Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Özet

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Özet

Zebrafish embriyolar küçük moleküllerin büyük ölçekli tarama için güçlü bir araçtır. Floresan haberci proteinleri eksprese eden transjenik zebra balığı sıkça, gen ekspresyonunu modüle eden kimyasal tanımlamak için kullanılır. Canlı Zebrafish floresan tahlil Kimyasal ekranlar genellikle yüksek içerik tarama için pahalı, özel ekipman güveniyor. Biz, bir motorlu kaide otomatik görüntü zebra balığı embriyolar için olan standart bir epifluorışıma mikroskop kullanılarak bir prosedür tarif ve dokuya özel floresan tespit eder. GFP ekspresyonu üzerinden östrojen reseptörü aktivitesi rapor transgenik zebrafish kullanarak, bir dokuya-özgü şekilde raportör aktif östrojen reseptör ligandları taranması için bir yarı-otomatik bir prosedür geliştirilmiştir. Bu videoda, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 24-48 saat sonra döllenme (HPF) at zebra balığı embriyolar arraying ve östrojen reseptörlerine bağlanan küçük moleküller eklemek için işlemleri tarif eder. 72-96 hpf, her görüntüleri kuyudantüm plaka otomatik olarak toplanan ve el doku-spesifik floresan için denetlenmektedir. Bu protokol, ancak karaciğer, kalp valfleri reseptörlerinin aktive östrojen algılama yeteneği göstermektedir.

Giriş

Transgenik zebra balığı gibi fibroblast büyüme ^1, retinoik asit ² faktörleri ve canlı embriyolar, ^3, östrojen gibi sinyal yolaklarına aktivite doğrudan görselleştirme için izin geliştirilmiştir. Bu tür araçlar (flüoresan yoğunluğundaki değişim olarak analiz) sinyal yolları bozmakta ve kimyasal ya da dokuya özel bir şekilde, ⁴ (floresan lokalizasyonunda değişim) olarak işaret modüle maddeler için tarama sağlar. Otomatik görüntü yakalama dramatik ^5,6 kimyasal ekranların verimini artırır. Canlı Zebrafish otomatik tahlil floresan genellikle pahalı, özel ekipman güveniyor Ekranları. Sözde yüksek içerik tarama yüksek ç....

Protokol

NOT: Bu protokol Birmingham Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi de Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1.. Zebra balığı Yetiştiriciliği ve Yumurta Koleksiyonlar

1. Üç gün kimyasal maruz başlamadan önce, ayrı erkek ve kadınlar için bölücüler ile üreme tankları monte. Yetiştiricilik sistemi su ile her bir tank yarıya doldurun. Bir bölücü ayırarak her tankta 2 erkek ve 3 kadın yerleştirerek, üreme tanklarında ^c262/c262 balık: Bir ağının kullanılması, Tg (GFP 5xERE) aktarmak. Her tankın üzerinde bir kapak yerleştirin ve tarih ve çapraz olmak üzere suşları ile etiket.
2. Ertesi sa....

Sonuçlar

Şekil 1, bir 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğinden bileşik görüntüleri gösterir. Her kompozit görüntü% 5 görüntü bindirme ile 59 ayrı görüntü oluşur. Canlı Zebrafish de her biri içinde rastgele odaklı, henüz biz karaciğer kalp floresan ayırt edebiliyoruz unutmayın. Zebra balığı aydınlık görsel yönünü belirlemek ve morfolojik anormallikleri (Şekil 1 A ve 1 C) görselleştirmek için referans olarak yararlıdır. 10x objektif kullanılarak otomatik görüntüleme kimyasallar ekran ve daha yüksek.......

Tartışma

Bu protokol, zebra balığı embriyolar otomatik görüntü dokuya özel floresan için basit bir yöntem tarif edilir. Protokol, bir Zeiss Axio Observer kullanılarak geliştirilmiştir. Z1 Zen Blue 2011 yazılım ile, ancak teknik kompozit görüntüler oluşturmak için fayans gerçekleştirebilirsiniz motorlu bir sahne ve mikroskop kontrol yazılımı ile herhangi bir ters mikroskop kullanılarak adapte edilebilir. Motorlu bir sahne ile ters bir mikroskop donatılması yüksek içerik tarama için özel ekipman satın alma için pratik, daha az pah.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Plastik transfer pipetleri; geniş çaplı	Fisher	13-711-23
Plastik transfer pipetleri; ince uç	Fisher	13-711-26
96 kuyulu, yuvarlak, düz tabanlı plakalar	Fisher	21-377-203
100 x 35 mm plakalar	Fisher	08-757-100D
35 x 60 mm plakalar	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 ince forseps	Güzel Bilim Araçları	11254-20	uç boyutları 0,05 x 0,01 mm, embriyolardan koryonları manuel olarak çıkarmak için
Trikain metansülfonat	Sigma Aldrich	A5040-25G	tarif için Zebra Balığı Kitabına bakın (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-fenil 2-tiyoüre (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	20 mM stok (100x) hazırlayın ve 200 & mu'da kullanın; E3B'de M
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protokolü, motorlu kademeli bir ters floresan mikroskobu gerektirir
20x uzun çalışma mesafesi objektifi	Carl Zeiss		0,4 NA ve 8,4 mm çalışma mesafesine sahip bir objektif kullanıyoruz
Axiocam HRm dijital kamera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 mikroskop kontrol yazılımı	Carl Zeiss		Protokol, motorlu bir sahne Metilen Mavisi Sigma Aldrich MB-1 kullanarak döşenmiş görüntülerin yakalanmasını sağlamak için mikroskopi otomasyonu ve kontrol yazılımı gerektirir
		; 25 gram	, E3B (aşağıda)
			ÇÖZÜM: NaCl ve nbsp;                                     - 17.2 gram KCl                                            - 0.76 gram CaCl2-2H<>sub2O        - 2.9 gram < br / > MgSO4< / sub>-7H2< / sub>O  - 4.9 gram veya MgSO4< / sub> - 2.39 gram < br / > 1 litre Milli-Q suda çözülür; Steril 1 litrelik şişede saklayın. ZEBRA BALIĞI IÇIN 1X E3B ÇÖZÜMÜ: 60X E3          150 ml %2 metilen mavisi        100 ve mu; l  Milli-Q su ile 9 litreye getirin & nbsp;

E3B 60X E3'te kullanım için RO suyunda% 2'lik çözelti oluşturur