Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem Arabidopsis

Summary

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Abstract

Çiçekli bitkilerde, somatik-to-üreme hücresi kader geçiş yetişkin bitkinin çiçek organlarında spor anne hücrelerin şartnamede (SMC'ler) ile işaretlenir. Kadın SMC (Megaspor anne hücre, MMC) yumurta hücresi primordiumunun içinde ayırır ve mayoz uğrar. Seçilen haploid Megaspor sonra birlikte aksesuar hücreleri ile, gamet sebebiyet verecek çok hücreli dişi gametofit, yumurta hücresi ve merkez hücre oluşturmak için mitoz uğrar. Ovüldeki içindeki MMC, meiocyte ve dişi gametopitin sınırlı erişilebilirlik sitolojik için teknik olarak zor ve sitogenetik tek hücre düzeyinde analiz eder. Özel olarak, hücresel ya da nükleer epitoplar doğrudan ya da dolaylı immunodeteksiyon bitki hücresi ve tek hücre görüntüleme içindeki reaktiflerin zayıf penetrasyon ile bozulur tüm montaj dokularda optik berraklık eksikliğinden demize edilir.

Böylece, Nucl analiz etmek için etkili bir yöntem geliştirditüm montaj gömülü Arabidopsis ovüllerindeki tek bir hücrede yüksek çözünürlükte kulak organizasyon ve kromatin modifikasyonu. Bu, bir mikroskop lamı üzerine akrilamid jel ince bir tabaka olarak diseksiyon ve sabit ovüllerin gömülmesi dayanmaktadır. Gömülü ovüller immüno-boyama reaktiflere doku açıklık ve geçirgenlik iyileştirmeyi amaçlayan kimyasal ve enzimatik tedavilere tabi tutulur. Bu tedaviler hücresel ve kromatin organizasyonu, DNA ve protein epitoplar korumak. Numuneler Kromatin immüno-lekeleme, in situ hibridizasyon (FISH) floresan ve heterokromatin analiz için DNA lekeleme gibi farklı alt sitolojik analizi için kullanılabilir. 3D rekonstrüksiyon geçmez yüksek çözünürlüklü konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) görüntüleme, tek hücreli çözünürlükte nicel ölçümler sağlar.

Introduction

Çiçekli bitkilerde üreme soy kurulması SMC'lerinin farklılaşması, kadın MMC ve erkek Mikrospor anne hücre ile başlar. MMC ovül primordiumunun uzak ucunda bir alt epidermal nucellar hücreden gelişen ve mikrospor anne hücre derin çiçek organları ¹ içinde bulunan anter lokül içinde sporogenous dokusundan gelişir. SMC'ler sonra mitoz üzerine gametofitleri doğuran haploid sporlar, üretmek için mayoz tabi. Dişi gametofit veya embriyo kesesi, bir yumurta hücresinin, tek bir merkezi hücrenin, iki synergids ve üç zıtlar oluşur. Erkek gametofit veya polen, bir bitkisel hücre ve iki sperm hücrelerinin oluşmaktadır. Erkek gametofit nispeten erişilebilir nesne-....

Protocol

Prosedür, Şekil 1 'de iş akışı tarif edilmektedir, ve diseksiyon ve dokuların yerleştirilmesi için kurulum Şekil 2'de sunulmuştur.

1.. Doku Fixation

1. Buz üzerinde taze BVO sabitleyici tampon içeren bir mikrofuj tüp içinde 20-30 carpels toplayın.
2. Yumuşak, oda sıcaklığında çalkalanarak doku 30 dak.
3. 400 x g de bir tezgah üstü mikrosantrfuj 1 dakika içinde sabitleyici carpels ihtiva eden tüpler dönerler.
4. Dikkatlice sabitleyici tamponunu çıkarın ve PBT 1 ml eklemek, buz üzerinde tüpleri.

2.. Diseksiyon ve katıştırma

1. B....

Results

Bu tam montaj sitolojik boyanması için uygun olan Arabidopsis ovüller, büyük ölçekli hazırlanması ve işlenmesi için sağlam bir protokol sağlar. Gömme sayesinde, ovülller bir 3-boyutlu yapı (Şekil 3) korur. Ayrıca, optik açıklama dahil olmak üzere doku işleme yüksek çözünürlükte görüntüleme hücre içi yapıları sağlar. 4 heterokromatinin (hayır Dekonvolüsyonun bu resim için kullanılan) de göze çarpan odaklar tanımlandığı gibi parlak görünen tüm montaj tohumcuk primordiada DNA boya.......

Discussion

Çiçekli bitkilerde, dişi üreme soy nedenle teknik zorlu tüm montaj sitolojik lekelenme render nucellus ve ovül teguments dahil olmak üzere birçok hücre tabakası ile çevrilidir. Burada örneğin tam montaj in situ hibridizasyon immüno-boyama, DNA boyama ve floresan gibi sitolojik boyanması için uygun ovüller, çok sayıda hazırlanmasını ve işlenmesini sağlayan etkin bir protokol sunmaktır. Başarıyla Arabidopsis ^21,22 dişi üreme tohum çizgisi analizi için kullanılır. Birkaç farklı slaytlar boyanma.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Çözümler
BVO Fiksasyon Tamponu (32 dayalı)			2 mM EGTA, pH 7.5, %1 (h/h) formaldehit, %10 DMSO, 1x PBS, %0.1 Tween-20
PBT			1x PBS, %0.1 Tween-20
PBT-F			1x PBT, %2.5 (h/h) formaldehit
%30 akrilamid:bisakrilamid			3 g akrilamid, 0.33 g bisakrilamid, 1x PBS (10 ml hazırlayın, 4 ° C'de saklayın; C)
		200 ml %5 akrilamid karışımı	34 ml %30 akrilamid:bisakrilamid, 166 ml 1x PBS (%30 stoktan taze yapın)
%20 amonyumpersülfit			0.2 g amonyumpersülfit, 1 ml steril su (1 ml ile alikotlar hazırlayın ve -20 °C'de saklayın; C)
% 20 sodyum sülfit			0.2 g sodyum sülfit, 1 ml steril su (1 ml ile alikotlar hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; C)
Hücre duvarı enzim karışımı			% 0.5 (a / h) selülaz,% 1 (a / h) driselaz,% 0.5 (a / h) pektoliyaz
Reaktifleri ve Malzemeleri
Formaldehit	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Etanol	Schaurlau	ET00102500
Metanol	Schaurlau	ME03062500
Ksilen	ROTH	4436.1
Selülaz	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pektoliyaz	Sigma	P5936
Ara-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
akrilamid	Sigma	A-3553
bisakrilamid	Sigma	M2022	toksik
amonyumpersülfat	Sigma	A9164
Sodyum sülfit	Fluka	71988
Anti-trimetil-Histon H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti-monometil-histon H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488 ~ keçi ~ anti ~ tavşan (H + L)	Moleküler Prob	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iyodür	Sigma	P4170	toksik
DAPI	Sigma	D9542	toksik
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin kavanozu	Huber & CO	10.055
Forseps	DUMONT BİYOLOJİ
Çalkalayıcı	Heidolph	543-12310-00-0
Nemli oda			İçinde nemli kağıt havlu bulunan plastik bir kutu, slaytları desteklemek ve slaytları sudan korumak için kutuya plastik bir destek konur.
Superfrost Plus slayt	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Glä ser
BALIK Etiketi DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP güçlendirici	Chromotek