağlar. Bu protokol Xenopus embriyolarında çalışmak için optimize edilmiş olsa da, basitleştirmelerin en azından bir kısmının diğer embriyo sistemlerindeki in situ hibridizasyon çalışmalarına uygulanabilir olması muhtemeldir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Embriyo Hazırlık

  1. Embriyo kültürü, pH 8.0 öncesinde tespit 8% 2.5 sistein kullanarak de-jöle embriyoların bir parçası olarak rutin yapılmadıysa. Kesinlikle gerekli olmasa da daha sonra elle ince forseps kullanarak önce tespite döllenme zarfı çıkarmak için, yararlıdır.
    1. Embriyo transferi için cam Pasteur pipetler kullanın. pipet embriyolar yani bir embriyo almak için yeterince geniş bir noktada cam pipet kesmek için bir elmas kalem kullanın aktarmak için yeterince geniş değil. Hızlı keskin kenarları eritmek için bir Bunsen beki alevi ile kesme ucu geçirerek kestikten sonra pipetler keskin kenarları ortadan kaldırmak.
      NOT: Bakım görsel muayene ile soğutulan görünüyor olsa cam hala yanıklara neden olabilecek kadar sıcak olabilir gibi, alınması gerekiyor.
  2. Aşamalarında embriyo tespiti gerçekleştirin. İlk olarak, embriyo tespit kullanılmak üzere cam gibi tüp hazırlanır. Finalde dahil olmak üzere tüm adımlar için bu şişeleri kullanınDepolama. Sürecin her aşamasında embriyoların izlenmesi için izin kapaklı iyi bir teflon conta ile açık şişeleri kullanın. Kalıcı bir kalem kullanarak uygun deneysel bilgilerle şişeleri Etiket ve hatta kalıcı işaretleyici nedeniyle alkol ve diğer çözücülerin kullanımı prosedürü boyunca kaybolur gibi, sonra şeffaf bir bantla etiketi kapsar.
    1. Embriyoların düzeltmek için Mempfa kullanın. Bir seferde 50-100 ml gruplar halinde% 8 paraformaldehit bir stok yapın. Çözelti içine paraformaldehid elde etmek için gerekli olan, 50-60 ° C, gerekli H2O ve ısı yaklaşık 75% kullanın.
      Not: Bu çözüm formaldehit yerine paraformaldehid kullanır ki Memfa eski yayınlanmış protokol sürümlerinde kullanılan biraz daha farklıdır.
    2. 10N NaOH 2-3 damla ekleyin veya pH kadar 7.5 (pH kontrol etmek kullanım pH kağıdı) yaklaşık. Paraformaldehyde çok zehirli, bu nedenle bir davlumbaz stok çözüm üretmek. Para kezformaldehid çözeltisi içinde yeni bir kap içine Whatman kağıt içinden çözelti filtre edilir ve nihai hacme O H2 eklenir. Gerekirse, 1-2 hafta boyunca 4 ° C 'de paraformaldehit çözeltisi saklayın.
    3. Mempfa sabitleme çözeltisi (Tablo 1) geri kalan bileşenlerin monte edin. Paraformaldehid nihai çalışma konsantrasyonu% 4 olduğundan emin olun. Stoklar olarak 4 ° C 'de sabitleme çözeltisi tüm bileşenleri saklayın.
    4. Bir kesim cam pipet kullanarak, Mempfa solüsyonu (Tablo 1) yaklaşık 3-4 ml ile dolu olan etiketli cam şişelere embriyolar ekleyerek embriyolar düzeltmek. Vialde fazla 20-30 embriyo tespit kaçının. Embriyo ortamından sıvı transferi minimum embriyolar ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat ya da gece boyunca 4 ° C'de Mempfa çözeltisi embriyolar düzeltildi.
    5. Geç endoderm yapılar için elle izole bağırsak ve endoderm türevleri 9,10 üzerinde situs gerçekleştirmekProbun iyi nüfuz etmesi için izin verir ve aynı zamanda kavite boyama kaçınan.
    6. -20 ° C'de% 100 metanol ihtiva eden bir çözelti saklayın. Paraformaldehit tespit edildikten sonra, yaklaşık 4 ml -20 ° C, embriyo depolanması için% 100 metanol ile Mempfa çözeltisi değiştirin.
    7. Cam veya diğer embriyolar yapışmasını embriyolar önlemek için metanol ilave edildikten sonra şişeleri çalkalanır. Ayrıca, gevşek ise metanol zamanla dondurucuda buharlaşması nedeniyle flakon sıkıca kapatılmış olduğundan emin olun.
      Not: Embriyolar in situ hibridizasyon kalite kaybı ile boyanmadan önce metanol içinde, muhtemelen daha az bir yıl için depolanmıştır ve üzerinde olabilir.

2. Probe Hazırlık

  1. Digoksigenin-işaretli problar için şablon DNA 1-2 ug kullanın. Bir sınırlama ile, ilgi konusu genin 5 'ucunda uygun bir DNA dizisini ihtiva eden kesik plazmid tha için uygun enzimT vektörü antisens sondaları oluşturulur.
    Not: Plazmid uygun bir RNA polimeraz bağlama bölgesi (örneğin, T7, T3, veya SP6) olması gerekir.
  2. DNA, su, NTP prob sentez reaksiyonu monte edilmeden önce oda sıcaklığına kadar ısınmaya karıştırmak ve polimeraz tamponu izin verir. Tablo 2'de listelenen sırada, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü RNA sentezi, reaksiyon bileşenlerini ekleyin. Su seviyesini ayarlama 20 ul prob sentez reaksiyonunun toplam hacmi getirmek ekledi. Polimeraz tampona bileşenleri yüksek konsantrasyonlarda ve soğuk hedef DNA zaman uyarabileceği reaksiyon oda sıcaklığında bir araya getirin.
  3. 37 ° C'de 2 saat boyunca transkripsiyon reaksiyonu inkübe edin.
    NOT: biraz daha uzun iki saatten İnkübasyonlar hiçbir yan etkilere yol açar, ama aynı zamanda çok az verim artışı göstermektedir. Bir saat süre ile kuluçkalanmıştır ise, verim yine de iyi bir prob için yeterli indirgenmiş fakat edilecektir.
    1. Bitirmek için transkripsiyon reaksiyonu için beklerken, prob kalitesini test etmek için kullanılacak bir agaroz jeli tercih. 1x TAE tamponda 100 ml agaroz 1 ug Erime kaynama noktası, çözeltinin ısıtılması (Tablo 1 e bakınız). Agaroz toz tamamen çözülene zaman ısı çözüm çıkarın.
    2. Agaroz ultraviyole (UV) ışık altında RNA görüntülenmesine olanak vermek üzere yaklaşık 60 ° C'ye soğuduğunda agaroz jeli, yaklaşık 100 ml 2 ul etidyum bromür stok solüsyonu (10 mg / ml) ilave et.
      Not: gelecek jeller tekrar eritmeden dökülebilir, böylece bu agaroz jel çözeltisi, 60 ° C'lik bir kuluçka makinesi içinde tutulabilir. Nedeniyle potansiyel toksisite etidyum bromür ele dikkatli olun.
  4. Şablon DNA ortadan kaldırmak için 37 ° C'de bir 10 dakika daha 2 saat inkübasyondan sonra, transkripsiyon reaksiyonu 1 ul DNaseI (RNAse serbest derece) ilave edilir ve inkübe edilir.
  5. Reaksiyon karışımı 1 ul çıkarınTE tamponu (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA), 5M NH4 Asetat 10 ul ve 220 ​​ul% 1 SDS ve 80 ul% 1 agaroz-TAE jel üzerinde ve geri kalan (20 ul), kontrol soğuk etanol. Vortex karışımı şiddetle ve RNA kalite kontrol sonuçları bilinmektedir kadar buz üzerinde bir kenara.
    1. % 1 agaroz-TAE jel üzerinde çökeltme işleminden önce çıkarılması RNA'nın 1 ul çalıştırın. Jel üzerinde yüklenmesini kolaylaştırmak için su, 4-5 | il ve RNA standart yükleme boyası 1 ul ekle. (Tartışma) prob kalitesini kontrol etmek için bir UV ışık transilluminator'de kullanılarak jel üzerinde RNA görüntüleyin.
  6. 10-15 dakika süre ile tam hızda bir mikrosantrfuj eğirme adım 2.5 buz üzerinde bir kenara geri kalan RNA çökeltilmesi. Bir çizilmiş cam pipet ile süpernatant kapalı çizin ve kısaca kurumasını bekleyin.
    1. Eppendorf tüpü içinde RNA melezleme, 1 ml tampon (Tablo 1) ile prob yeniden süspanse edin. Girdap ve briefly tekrar 37 ° C ve girdaba boruyu ısı. 15 ml kap polistiren tüp vida bir prob çözüm aktarın ve RNA hibridizasyon tamponu ile 7-10 ml doldurun. Not: Prob (10 kat daha fazla seyreltme hala iş görebilir) genellikle düşük bir arka plana neden ancak boyama reaksiyonlar da daha uzun sürer daha seyreltilebilir.

In situ Hibridizasyon 3.

  1. -20 ° C'de metanol içinde depolanmıştır embriyolar alın ve oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verildi. Cam şişeler içinde tüm prosedürü uygulayın. Bir grup farklı embriyolar farklı prob tarafından baktı olacak olursa, sondalar ilk gününde değişkenliği ve emek azaltmak için eklenir hemen önce kadar bir tek şişede saklayın.
    1. Prob ilave hazırlık Tablo 3 (yıkama tarifleri için bakınız Tablo 1) de tarif edilen bir metanol dizi embriyolar rehidrate. Yavaşça Embry girdapHer değişiklikten sonra os onlar tarafta veya birbirlerine yapışmasını değil emin, ve bir nutator şişeleri montaj embriyolar rock. Sıvıları aktarırken, embriyolar orada sıkışıp değil emin olmak için kapaklar içini kontrol edin.
    2. Tablo 3'te tarif edildiği gibi prob çözeltisi içinde bir kez, bir gece boyunca embriyolar hibridize olur.
  2. Prob çözüm çıkarın. 15 ml saklayarak kullanılan prob kaydet -20 ° C'de tarih ve prob kullanılmıştır kaç kez ile işaretlenmiş kap polistiren tüp, vida.
    NOT: kolorimetrik reaksiyonlar istenilen yoğunluğu ulaşmak için anormal uzun zaman almaya başlayana kadar aynı prob yerinde döllemeler sonraki birçok kez tekrar edilebilir.
    1. Prob çıkarıldıktan sonra, Tablo 4'te açıklanan yıkama dizi prob karşı antikor lekelemesi için embriyolar hazırlayın. Sıcaklık değiştirme t hareket ettirerek (Tablo 4) gerektiğindedoğrudan uygun sıcaklığa ayarlanır melezleme fırınlarına bağlı embriyoların şişeleri ile o nutator.
    2. MAB uygun hacimde Makyaj + HTSS + br + embriyolar antikor ilave edilmeden önce bloke olmasına neden olur + HTSS + br bloke etme çözeltisi MAB inkübe edilmektedir, o zaman, anti-Dig antikoru (Tablo 4) embriyolar. Kullanım gününde engelleme çözümleri taze olun.
  3. Antikor çözeltisini çıkarın ve antikor ile gece boyu inkübasyondan aşağıdaki Tablo 5'te belirtildiği gibi yıkama başlar. Alkalin fosfataz alt-tabaka ile boyama için hazırlama ve mümkün olduğu kadar arka planı azaltmak için en az on iki 30 dakika yıkama yapın. Yıkama adımları için, MAB tampon veya TBT çözeltisi (Tablo 1) kullanın.
    NOT: TBT çözümü 2 mg olan TTW olduğunu / BSA ml.
    1. BM Mor alkalen fosfataz substrat ile son yıkama solüsyonu değiştirin. Boyama REAC gerçekleştirinOda sıcaklığında veya 37 ° C ya da manda.
      Not: Boyama 37 ° C'de daha hızlıdır, ancak, gece boyunca bırakılırsa, kabul edilemez arka plan renklenmesi genellikle bir sonucu olabilir. boyama reaksiyonları genellikle gecede boyama gerektirir ve oda sıcaklığı bunun için güvenli olduğunu.
    2. Daha fazla boyama gereklidir ve BM mor çözüm mavi renk alıyorsa, taze BM Purple ile boyama çözüm yerine ve 37 ° C içine tüpleri koymak. Hedef mRNA'nın çok bol ise, bir gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta boyama çözeltisi embriyolar koymak ve daha sonra oda sıcaklığına embriyolar hareket ya da 37 ° C boyama reaksiyonu daha iyi kontrol edilmesi izin verir.
    3. Nihai sonuç için zaman farklı hedef RNA'lar arasında önemli farklılıklar gibi, dikkatle yeni reaksiyonları izleyin. Tutarlılık için, daha uzun inkübasyon ile ortaya çıkan ifade yeni siteler varken (3.4 bakınız) boyama reaksiyonu durdurmak. Önemli bir şekilde, in situ hibridizasyon, eğer bir test olarak kullanılmaktadırFarklı tedavi grupları şu an deneyleri için, deney ve kontrol embriyoları arasındaki renk reaksiyonları için aynı zamanda kullanılır.
  4. Boyama reaksiyonu durdurun ve Tablo 6'da belirtildiği gibi sıvıları değiştirerek depolama ve görüntü kaydı için embriyolar hazırlayın. Leke çıkarma embriyoların yaklaşık metanol mor renk olarak görünür, çünkü bu aşamada embriyolar kaya vermeyin.
    Not: Bu, ağır arka plan veya oyuk lekeleme çıkarmak için yeterli değildir, ancak sık sık embriyolar, boyama çözeltisi ve en azından kısmen bu kaldırmak soğuk metanolden açık mavi lekelenme mevcuttur. Soğuk metanol ile -20 ° C dondurucu içinde muhafaza edilir, metanol anlamına gelir.
    1. Embriyoların rehydrate ve Mempfa (Tablo 6) ile lekeyi düzeltmek. Sabit bir kez, Mempfa kaldırmak ve% 25 metanol ile embriyolar yıkayın.
    2. % 25 metanol çıkartın ve ağartma çözeltisi ilave endojen pigment gidermegereklidir. Yanıklara neden olabilir ağartma çözümü ele dikkatli olun. Nispeten hızlı olur ve beyazlatma derecesi farklı etkileri (Şekil 2) için değiştirilebilir yakından beyazlatma gözlemleyin.
    3. Ağartma sonrası uzun süreli depolama için% 100 metanol ile bir metanol dizi embriyolar kurutmak, ya da kısa süreli depolama ve daha sonra görüntüleme için PBS'ye transferi (bakınız Tablo 6).

4. Görüntüleme Embriyolar

  1. Bir embriyo boyama işlemi tamamlandıktan sonra, görüntü embriyo ilgi gen ifade nerede bilgi daha geniş bir kitleye yakalanan böylece. Temizlenmemiş embriyolar görüntülemek için bir arka plan olarak agaroz% 1 kullanın.
    NOT: Agaroz embriyo ve boyama reaksiyonu mavi renk ile de tezat bir mavi / gri arka plan verir. Aynı zamanda rahatsız edici gölgeler ve embriyo dikkatini başka yöne yansımaları yaygın yardımcı olur.
    1. Suya agaroz ekleyin ve agaroz çözeltisi içinde kalıncaya kadar kaynatın ve sonra petri içine dökülmeden önce 50 soğumaya bırakın. TAE jeli çözeltisi gibi, birden fazla kullanım için 55 ° C inkübatör agaroz çözeltisi saklayın. Petri kabına yaklaşık 2 mm'lik bir derinliğe kadar agaroz dökün. Gerekirse, arka plan biraz farklı gölge elde etmek agaroz derinliğini ayarlayın.
    2. Sulu bir çözeltisi (PBS veya ttw) metanol içinde depolama rehidrasyon sonra, bir metanol dizi kullanılarak, (bakınız Tablo 6) agaroz baz ile bir petri tabağına embriyolar yerleştirin. Temiz bir çözüm tutun ve gerekirse, iyi görüntülerin temiz arka plan bozabilir küçük partiküler madde ortadan kaldırmak için basit filtreleme kullanın.
    3. Görüntü gibi ventral taraftan gibi alternatif görünümler, gelen embriyolar, Şekil 3 ince forseps kullanarak embriyo sığacak ve (yönlendirme için bu kanallarda embriyolar yerleştirmek için agaroz ince kanallar kesmek ). Kolayca zarar olarak embriyolar manipüle özen gösterin.
      NOT: Çoğu aşamaları çözeltide yerleştirilen zaman varsayalım karakteristik bir konuma sahip. Örneğin, blastula aşamalı embriyolar hayvan yan yukarı oturup eğilimindedir. Embriyolar uzatmak için başladığınızda, onların yan yattı.
  2. Görüntüye derinlik sağlayan embriyo üzerinde gölgeler oluşturarak, sığ bir açıdan embriyo aydınlatmak ve yüzey yapılarını ayırt yardımcı olmak için fiber optik ışık kaynağı kullanın. Ağartma yararlı yerlerinden sağlayan pigment, ortadan Çünkü güçlü ağartılmış embriyolar için gölgeleme kullanın.
  3. Böyle beynin, (Şekil 4) Notokordun, akciğer, veya bölgelerde olduğu gibi, derin embriyonun içinde görüntü boyama embriyolar temizleyin. Bunu gerçekleştirmek için,% 100 metanol kadar metanol dizi embriyolar koydu.
    1. Metanol içinde tam daldırma sonra, çözelti, bir kısım benzil alkol embriyo transferi ve iki bölüm benzil olamaznzoate (BABB). embriyolar başlangıçta yüzeyde yüzer ancak metanol Babb ile karışır gibi, onlar Babb içine batar. Cam şişeler veya yemekler Babb ile ilgili her adımı gerçekleştirin; BABB herhangi bir plastik veya boya eriyecek.
    2. Bir kez, temizlenmiş embriyodan altına gelen iletilen ışık embriyolar görüntüleyin. Kontrastı artırmak ve en iyi renk sağlamak için aşağıdaki ışık yoğunluğunu yanı sıra açısını ayarlayın.
    3. Görüntüleme temizlenir embriyolar baz kapalı cam petri yükseltmek zaman. Sadece embriyolar ile çanak bölgesi yükselir, böylece onu yükseltmek için diğer iki petri kapakları kullanarak yapın.
      NOT: Bu odak dışında tabanını alarak ve görüntü ile müdahale edebilir mikroskop baz kusurlar veya lekeleri rahatsız edici etkilerinin ortadan kaldırılması avantajına sahiptir.

5. Çift İn situ Hibridizasyon

  1. Aynı anda tw ifade desenini görüntülemek içinTek bir embriyo farklı genler o iki prob farklı genlerin her biri için bir sentez. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir etiket olarak DIG-11-UTP ile bir prob sentez. Situ hibridizasyonlar için tek olarak kullanılan çok 3 kat daha fazla konsantre edilmiş sonda elde etmek için RNA, hibridizasyon tamponu içinde transkripsiyon reaksiyonu ürünü seyreltin.
    1. DIG DIG 11-UTP ile ikame edilmesi gerektiğini floresein-12-UTP dışında problanmış etiketli için izlenen aynı protokol ile ilgili diğer prob sentez. Situ hibridizasyonlar için tek olarak kullanılan çok 3 kat daha fazla konsantre edilmiş sonda elde etmek için RNA, hibridizasyon tamponu içinde transkripsiyon reaksiyonu ürünü seyreltin.
    2. 1: 1 oranında iki konsantre probları karıştırın. En iyi sonuçları elde etmek için in situ hibridizasyon protokol tek güçlü ifadesini gösterir geni için, floresein-işaretli prob kullanılır.
  2. In situ hibridizasyon protokolü aynı için tek için tarif edilen/ Em> hibridizasyonları, çift prob kullanımı dışında in situ hibridizasyon probu tek yerine ilk günün sonunda (etiketli-digoxigenin ve floresan işaretli prob 1.5x konsantre karışımı içeren prob).
    1. Anti-DIP-AP Fab fragmanları yerine 4,000 seyreltme ile 1: Anti-florosin AP Fab fragmanları hariç, in situ hibridizasyon protokolü çift ikinci gününde tek melezleştirme protokolü takip edin. Yerinde protokolünde single olarak embriyo aşırı antikor yıkayın ve BM-Mor AP substratı kullanılarak ilk renkli reaksiyonu yürütmek.
  3. İlk renk reaksiyonundan sonra, 0.1 M glisin pH MAB beş ila on dakika yıkama yapılmıştır 2.0 40 dk için floresein antikor etkisiz hale getirirler. 90 dakika için MAB + HTSS + BR embriyolar engelleyin. 1 anti-DIG antikoru ekleyin: MAB + HTSS + br 2000 seyreltme ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    1. Ertesi gün, inci embriyolar yıkayınoroughly MAB (30 dakika 12 yıkama) aşırı antikorları ayıklamak için.
    2. AP Tamponu içinde 10 dakika (tablo 1) için embriyolar yıkayın ve BCIP (AP tamponu içinde 0.5 mg / ml) ile boyanır.
      NOT: Yerinde birlikte ilk renkli reaksiyon ve ikinci (Şekil 5) için bir açık mavi renk reaksiyonu için bir koyu mavi-mor leke vermelidir.
    3. AP tampon kaldırarak nihai renk reaksiyonu durdurmak ve MAB ile üç kez yıkayın. 10 dakika boyunca Mempfa ile embriyolar Fix. MAB veya TBT 5 hızlı yıkama ile embriyolar yıkayın.
    4. O BCIP yalnız renk ortadan kaldıracak gibi bu renk kombinasyonu ile, sonrası boyama işlemlerinde metanol kullanımı, artık mümkün. % 0.02 sodyum azid ile PBS içinde boyama ve tespit sonrası embriyolar saklayın. Boyama yoğunluğu situs çift zayıf olabilir. Bu bir sorun ise, dört 2 saat süre her yıkar azaltır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku spesifik probların kullanımı belirli organların gelişim durumuna ilişkin olağanüstü bilgi verebilir. Aşağıdaki örneklerde, embriyonun sahne Nieuwkoop ve Faber evreleme masaya 11 dayanmaktadır. Bir sondalar formu farklılaşma sonra genlerin, evre 28-30 ben kalp troponin, örneğin, (Şekil 1C), farklılaşmış bir organın varlığını veya boyutunu kullanıyorsa herhangi bir aşama sonrası farklılaşma de değerlendirilebilir. Yıllar önce, embriyolog, erken embriyo 12,13 histoloji o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli genlerin ifade desen görselleştirmek için in situ hibridizasyon kullanma yeteneği Xenopus embriyo belirli organları veya hücre tiplerini belirlemek için en sık kullanılan yöntem olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni, bu teknik ile sunulan çeşitli avantajlar taşımaktadır. Bir genin ekspresyonu, bu hücrelere 18 arasında açık bir sınır önce kalp atalarda Nkx2.5 ekspresyonu için halinde de farklılaşma herhangi bir histolojik işareti önce belirli yapıları belirleyebilir. Reaktifl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek rakip mali çıkarları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Steve Deimling'in burs desteği için CIHR'ye ve Steve Deimling, Rami Halabi ve Stephanie Grover'ın desteği için Western Ontario Üniversitesi Pediatri Bölümü'ne teşekkür eder. Bu çalışma, NSERC hibe R2654A11 ve NSERC Discovery Accelerator Supplement tarafından desteklenmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Labguake Tüp ÇalkalayıcılarVWR17-08-2011
VWR ŞişeleriVWR10-07-2012
L-SisteinBioShopCYS342.500
Ribonükleozit Trifosfat Seti, 100mMRoche11277057001
Digoxigenin-11-UTPRoche11209256910
Rnaze inhibatörü (Rnase OUT)Canlandırıcı 10777-019
T7 RNAPolimeraz FermentasEPO111
T3 RNA PolimerazFermentasEPO101
SP6 RNAPolimeraz FermentasEPO131
Dnase 1İnvitrojen ve nbsp;18047-019
Koyun Serumu  Wisent31150
Bloke edici reaktifRoche11096176001
BM mor Ap SubstratRoche11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragmanlarıRoche11093274910
MetanolVWRCAMX0485-7
NaClBioShopSOD002.10
SDSEM 7910
EDTABioShopEDT001.500
TrisBioShopTRS003.5
Ara-20EM 9480
MgSO4SigmaM-2643
PaspasBioShopMOP001.250
EGTASigmaE-3889-25G
ParaformaldehitBioShopPAR070.500 
Formamid  VWR       CAFX0420-4 
RNARoche10109223001
Maleik Asit  VWR       CAMX0100-3 tri-Sodyum
SitratBioShopCIT001
Hidrojen Peroksit (% 30 Çözelti)EM ve nbsp;HX0635-2
BSA BioShopALB001.100
PVP-40ICN195451
Ficoll 400GE Sağlık17-0300-10
Benzil AlkolSigmaB-1042
Benzil BenzoatSigmaB-6630
UltraPure Agaroz Canlandırıcı 16500-500
arası

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
  2. Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
  3. Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
  4. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  5. Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
  6. Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
  7. Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
  8. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
  10. Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
  12. Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
  13. Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
  14. Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
  15. Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
  16. Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
  17. Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
  18. Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
  19. Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
  20. Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Xenopus EmbriyolarOrganogenez al masGen Ekspresyon AnaliziEmbriyo FiksasyonuProb SenteziAntikor BoyamaG r nt leme OptimizasyonuMetanol SerisiARO Arkaplan

İlgili makaleler